CN113924841B - 一种丽江杓兰种子非共生萌发方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于种子萌发技术领域，具体公开一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，包括以下步骤：于野外对盛花期的丽江杓兰进行人工异花授粉；采集野外人工授粉100d后成熟未裂开的果荚作为萌发材料，并放入装有氧化铝干燥剂的密封罐中置于0℃的冰箱中低温处理30天；对低温处理且未裂开的果荚进行消毒处理，消毒处理后，用灭菌手术刀将果荚横切成两段，即可获得丽江杓兰无菌种子；用无菌镊子夹着切开的一段果荚，将种子抖落到非共生萌发培养基中；于摇床上进行液体悬浮培养，本发明获得丽江杓兰种子非共生萌发方法，可支撑丽江杓兰种子大量萌发成苗，为丽江杓兰的回归、种群复壮及产业化开发利用奠定基础，可减缓丽江杓兰的濒危状况。
Description
技术领域
本发明属于种子萌发技术领域，具体涉及一种丽江杓兰种子非共生萌发方法。
背景技术
丽江杓兰(Cypripedium lichiangense S.C.Chen&Cribb)为中国特有植物，主要分布于云南西北部的丽江、香格里拉、维西、贡山、泸水、云龙、剑川、昆明，四川木里、盐源、会东，贵州盘县等地，生长于海拔2400-3900米的高山松林缘或是针阔混交落叶林、杜鹃灌丛林下。丽江杓兰花色鲜艳、花形奇特，具有很高的观赏和经济价值。丽江杓兰被《中国生物多样性红色名录-高等植物卷》评估为极危等级(CR)。野生状态下活体现存种群数量非常少，且逐年衰退，对丽江杓兰的保育工作刻不容缓。
丽江杓兰对生境选择较为苛刻，迁地保护风险颇大，宜就地加强保护。采用人工繁育的办法、引种回归、增强种群数量是必要的、有效的保护措施。兰科植物的繁殖除了分株外，种子非共生萌发是繁殖种苗的有效途径。丽江杓兰种子无胚乳、两层种皮紧紧的包裹着胚，有休眠效应，种子萌发极其困难，非共生萌发过程中不同的培养基及添加物对兰花种子萌发有不同的影响。通过大量的文献查阅发现，丽江杓兰种子非共生萌发方法的研究未见有文献报道。丽江杓兰种子非共生萌发方法的研究，有望解决丽江杓兰种子萌发难、成苗难的问题，为丽江杓兰的保育及产业化开发利用奠定基础。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，以解决丽江杓兰的繁殖问题。
为实现以上目的，本发明提供以下技术方案：
一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，包括将丽江杓兰种子置于培养基中进行悬浮培养，所述培养基包括以下成分：花宝1号基础培养基，添加30g/L蔗糖、15g/L椰子粉、1mg/L6-苄氨基腺嘌呤、1mg/L甘氨酸、1mg/L尼克酸、1g/L蛋白胨、0.5mg/L维生素B6、0.1mg/L维生素B1，其余为蒸馏水，然后用氢氧化钠溶液或盐酸调节培养基pH至5.6。
具体的，一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，包括以下步骤：
(1)于野外对盛花期的丽江杓兰进行人工异花授粉；
(2)采集野外人工授粉100d后成熟未裂开的果荚作为萌发材料，并放入装有氧化铝干燥剂的密封罐中置于0℃的冰箱中低温处理30天；
(3)对低温处理且未裂开的果荚进行消毒处理，消毒处理后，用灭菌手术刀将果荚横切成两段，即可获得丽江杓兰无菌种子；
(4)用无菌镊子夹着切开的一段果荚，将种子抖落到非共生萌发培养基中；
(5)将播种好的培养瓶置于摇床上进行液体悬浮培养，培养条件为温度：25±2℃，转速：100r/min，先无光暗培养30d，然后再开灯进行光照培养，光照时间为12h/d，光照强度为800Lx；
