CN108782239A

CN108782239A - 一种银杏脱毒组织培养方法

Info

Publication number: CN108782239A
Application number: CN201810456115.XA
Authority: CN
Inventors: 金红梅; 李亚
Original assignee: Shandong Tissue Culture Agriculture Development Co Ltd
Current assignee: Shandong Tissue Culture Agriculture Development Co Ltd
Priority date: 2018-05-14
Filing date: 2018-05-14
Publication date: 2018-11-13

Abstract

本发明公开了一种银杏脱毒组织培养方法，包括如下步骤：（1）选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；（2）催芽：将选取好的银杏枝条进行催芽；（3）表面处理；（4）消毒；（5）切割；（6）初代培养；（7）增殖继代：将无菌苗将其接种到相应培养基上进行增殖继代培养；（8）生根培养；（9）驯化炼苗。本发明的有益效果是：银杏通过组织培养，可以起到脱毒、快繁、种质资源保存、品质改良的作用，大幅度提高了银杏质量和品质；确定了组织培养中控制分化、继代生长、生根等的培养基成分，研究确定了生长调节物质的种类、浓度以及培养条件的最佳优化选择，攻克了银杏组织培养过程中的技术壁垒，达到很好的培养效果。

Description

一种银杏脱毒组织培养方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说涉及一种银杏脱毒组织培养方法。

背景技术

银杏又名白果、公孙树、鸭脚子、鸭掌树，是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，为我国独存的珍稀名贵树种，也是目前世界上珍稀裸子植物之一，现仅存一科一属一种，素有裸子植物“活化石”之称，在植物学上具有重要的科学价值。我国是银杏的故乡，大面积种植区有山东、江苏、安徽南部、浙江、江西北部、河南、湖南、湖北、广西、四川。

银杏兼有材用、果用、药用、观赏于一体的特点，其材质优良、不翘不裂、宜加工，为雕刻、建筑、家具、装演等高级用材。种核富含营养，是著名的高档营养保健食品、药品，为我国大宗出口树生果仁干果之一。银杏叶内主要含有黄酮类和银杏内酯类等药用成分，黄酮类化合物具有抗衰老、提高免疫机能、防治心血管疾病的作用，银杏内酯是银杏特有的带有特丁基的二菇内酯类化合物，是治疗气管炎、哮喘、内毒素休克、器官免疫排斥反应等多种炎症疾病的新型治疗剂，被国际医药部门列为新一代重要药用资源。银杏寿命长达多年，树姿挺拔、秀丽，叶形似鸭脚,现己广泛应用于园林和盆景业中。综上，银杏在诸多领域的开发利用，对银杏的繁殖和育种提出了新的要求。

银杏是雌雄异株植物，实生苗定植后一般需要才能开花结果，分出雌雄，银杏常规育种时间长，效率低。开展银杏组织培养和遗传转化，进行银杏分子育种有重要的理论和现实意义。银杏组织培养的研究始于世纪年代，主要以银杏配子体、原生质体、胚成熟与未成熟和营养器官为材料，对胚胎学、形态发生及培养条件等进行了研究探索。

陕西农业大学，温银元在其硕士学位论文中，以银杏优良品种“佛手”为材料，在离体条件下研究不同种类、不同浓度的激素对胚离体培养、愈伤组织的诱导与分化以及腋芽的萌发与生长的影响；用赤霉素和乙烯利调控试管苗的性别分化,通过同工酶和含量对银杏的雌雄进行早期鉴别,满足市场对雌性或雄性植株的需求，为银杏的定向育种提供理论依据和实践指导。文中将重点放在雌雄性的定向育种上，在组织培养基的选择和培养条件的选择和优化方面有待提高。

