CN112690216A - 一种银杏高效快速组培繁殖方法 - Google Patents

Abstract

一种银杏高效快速组培繁殖方法，属于植物培养技术领域。其主要包含以下步骤：1）制备银杏组织无菌材料；2）胚培养；3）不定芽增殖培养；4）生根培养；5）炼苗和移栽。本发明的有益之处是：采用本发明所提供的银杏快速组培繁殖方法，具有增殖周期短，繁殖系数高和移栽成活率高的特性，可缩减银杏组培繁育环节，保持植株优异性状，节约时间成本，且通过此法获得的植株，根系及茎秆粗壮，新梢长势好，移栽后的成活率高达92%。

Description

一种银杏高效快速组培繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说涉及一种银杏高效快速组培繁殖方法。

背景技术

银杏（Ginkgo biloba L.）是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，为我国独存的叶果材兼优的珍稀名贵树种，现仅存一科一属一种，素有裸子植物“活化石”之称。我国拥有世界银杏资源的90%以上，大面积种植区包含山东、河南、江苏、浙江、安徽南部、江西北部、湖南、湖北、广西、四川等地。银杏被广泛应用于园林景观绿化及城市行道树中，具有较高的经济、生态及文化价值。

银杏为雌雄异株植物，实生苗开花结果时间较长，常规育种效率低、周期长。利用植物组织培养技术开展银杏优良品种的繁育，是苗木生产过程中最行之有效的技术之一。银杏组织培养研究主要以配子体、原生质体、成熟与未成熟胚以及营养器官为材料，探究不同种类及浓度的激素对形态发生与分化的影响，但其存在着污染率高，生产成本高及成活率低的突出问题。

发明内容

本发明旨在降低污染率的同时提升存活率，同时实现短期内获得批量一致稳定性状的优良繁育材料。本发明采用了以下技术方案：

第一步：制备银杏组织无菌材料。具体为：选取银杏种子作为培养材料，将种子浸入含有洗衣粉的水溶液中清洗种子表面，把种子放入容器中置于流动水下流动冲洗，而后用多菌灵溶液浸泡，用蒸馏水冲洗种子并放无菌环境内，采用酒精浸泡后，使用无菌水冲洗后再放入次氯酸钠溶液中浸泡一定时间，无菌水冲洗后，去除种子表面水分。

具体的为选取表面干燥平整、圆润饱满的银杏种子，浸入含有10%洗衣粉的水中清洗种子表面5~10 min，随后把种子放入1L玻璃烧杯中，置于自来水下流动冲洗30~40 min，采用800~1000倍的多菌灵溶液浸泡30 ~40 min，蒸馏水冲洗5~10次，超净工作台内用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗后放入15%次氯酸钠溶液（每升量中加入3滴吐温80）中浸泡3~7min，无菌水冲洗5次，无菌纸吸干种子表面水分。

第二步：胚培养，对第一步获得的培养材料在无菌环境内破壳，取出内部完整的银杏胚，后将银杏胚接种于改良1/2MS培养基（去除肌醇）上进行培养。

优选的培养条件为：在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16h/d下培养14 d。

具体的：

首先，对灭菌后的种子材料进行种皮破壳处理，利用无菌破壳器具将种子夹碎，取出银杏种子中的完整胚。

再次，将银杏胚接种于改良1/2MS培养基（去除肌醇）上进行培养；

胚培养过程中的光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养14 d。

第三步：不定芽增殖培养，从第二步获得的幼苗选取生长健壮的幼苗茎段为材料，在无菌条件下将其切至1.5 ~3.0 cm长度，接种到改良WPM培养基（去除肌醇），每升培养基中加入10 mg谷氨酰肽，5 mg甘氨酸，20 mg腺嘌呤硫酸盐，添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+0.02 mg/L TDA激素组合，琼脂用量为6.5 g/L，蔗糖为30 g/L，pH调至5.5~6.0。先进行暗培养15 d，再转为光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养20 d。

第四步：生根培养，无菌条件下选取诱导良好的不定芽，切下茎长1.0~2.0 cm的不定芽，接种在生根培养基上，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养30 d。

优选的，生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加0.5 mg/L IBA，0.05 mg/L NAA，6.5 g/L琼脂和25 g/L蔗糖，pH为5.8。

第五步：炼苗和移栽，将生根银杏幼苗的组培瓶盖子打开，开口处于三分之一大小状态，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3 d，取出幼苗用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（按照3:2:1比例）构成的混合基质，置于营养钵（12*10 cm）内培养。

