CN102144558B - 滇海水仙花四倍体植株的培育方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种滇海水仙花四倍体植株的培育方法，它将灭菌后的种子在无菌条件下接种在诱导培养基上，在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，诱导培养2～3d，在培养基表面，按12～20μL/cm2的量注入浓度为0.1～0.4g/L的秋水仙素溶液，使种子浸泡在秋水仙素溶液中12～48h，取出种子，用无菌水清洗1～3次，接种在新的诱导培养基上，继续培养30～35d，得叶片宽大、厚度厚、叶色深、叶脉粗的滇海水仙花四倍体植株。本发明有效提高多倍体发生频率，增殖或生根后，选取具有多倍体特征的无菌植株的叶片离体培养或用多倍体的丛生芽继续增殖，可在短期内繁殖出大量的多倍体植株。该种方法操作简单，容易控制试验条件和重复试验结果，提高工作效率，既能保持原品种的优良性状，又可使花器官增大，色彩更好，观赏价值和商品价值更高。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物新品种的培育方法，尤其是涉及一种滇海水仙花四倍体植株的培育方法，属于生物技术育种领域。
背景技术
滇海水仙花（Primula pseudodenticulata Pax）是报春花属球花报春组植物，为多年生草本，头状伞形花序，多花，花冠粉红至淡紫蓝色。花期12月至翌年2月，果期3～4月，主要分布在云南昆明、蒙自、大理、丽江，海拔1500～2300米的湿草地，四川西部也有分布。该种植物具较高的观赏和药用价值，且在冬末春初开花，可填补冬末春初开花植物少的市场空白。研究中发现引种后植株可全年生长，并从基部长出分糪枝，在园林中既可作为盆花也可作为地被植物运用。
报春花属植物在我国虽然种类繁多，但大部分种类的现存量并不多，大量的野生种类随着人为的开发和生态环境的恶化不断遭到破坏。如果能在离体快速繁殖技术下利用化学诱变剂对滇海水仙花进行四倍体诱导，不仅保护现有资源，同时创新了种质资源。
植物染色体组的多倍化是植物进化变异的自然现象，也是促进植物发生进化改变的重要力量。多倍体因其自身具备的巨大性、低孕型、抗逆性及克服远缘杂交的不育性等特点而被园艺育种专家所青睐，自20世纪30年代开始，现已育成多倍体金鱼草、百日菊、四季报春、麝香百合、凤仙、郁金香、大丽菊等花卉品种，且大多表现为叶片肥厚、花色艳丽、花期长、花瓣多等特点，使其观赏价值得到了提高。国内已经对很多野生报春进行了引种驯化和选育，并且也对少数野生报春进行了多倍体育种研究，但是对滇海水仙花的多倍体诱导技术的研究在国内外还是空白。
发明内容
本发明以云南特色花卉滇海水仙花的种子为育种材料，采用组织培养和秋水仙素处理相结合的方法，进行多倍体诱导培养，以在短期内获得观赏价值较高的花卉品种。
具体来说，本发明旨在提供一种滇海水仙花四倍体植株的培育方法，其特征在于包括下列各步骤：
（1）将灭菌后的种子在无菌条件下接种在下列诱导培养基上：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 0.1～0.3 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 5.5～5.8
在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，诱导培养2～3d；
（2）在步骤（1）的接种了种子的培养基表面，按12～20μL/cm2的量，注入浓度为0.1～0.4g/L的秋水仙素溶液，使种子浸泡在秋水仙素溶液中12～48h，取出种子，用无菌水清洗1～3次；
（3）在无菌条件下，将步骤（2）的种子接种到新的与步骤（1）相同的诱导培养基中，在光照时间为10～12h/d，光照强度为800～1200Lx，温度为22～26℃的条件下，培养30～35d，得幼苗；
（4）将（3）步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，生根培养30～40d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株，滇海水仙花四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽；
（5）将（4）步骤得到的滇海水仙花嵌合体植株进行下列处理：
1）切割分离滇海水仙花嵌合体的茎或叶，接种到与步骤（1）相同的诱导培养基中，在光照时间为10～12h/d，光照强度为800～1200Lx，温度为22～26℃的条件下，培养30～35d，得幼苗；
2）将1）步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，生根培养30～40d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株；
3）对2）步骤的滇海水仙花嵌合体重复1）、2）步骤，以防止回复成二倍体，直至得到稳定的四倍体植株；将2）步骤的滇海水仙四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽。