中国专利CN07047319A 一种银杏的组织培养方法及生根培养基以琼脂、蔗糖、培养基母液、6-苄氨基嘌呤溶液和萘乙酸溶液，以及银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭为原料，制备生根培养基；以银杏侧芽带叶茎尖为外植体，将消毒处理后的外植体接种到生根培养基中，置于500~10000Lux光照、20~25℃环境下培养。本申请技术方案虽然直接诱导生根，缩短育苗周期；能够最大限度的保持亲本的优良性状在生根培养基中加入银杏树枝活性炭或银杏果壳活性炭，能够改善组织培养苗的褐化现象，同时还有抑菌和促进生长的作用，但是在组织培养过程中只采用一种培养基，不能满足银杏外植体初代和增殖培养的需求。

用银杏进行组织培养研究也有一些报道，但是存在生产成本高，初代接种污染率高，试管苗玻璃化，分化能力自衰和成活率低等问题。

发明内容

本发明的目的是为克服上述银杏组织培养的缺陷，对银杏的脱毒组织培养方法进行系统的研究，经过大量实验，得到一种操作简便、提高银杏产量与品质的培养方法。

为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：

一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

(1)选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；

(2)催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；

(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗10~15min，采用流水冲洗干净；

(4)消毒：采用75%酒精消毒、0.1%HgCl溶液消毒1~5min，无菌水冲洗干净；

(5)切割：将消毒好的银杏小段切口进行更新处理，去掉叶片，保留生长点；

(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照14~18h、光照强度为5000~7000Lux、培养45~65d；

(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照16~20h、光照强度为6000~8000Lux、培养25~35d；重复上述增殖过程；

(8)生根：选取长势健壮的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照10~14h、光照强度为6000~10000Lux的环境中，培养20~35d；

(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；

其中：培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.1~0.5mg/LNAA、0.1~1.0mg/LKT、0. 1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；

培养基Ⅱ为B5培养基中添加0.1~2.0mg/LKT、0.1~1.0mg/LTDZ、0.1~2.0mg/LIBA、0. 1~1.0mg/L活性炭、25~35g/L蔗糖和3~6g/L琼脂；

培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.1~1.0mg/LIBA、0.1~2.0mg/LGA3。

作为优化的，一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为5000~7000Lux、培养50~60d；

(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照18h、光照强度为7000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；

(8)生根：选取长势健壮的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为7000~9000Lux的环境中，培养25~30d；

作为优化的，培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.2mg/LNAA、0.5mg/LKT、0. 5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

作为优化的，培养基Ⅱ为B5培养基中添加1.0mg/LKT、0.5mg/LTDZ、1.0mg/LIBA、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

作为优化的，培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.5mg/LIBA、1.0mg/LGA3。

作为优化的，所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。

作为优化的，所述步骤(4)中酒精消毒时间小于1min。

作为优化的，所述步骤（9）中驯化炼苗环节阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000~5000Lux。

作为优化的，所述步骤（9）中驯化炼苗步骤，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时。

B5培养基是1968年由Gamborg等人设计的，由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等五类物质组成。

活性炭：可以降低组织培养物的有害代谢浓度，对细胞生长有利。活性炭为木炭粉碎经加工形成的粉末结构，它结构疏松，孔隙大，吸水能力强，有很强的吸附作用，它的颗粒大小决定着吸附能力，粒度越小其吸附能力越大。它可以吸附非极性物质和色素等大分子物质，包括琼脂中所含的杂质，培养物分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糖醛及激素等。

萘乙酸(NAA)：是促进植物根系生长的植物生长调节剂，也是萘乙酰胺的中间体。萘乙酸用作植物生长调节剂，具有促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根，增加坐果，防止落果等，可随营养流输导到作用部位。

吲哚丁酸（IBA）：植物生长调节剂，用于细胞分裂和细胞增生，促进草本和木本植物的根的分生。

6-糠氨基嘌呤(KT)：是一种非天然的细胞分裂素,促进细胞分化、分裂、生长；诱导愈伤组织长芽；解除顶端优势；促进种子发芽、打破侧芽的休眠；延缓叶片衰老及植株的早衰；调节营养物质的运输；促进结实；诱导花芽分化；调节叶片气孔张开等。