本发明的有益效果是：

在15%次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80，吐温80是一种非离子型表面活性剂，可以使次氯酸钠消毒更加彻底。

秋季十月中旬选取树龄超过30年的银杏，选取经过生理后熟的优质种子，内部生长的胚长度可达到0.5~1.0 cm，内生菌含量较少，能够降低污染率，且维持较高的萌发率。

利用破壳器具将银杏种皮夹碎，取出内部完整的胚，保证胚的两片子叶完好，子叶作为营养贮存体，能够在胚的培养过程中提供部分营养。

幼苗长出后选取生长健壮的茎段，切至长度1.5~3.0cm左右，接种到不定芽增殖的改良WPM培养基上，去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。

切取茎长1.0~2.0 cm的不定芽进行生根培养，采用1/2MS为基本培养基，由于培养基中的一些无机盐成分不利于根的形成，要通过适量降低无机盐的浓度来促进根的分化，因此大量元素要降到1/2左右。生根过程中降低蔗糖用量是为了刺激生根加强其自养能力。

银杏幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（3:2:1）构成的混合基质，其土壤营养，含水量及通透性都有保障，移栽成活率大大提高。

本发明利用银杏胚作为外植体，出苗后选取茎段进行不定芽的诱导与增殖，在获得大量不定芽的前提下进行生根培养，能够最大限度的保持亲本的优良性状，同时缩短了繁育周期，获得高效及快速的繁殖方法。整个方案操作简便，污染率低，成活率高，培养周期短。

附图说明

图1银杏种子中挑取出的成熟胚

图2银杏胚诱导形成幼苗

图3幼苗茎段诱导形成不定芽

图4不定芽诱导生根。

具体实施方式

使用本申请提供的方法培育一批银杏，具体的步骤如下：

实施例1

制备银杏组织无菌材料：选取表面干燥平整、圆润饱满的银杏种子，浸入含有10%洗衣粉的水中清洗种子表面5 min，随后把种子放入1L玻璃烧杯中，置于自来水下流动冲洗30 min，分别采用800~1000倍的多菌灵溶液浸泡30 min。蒸馏水冲洗5次，超净工作台内用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗后放入15%次氯酸钠溶液（每升量中加入3滴吐温80）中浸泡3、4、5、6、7min（共5种不同处理时间），无菌水冲洗5次，无菌纸吸干种子表面水分。

银杏种子收集在秋季十月中旬，主要选取树龄超过30年的银杏树种子，并挑选经过生理后熟的优质种子。

实施例2

胚培养：超净台内利用灭菌过的破壳器具将种皮夹碎，取出种子内部完整的胚。将银杏胚分别接种于改良1/2MS（去除肌醇）、改良MS（去除肌醇）、改良1/2WPM（去除肌醇）和改良WPM（去除肌醇）四种培养基上进行培养。

实验设置三次重复，每种培养基下接种60瓶（每一重复接种20瓶），每瓶里面放入3个完整的胚。在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16 h/d下培养14d。

实施例3

不定芽增殖培养：银杏胚培养获得幼苗后，从中选取生长健壮的幼苗，切取茎段部分，无菌条件下将其切至1.5~3.0 cm长度，分别接种到改良1/2MS（去除肌醇）、改良MS（去除肌醇）、改良1/2WPM（去除肌醇）和改良WPM（去除肌醇）四种培养基上。每升培养基中加入10mg谷氨酰肽，5 mg甘氨酸，20 mg腺嘌呤硫酸盐，添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.02mg/L TDA激素组合，琼脂用量为6.5 g/L，蔗糖为30 g/L，pH调至5.8。

实验设置三次重复，每种培养基下接种60瓶（每一重复接种20瓶），每瓶里面放入1个茎段。先进行暗培养15 d，再转为光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养20 d。

实施例4

生根培养：无菌条件下选取诱导良好的不定芽，切下茎长1.0~2.0 cm的不定芽，接种在生根培养基上。生根共设置1/2MS、MS、1/2WPM和WPM四种基本培养基，分别添加0.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA，琼脂用量6.5 g/L，蔗糖用量降至25 g/L，pH为5.8。

实验设置三次重复，每种培养基下接种60瓶（每一重复接种20瓶），每瓶里面放入1个不定芽。在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养30d。