进一步地，所述步骤(3)中的消毒方法为：将低温处理且未裂开的果荚用毛刷蘸取洗涤液进行清洗，后用大量自来水冲洗，在无菌操作台上，用大量灭菌蒸馏水冲洗果荚，用酒精擦拭果荚表面，等表面酒精挥干后将果荚置于10％的次氯酸钠溶液中浸泡消毒15分钟，消毒后用大量灭菌蒸馏水冲洗，后用无菌滤纸吸干果荚表面水分，继续下部操作。
通过本发明获得丽江杓兰种子非共生萌发方法及培养基配方，可支撑丽江杓兰种子大量萌发成苗，为丽江杓兰的回归、种群复壮奠定基础，进而减缓丽江杓兰的濒危状况。丽江杓兰花朵和斑叶均具非常高的观赏价值，大量无菌苗的繁育，能为丽江杓兰产业化开发利用奠定基础。
附图说明
图1丽江杓兰种子萌发并长出长根及芽显示图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行进一步的说明。应该理解，这些实施例仅用于说明目的，而不用于限制本发明范围。
实施例1
1.丽江杓兰人工授粉
选取丽江玉龙雪山白水河居群盛花期的丽江杓兰进行人工异花授粉，记录授粉时间，观察种子外部形态特征。
2.丽江杓兰果荚及种子采集
采集野外人工授粉100d后成熟未裂开的果荚作为丽江杓兰种子非共生萌发的材料，采集好的果荚放入装有氧化铝干燥剂的密封罐中置于0℃的冰箱中低温处理30天。
3.丽江杓兰果荚无菌处理
将低温处理且未裂开的果荚用毛刷蘸取洗涤液进行清洗，后用大量自来水冲洗。在无菌操作台上，用大量灭菌蒸馏水冲洗果荚，用酒精擦拭果荚表面，等表面酒精挥干后将果荚置于10％的次氯酸钠溶液中浸泡消毒15分钟。消毒后用大量灭菌蒸馏水冲洗，后用无菌滤纸吸干果荚表面水分，用灭菌手术刀将果荚横切成两段，即可获得丽江杓兰无菌种子。
4.丽江杓兰种子的活力测定(TTC染色法)
用无菌镊子夹着切开的一段果荚，将种子抖落到无菌离心管中，加入无菌蒸馏水和表面活性剂浸种24h。种子沉底，用移液枪吸出上层液体，加入预先配置好的用于TTC溶液(将2,3,5-氯化三苯基四氮唑用酒精溶解并用无菌水稀释配制成1％的质量浓度)，室温下避光染色24h。用移液枪吸出染液，无菌水漂洗3次，再加入适量无菌水，在电子显微镜下观察种子染色情况，以种子被染成红色为准，统计种子活力。
5.非共生萌发培养基配方
非共生萌发培养基配方：2g/L花宝1号基础培养基，添加30g/L蔗糖、15g/L椰子粉、1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、1mg/L甘氨酸、1mg/L尼克酸、1g/L蛋白胨、0.5mg/L维生素B6及0.1mg/L维生素B1，使用蒸馏水溶解后，用氢氧化钠溶液和盐酸调节培养基pH至5.6。
将非共生萌发培养基按照上述配方配制好后，在100ml锥形瓶中装入20ml液体培养基并进行灭菌处理(灭菌锅中121℃灭菌20min)，自然冷却后用于丽江杓兰种子播种。
6.丽江杓兰种子播种
用无菌镊子夹着切开的另一段果荚，将种子抖落到非共生萌发培养基中，每瓶约50粒种子，每个果荚重复三次，共进行三个果荚种子的萌发培养。
7.丽江杓兰非共生萌发
将播种好的培养瓶置于摇床上进行液体悬浮培养，培养条件为温度：25±2℃，转速：100r/min。先无光暗培养30d，然后再开灯进行光照培养，光照时间为12h/d，光照强度为800Lx。
8.丽江杓兰种子的活力测定结果
在电子显微镜中观察三个视野，计算平均着色率，着色率＝着色中子数/观察视野种子总数*100％，人工授粉后100d丽江杓兰种子着色率为38.62±0.86％。
9.丽江杓兰种子非共生萌发结果
以种子膨胀胚突破种皮统计丽江杓兰种子的萌发时间为55±0.64d，以种子萌发到第三阶段(第一阶段：种皮破裂；第二阶段：根出现；第三阶段：芽和根出现)来统计总的种子平均萌发率为56.5±2.81％。在该液体悬浮培养及液体培养基中，丽江杓兰种子能萌发，先长出长长的根，再萌出芽。
对比例1