赤霉素（GA3）：植物生长调节剂，主要用于促进作物的生长发育，提早成熟，提高产量和打破种子、块茎、鳞茎等器官的休眠，促进发芽、分蘖、抽苔，提高果实结果率，赤霉素GA3的生理作用主要有：扩大叶面积，加快幼枝生长，有利于代谢产物在韧皮部内积累，活化形成层；抑制成熟和衰老，控制侧芽休眠及块茎的形成。

琼脂：琼脂的最有用特性是它的凝点和熔点之间的温度相差很大。它在水中需加热至95℃时才开始熔化，熔化后的溶液温度需降到40℃时才开始凝固，所以它是配制固体培养基的最好凝固剂。用琼脂配制的固体培养基，可用以进行高温培养而不熔化，在凝固之前接种时，也不致将培养物烫死。因此，琼脂是制备各种生物培养基中应用最广泛的一种凝固剂。

蔗糖：蔗糖除供能之外，还能诱导愈伤组织组织的再分化；培养基高温灭菌时，蔗糖更稳定且不容易碳化；植物细胞中含有蔗糖转化酶，蔗糖能更好地维持培养基内的低渗环境，蔗糖形成的渗透压可较长时间地保持相对稳定，可在一定程度上减少微生物的污染。

本发明的有益效果是：

1.银杏通过组织培养，可以起到脱毒、快繁、种质资源保存、品质改良的作用，大幅度提高了银杏质量和品质，扩大了银杏的种植规模。

2．确定了组织培养中控制分化、继代生长、生根等的培养基成分，研究确定了生长调节物质的种类、浓度以及培养条件的最佳优化选择，攻克了银杏组织培养过程中的技术壁垒，达到很好的培养效果。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，除非特别说明，比例和百分比基于重量。

本发明实施例所用原料均为市售，所述实施例中培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。

实施例1，一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗10min，采用流水冲洗干净；

(4)消毒：采用75%酒精消毒(消毒时间45s)、0.1%HgCl溶液消毒3min，无菌水冲洗干净；

(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照18h、光照强度为5000Lux、培养55d；培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.5mg/LNAA、0.1mg/LKT、0.5mg/L活性炭、35g/L蔗糖和3g/L琼脂；

(7)增殖继代：选取步骤(6)中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照20h、光照强度为6000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为B5培养基中添加1.0mg/LKT、1.0mg/LTDZ、0.1mg/LIBA、0.5mg/L活性炭、35g/L蔗糖和3g/L琼脂；

(8)生根：选取长势健壮的株高6~10cm的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照14h、光照强度为6000Lux的环境中，培养25d；培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.5mg/LIBA、2.0mg/LGA3；得到株高6~10cm，根系发达的银杏无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。

(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达，株高6~10cm的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为5000Lux。

经过此银杏脱毒组织培养方法得到的银杏苗成活率在99%以上，银杏产量和品质都有大幅度的提高。

实施例2 一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗15min，采用流水冲洗干净；

(4)消毒：采用75%酒精消毒(消毒时间55s)、0.1%HgCl溶液消毒1min，无菌水冲洗干净；

(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为7000Lux、培养45d；培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.1mg/LNAA、0.5mg/LKT、1.0mg/L活性炭、25g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

(7)增殖继代：选取步骤(6)中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照18h、光照强度为8000Lux、培养25d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为B5培养基中添加2.0mg/LKT、0.1mg/LTDZ、1.0mg/LIBA、1.0mg/L活性炭、25g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

(8)生根：选取长势健壮的株高6~10cm的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为10000Lux的环境中，培养20d；培养基Ⅲ为B5培养基中添加1.0mg/LIBA、0.1mg/LGA3；得到株高6~10cm，根系发达的银杏无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。

(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达，株高6~10cm的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为4000Lux。