所述步骤（1）的种子灭菌处理为：选当年结下的种子，用水洗净后，先用质量浓度为75%的酒精灭菌40～60s，用无菌水冲洗1～3次，放入质量浓度为0.05～0.2%的升汞溶液中浸泡10～20分钟，再用无菌水冲洗1～3次，之后再放入质量浓度为1～2%的次氯酸钠溶液中浸泡8～15分钟，用无菌水冲洗1～3次。
所述步骤（2）中注入的质量浓度为0.1～0.4g/L的秋水仙素溶液，预先经过常规高压灭菌消毒处理。
所述步骤（2）中注入的秋水仙素溶液质量浓度优选0.2～0.3g/L。
所述步骤（2）中的种子浸泡在秋水仙素溶液中的时间优选36h。
所述（4）步骤的滇海水仙花四倍体植株通过下列常规方法进行鉴定：
A、从形态学方面进行鉴定时，首先将新鲜叶片放入冰箱中冷冻24h，轻轻撕下下表皮，经I2-KI染色后加盖玻片，用显微照相设备随机统计30个视野的气孔数，直接测量气孔长度和宽度，计算平均值并进行显微摄像，结果表明：由于体细胞的加倍，造成体积的增大，因此多倍体植物与相应的二倍体植株相比，表现出其特有的“巨大性”特征，如叶片变大加厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性增强等特性；
B、进行细胞学鉴定时，选择变异明显的植株，在不含激素的MS培养基上生根培养，生根后，早上8：00-9：00切取长势良好的新鲜根尖,用0.002mol/L的8-羟基喹啉预处理3～5小时，室温置于冰水混合物中，卡诺氏固定液（无水乙醇：冰乙酸=3:1）于冰水混合物中固定30min，1:1的1mol/L盐酸与45%醋酸混合液与60℃水解1min，卡宝品红染色，常规压片，光学显微镜下观察，照相，并制作永久封片。结果表明：滇海水仙花四倍体植株染色体数目为2n=4x=32。
在步骤（4）的生根培养中，除得到丛生性强的滇海水仙花四倍体外，还会得到滇海水仙花嵌合体，滇海水仙花嵌合体与滇海水仙花二倍体相比，同样表现出叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗的相关巨大的特性，且由于滇海水仙花嵌合体中同时存在二倍和高倍性细胞，很容易在生长过程中又回复成二倍体，因此，要对滇海水仙花嵌合体进行如（5）步骤的处理，直至获得大量的叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株。
本发明与现有技术相比具有下列效果和优点：本发明对滇海水仙花的种子采用秋水仙素处理诱导，并结合组织培养技术，提高多倍体发生频率，克服了秋水仙素在田间中的抑制作用，即浸泡后前期真叶生长明显受到抑制，变异的幼苗不仅第一对真叶出现较迟，也较对照的小而厚，且多呈畸形，抑制程度随秋水仙素浓度的增加而愈加明显，并且诱导成活率低。本发明采用组织培养与秋水仙素处理相结合诱导多倍体的优点:①加倍的目的性明确，可以提高多倍体发生频率。②增殖或生根后，选取具有多倍体特征的无菌植株的叶片离体培养或用多倍体的增殖芽继续增殖，可在短期内繁殖出大量的多倍体植株。③该种方法操作简单，容易控制试验条件和重复试验结果，提高工作效率，既能保持原品种的优良性状，又可使花器官增大，色彩更好，观赏价值和商品价值更高。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例1
1、选当年结下的种子，用水洗净后，先用质量浓度为75%的酒精灭菌40s，用无菌水冲洗1次，放入质量浓度为0.05%的升汞溶液中浸泡20分钟，再用无菌水冲洗1次，之后再放入质量浓度为1%的次氯酸钠溶液中浸泡15分钟，用无菌水冲洗1次；
2、将1步骤灭菌后的种子在无菌条件下接种在下列诱导培养基上：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 0.1 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 5.5
在光照强度为800 Lx，光照时间为 12h/d，温度为22 ℃的条件下，诱导培养 3d；
3、在2步骤的接种了种子的培养基表面，按12 μL/cm2的量，注入预先经过常规高压灭菌消毒处理过的浓度为0.1 g/L的秋水仙素溶液，使种子浸泡在秋水仙素溶液中 48h，取出种子，用无菌水清洗 3次；
4、在无菌条件下，将3步骤的种子接种到新的与2步骤相同的诱导培养基中，在光照时间为12h/d，光照强度为800 Lx，温度为22 ℃的条件下，培养35d，得幼苗；
5、将4步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为800Lx，光照时间为12h/d，温度为22℃的条件下，生根培养40d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株，滇海水仙花四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽；
6、将5步骤得到的滇海水仙花嵌合体植株进行下列处理：