其他步骤均与实施例1相同，探索不同培养基条件下萌发情况，具体的培养基配方及萌发情况如表1所示。
表1 不同培养基及添加物对丽江杓兰种子萌发的影响(未添加琼脂)
由表1统计数据，从55D萌发率来看，最佳的萌发基础培养基为2g/L花宝1号，添加0.2mg/L NAA及0.5g/L活性炭粉对种子萌发率影响不大，最适宜的种子萌发添加物为1mg/L甘氨酸、1mg/L尼克酸、1g/L蛋白胨、0.5mg/L B6、0.1mg/L B1、1mg/L 6-BA及15g/L椰子粉。
对比例2
在丽江杓兰最适宜的萌发培养基条件(实施例1提供的培养基：2g/L花宝1号，添加0.2mg/L NAA及0.5g/L活性炭粉对种子萌发率影响不大，最适宜的种子萌发添加物为1mg/L甘氨酸、1mg/L尼克酸、1g/L蛋白胨、0.5mg/L B6、0.1mg/L B1、1mg/L 6-BA及15g/L椰子粉)下，分别采用固体培养(添加琼脂)及液体悬浮培养两种培养方式，对比对种子萌发的影响，筛选较适宜的培养方法。固体培养：将播种后的固体培养基置于暗室中25±2℃暗培养30d，再转入光下培养。液体悬浮培养：将播种后的液体培养基置于摇床上进行液体悬浮培养，培养条件为温度：25±2℃，转速：100r/min。先无光暗培养30d，然后再开灯进行光照培。
表2 不同培养方法对种子萌发的影响
由表2可以看出，在最适宜的培养基下，固体培养的种子萌发率明显低于液体悬浮培养的。原因是丽江杓兰种子有一层非常坚硬的内种皮，紧紧包裹着胚，导致种皮透水性不好，因此有种子休眠效应，在液体培养基中，有大量的水包围种子，能持续性的提供大量的水分，同时不断的旋转有利于氧气的供应，让更多的水分和氧渗透到种子内部供种子萌发。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。
Claims (3)
1.一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
（1）于野外对盛花期的丽江杓兰进行人工异花授粉；
（2）采集野外人工授粉100d后成熟未裂开的果荚作为萌发材料，并放入装有氧化铝干燥剂的密封罐中置于0℃的冰箱中低温处理30天；
（3）对低温处理且未裂开的果荚进行消毒处理，消毒处理后，用灭菌手术刀将果荚横切成两段，即可获得丽江杓兰无菌种子；
（4）用无菌镊子夹着切开的一段果荚，将种子抖落到非共生萌发培养基中；
（5）将播种好的培养瓶置于摇床上进行液体悬浮培养，培养条件为温度：25±2℃，转速：100 r/min ，先无光暗培养30d，然后再开灯进行光照培养，光照时间为12h/d，光照强度为800Lx；
所述液体悬浮培养使用的培养基包括以下成分：花宝1号基础培养基，添加20～30 g/L蔗糖、15 g/L椰子粉、1 mg/L 6-苄氨基腺嘌呤、1 mg/L 甘氨酸、1 mg/L 尼克酸、1g/ L 蛋白胨、0.5 mg/L 维生素B6、0.1 mg/L 维生素B1，其余为蒸馏水，然后用氢氧化钠溶液或盐酸调节培养基pH至5.6，所述花宝1号基础培养基的用量为1～2g/L。
2.根据权利要求1所述的一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，其特征在于，所述步骤（3）中的消毒方法为：将低温处理且未裂开的果荚用毛刷蘸取洗涤液进行清洗，后用大量自来水冲洗，在无菌操作台上，用大量灭菌蒸馏水冲洗果荚，用酒精擦拭果荚表面，等表面酒精挥干后将果荚置于10%的次氯酸钠溶液中浸泡消毒15分钟，消毒后用大量灭菌蒸馏水冲洗，后用无菌滤纸吸干果荚表面水分，继续下步操作。
3.根据权利要求1所述的一种丽江杓兰种子非共生萌发方法，其特征在于，所述花宝1号基础培养基的用量为2g/L。
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