实施例3一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

(3)表面处理：将收集好的外植体采用流水冲洗干净，用0.5%吐温-80清洗13min，采用流水冲洗干净；

(4)消毒：采用75%酒精消毒(消毒时间30s)、0.1%HgCl溶液消毒5min，无菌水冲洗干净；

(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照14h、光照强度为6000Lux、培养65d；培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.2mg/LNAA、1.0mg/LKT、0.1mg/L活性炭、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；

(7)增殖继代：选取步骤(6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为7000Lux、培养35d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为B5培养基中添加0.1mg/LKT、0.5mg/LTDZ、2.0mg/LIBA、0. 1mg/L活性炭、30g/L蔗糖和6g/L琼脂；

(8)生根：选取长势健壮的株高6~10cm的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照10h、光照强度为8000Lux的环境中，培养35d；培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.1mg/LIBA、1.0mg/LGA3；得到株高6~10cm，根系发达的银杏无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。

(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达，株高6~10cm的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000Lux。

实施例4 一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

(4)消毒：采用75%酒精消毒（消毒时间45s）、0.1%HgCl溶液消毒1~5min，无菌水冲洗干净；

(6)初代培养：将处理好的银杏小段接种至培养基Ⅰ上，放置于温度25~28℃、每天光照16h、光照强度为6000Lux、培养55d；培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.2mg/LNAA、0.5mg/LKT、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

(7)增殖继代：选取步骤（6）中得到的无菌苗将其接种到培养基Ⅱ上进行增殖培养，培养条件为：温度25~28℃、每天光照18h、光照强度为7000Lux、培养30d；重复上述增殖过程；培养基Ⅱ为B5培养基中添加1.0mg/LKT、0.5mg/LTDZ、1.0mg/LIBA、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂；

(8)生根：选取长势健壮的株高6~10cm的银杏苗，将其接种至培养基Ⅲ中，放置于温度25~26℃、每天光照12h、光照强度为8000Lux的环境中，培养28d；培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.5mg/LIBA、1.0mg/LGA3；得到株高6~10cm，根系发达的银杏无菌苗，根的条数为7~8条，长度为10~20min，方便附着在基质土中，避免伤根。

(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达，株高6~10cm的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中；阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000~5000Lux。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种银杏脱毒组织培养方法，包括：

培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.1~1.0mg/LIBA、0.1~2.0mg/LGA3。

2.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：包括：

（1）选材：整枝选取1~2年生芽饱满、无腐无病害、健壮银杏枝条；

（2）催芽：将选取好的银杏枝条置于光照室内，维持温度28℃，光照强度5000Lux，光照时间24h，照射7d，选取银杏嫩芽为外植体；

(9)驯化炼苗：将步骤(8)得到的根系发达的银杏苗转移到小温棚中进行驯化，遮荫，保持小温棚中温度为20~28℃，湿度控制在85~99%，7d后湿度递减至80%，此后逐步递减，15d后将银杏苗从组织培养基中去除，将根部的培养基清洗干净，种植到基质土中。

3.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：培养基Ⅰ为B5培养基中添加0.2mg/LNAA、0.5mg/LKT、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂。

4.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：培养基Ⅱ为B5培养基中添加1.0mg/LKT、0.5mg/LTDZ、1.0mg/LIBA、0.5mg/L活性炭、30g/L蔗糖和4.5g/L琼脂。

5.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：培养基Ⅲ为B5培养基中添加0.5mg/LIBA、1.0mg/LGA3。

6.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：所述培养基Ⅰ、培养基Ⅱ和培养基Ⅱ的pH均被调节至5.8。

7.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：所述步骤(4)中酒精消毒时间小于1min。

8.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：所述步骤（9）中驯化炼苗环节阴天条件下进行人工补光，补光强度为3000~5000Lux。

9.根据权利要求1所述的一种银杏脱毒组织培养方法，其特征在于：所述步骤（9）中驯化炼苗步骤，转移至小温棚10~15天后每天傍晚或清晨通风半小时。