1）切割分离滇海水仙花嵌合体的茎或叶，接种到与2步骤相同的诱导培养基中，在光照时间为12h/d，光照强度为800Lx，温度为22℃的条件下，培养35d，得幼苗；
2）将1）步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为800Lx，光照时间为12h/d，温度为22℃的条件下，生根培养40d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株；
3）对2）步骤的滇海水仙花嵌合体重复1）、2）步骤，以防止回复成二倍体，直至得到稳定的四倍体植株；将2）步骤的滇海水仙四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽。
实施例2
1、选当年结下的种子，用水洗净后，先用质量浓度为75%的酒精灭菌60s，用无菌水冲洗3次，放入质量浓度为0.2%的升汞溶液中浸泡10分钟，再用无菌水冲洗3次，之后再放入质量浓度为2%的次氯酸钠溶液中浸泡8分钟，用无菌水冲洗3次。
2、将1步骤灭菌后的种子在无菌条件下接种在下列诱导培养基上：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 0.3 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 5.8
在光照强度为 1200Lx，光照时间为10 h/d，温度为 26℃的条件下，诱导培养2 d；
3、在2步骤 的接种了种子的培养基表面，按 20μL/cm2的量，注入预先经过常规高压灭菌消毒处理过的浓度为 0.4g/L的秋水仙素溶液，使种子浸泡在秋水仙素溶液中12 h，取出种子，用无菌水清洗1 次；
4、在无菌条件下，将3步骤 的种子接种到新的与2步骤 相同的诱导培养基中，在光照时间为 10h/d，光照强度为 1200Lx，温度为 26℃的条件下，培养30 d，得幼苗；
5、将4步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为1200Lx，光照时间为10h/d，温度为26℃的条件下，生根培养30d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株，滇海水仙花四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽；
6、将5步骤得到的滇海水仙花嵌合体植株进行下列处理：
1）切割分离滇海水仙花嵌合体的茎或叶，接种到与2步骤相同的诱导培养基中，在光照时间为10 h/d，光照强度为 1200Lx，温度为 26℃的条件下，培养30 d，得幼苗；
2）将1）步骤的幼苗接种在不含激素的MS培养基上，在光照强度为1200Lx，光照时间为10h/d，温度为26℃的条件下，生根培养30d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株；
3）对2）步骤的滇海水仙花嵌合体重复1）、2）步骤，以防止回复成二倍体，直至得到稳定的四倍体植株；将2）步骤的滇海水仙四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽。
实施例3
1、选当年结下的种子，用水洗净后，先用质量浓度为75%的酒精灭菌50s，用无菌水冲洗2次，放入质量浓度为0.1%的升汞溶液中浸泡15分钟，再用无菌水冲洗2次，之后再放入质量浓度为1.5%的次氯酸钠溶液中浸泡11分钟，用无菌水冲洗2次。
2、将1步骤灭菌后的种子在无菌条件下接种在下列诱导培养基上：
MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 0.2 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 5.7
在光照强度为800～1200Lx，光照时间为1 1 h/d，温度为24℃的条件下，诱导培养2 d；
3、在2步骤的接种了种子的培养基表面，按16μL/cm2的量，注入预先经过常规高压灭菌消毒处理过的浓度为0.3g/L的秋水仙素溶液，使种子浸泡在秋水仙素溶液中32h，取出种子，用无菌水清洗2次；
4、在无菌条件下，将3步骤的种子接种到新的与2步骤相同的诱导培养基中，在光照时间为11h/d，光照强度为1000Lx，温度为24℃的条件下，培养32d，得幼苗；
5、将4步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为1000Lx，光照时间为11h/d，温度为24℃的条件下，生根培养35d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株，滇海水仙花四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽；
6、将5步骤得到的滇海水仙花嵌合体植株进行下列处理：
1）切割分离滇海水仙花嵌合体的茎或叶，接种到与2步骤相同的诱导培养基中，在光照时间为11h/d，光照强度为1000Lx，温度为24℃的条件下，培养32d，得幼苗；