实施例5

炼苗和移栽：将生根良好的内含银杏植株的组培瓶盖子打开，开启程度达到三分之一大小的开度，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3 d。取出幼苗，用自来水洗净根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（按照3:2:1比例）构成的混合基质，置于营养钵（12*10 cm）内培养。20 d后测定得出其移栽成活率可达92%。

以上实施例1所对应的实验结果如下：

以上实施例2所对应的实验结果如下：

以上实施例3所对应的实验结果如下：

以上实施例4所对应的实验结果如下：

以上实施例5所对应的实验结果如下：

生根培养基	炼苗成活率（%）	移栽成活率（%）
			1/2MS	96.5 ± 4.2	92.4 ± 3.1

由实施例1-5的实验结果可以看出：

在15%次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80，吐温80是一种非离子型表面活性剂，可以使次氯酸钠消毒更加彻底，处理时长为7min时其最终的污染率为12.5%。

秋季十月中旬选取树龄超过30年的银杏，选取经过生理后熟的优质种子，内部生长的胚长度可达到0.5~1.0 cm，内生菌含量较少，能够降低污染率，且维持较高的萌发率。

利用破壳器具将银杏种皮夹碎，取出内部完整的胚，保证胚的两片子叶完好，子叶作为营养贮存体，能够在胚的培养过程中提供部分营养。

幼苗长出后选取生长健壮的茎段，切至长度1.5~3.0 cm，接种到不定芽增殖的改良WPM培养基上，去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。

切取茎长1.0~2.0 cm的不定芽进行生根培养，采用1/2MS为基本培养基，由于培养基中的一些无机盐成分不利于根的形成，要通过适量降低无机盐的浓度来促进根的分化，因此大量元素要降到1/2左右。生根过程中降低蔗糖用量是为了刺激生根加强其自养能力。

银杏幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（3:2:1）构成的混合基质，其土壤营养，含水量及通透性都有保障，移栽成活率大大提高。

本发明提供的银杏高效快速组培繁殖方法，其从银杏胚的培养到移栽至混合基质，整个培养周期最短为85 d，移栽成活率达到92%。

Claims (10)

1.一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步：制备银杏组织无菌材料；第二步：胚培养；第三步：不定芽增殖培养；第四步：生根培养；第五步：炼苗和移栽。

2.根据权利要求1所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述第一步中的制备银杏组织无菌材料，首先选取银杏种子作为培养材料，将种子浸入含有洗衣粉的水溶液中一定时间，清洗种子表面后把种子放入容器中置于流动水下流动冲洗，而后用多菌灵溶液浸泡，用蒸馏水冲洗种子并放入无菌环境内，采用酒精浸泡后，使用无菌水冲洗后再放入次氯酸钠溶液中浸泡一定时间，无菌水冲洗后，去除种子表面水分。

3.根据权利要求1所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述第二步中的胚培养为对第一步获得的培养材料在无菌环境内破壳，取出内部完整的银杏胚，并接种于改良1/2MS培养基上进行培养，获得幼苗。

4.根据权利要求3所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述的改良1/2MS培养基为去除肌醇的1/2MS培养基。

5.根据权利要求1所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述第三步的不定芽增殖培养为从第二步获得的幼苗选取生长健壮的幼苗茎段为材料，在无菌条件下将茎段切至1.5 ~3.0cm长度，接种到改良WPM培养基，并先进行暗培养，再转为光照培养，获得不定芽。

6.根据权利要求5所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述的改良WPM培养基为去除肌醇的WPM培养基，并每升培养基中加入10 mg谷氨酰肽，5 mg甘氨酸，20mg腺嘌呤硫酸盐，添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.02 mg/L TDA激素组合，琼脂用量为6.5 g/L，蔗糖为30 g/L，pH调至5.5~6.0。

7.根据权利要求1所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述第四步的生根培养为将第三步获得的不定芽切下，转入生根培养基进行生根培养。

8.根据权利要求7所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述所述不定芽切下的茎长为1.0~2.0 cm。

9.根据权利要求7所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述的生根培养基组分为1/2MS基础培养基，再加入0.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA+6.5 g/L琼脂+25 g/L蔗糖，pH调整为5.5~6.0。

10.根据权利要求7所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述的第五步为将第四步中生根良好的内含银杏植株的组培瓶盖子打开部分，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3d，取出幼苗，用自来水洗净根部残留的培养基，移栽至混合基质，置于营养钵内培养。

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