2）将1）步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为1000Lx，光照时间为11h/d，温度为24℃的条件下，生根培养35d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株；
3）对2）步骤的滇海水仙花嵌合体重复1）、2）步骤，以防止回复成二倍体，直至得到稳定的四倍体植株；将2）步骤的滇海水仙四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽。
对上述实施例1、实施例2、实施例3的滇海水仙花四倍体植株通过下列常规方法进行鉴定：
A、从形态学方面进行鉴定时，首先将新鲜叶片放入冰箱中冷冻24h，轻轻撕下下表皮，经I2-KI染色后加盖玻片，用显微照相设备随机统计30个视野的气孔数，直接测量气孔长度和宽度，计算平均值并进行显微摄像，结果表明：由于体细胞的加倍，造成体积的增大，因此多倍体植物与相应的二倍体植株相比，表现出其特有的“巨大性”特征，如叶片变大加厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性增强等特性；
B、进行细胞学鉴定时，选择变异明显的植株，在不含激素的MS培养基上生根培养，生根后，早上8：00-9：00切取长势良好的新鲜根尖,用0.002mol/L的8-羟基喹啉预处理3～5小时，室温置于冰水混合物中，卡诺氏固定液（无水乙醇：冰乙酸=3:1）于冰水混合物中固定30min，1:1的1mol/L盐酸与45%醋酸混合液与60℃水解1min，卡宝品红染色，常规压片，光学显微镜下观察，照相，并制作永久封片。结果表明：滇海水仙花四倍体植株染色体数目为2n=4x=32。
Claims (5)
1.一种滇海水仙花四倍体植株的培育方法，其特征在于包括下列各步骤：
（1）将灭菌后的种子在无菌条件下接种在下列诱导培养基上：MS基本培养液
6-苄基氨基嘌呤6-BA 0.1～0.3 mg/L
萘乙酸NAA 0.1 mg/L
蔗糖 30000 mg/L
琼脂 6500 mg/L
pH 5.5～5.8
在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，诱导培养2～3d；
（2）在步骤（1）的接种了种子的培养基表面，按12～20μL/cm2的量，注入浓度为0.1～0.4g/L的秋水仙素溶液，使种子浸泡在秋水仙素溶液中12～48h，取出种子，用无菌水清洗1～3次；
（3）在无菌条件下，将步骤（2）的种子接种到新的与步骤（1）相同的培养基中，在光照时间为10～12h/d，光照强度为800～1200Lx，温度为22～26℃的条件下，培养30～35d，得幼苗；
（4）将（3）步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，生根培养30～40d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株，滇海水仙花四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽；
（5）将（4）步骤得到的滇海水仙花嵌合体植株进行下列处理：
1）切割分离滇海水仙花嵌合体的茎或叶，接种到与步骤（1）相同的诱导培养基中，在光照时间为10～12h/d，光照强度为800～1200Lx，温度为22～26℃的条件下，培养30～35d，得幼苗；
2）将1）步骤的幼苗接种在MS培养基上，在光照强度为800～1200Lx，光照时间为10～12h/d，温度为22～26℃的条件下，生根培养30～40d，得到叶片大而厚，且颜色深，叶脉粗，丛生性强的滇海水仙花四倍体植株及嵌合体植株；
3）对2）步骤的滇海水仙花嵌合体重复1）、2）步骤，以防止回复成二倍体，直至得到稳定的四倍体植株；将2）步骤的滇海水仙四倍体植株直接移栽至大田，或者再用滇海水仙花四倍体植株按常规进行扩繁后，得大量滇海水仙花四倍体植株，移栽。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）的种子灭菌处理为：选当年结下的种子，用水洗净后，先用质量浓度为75%的酒精灭菌40～60s，用无菌水冲洗1～3次，放入质量浓度为0.05～0.2%的升汞溶液中浸泡10～20分钟，再用无菌水冲洗1～3次，之后再放入质量浓度为1～2%的次氯酸钠溶液中浸泡8～15分钟，用无菌水冲洗1～3次。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中喷洒的质量浓度为0.1～0.4g/L的秋水仙素溶液，预先经过过滤，常规高压灭菌消毒处理。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中喷洒的秋水仙素溶液质量浓度优选0.2～0.3g/L。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（2）中种子在注入有秋水仙素溶液的浸泡环境下保持的时间优选为36h。
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