CN105454046A - 一种早花忍冬的离体快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物组织培养领域，提供了一种早花忍冬的离体快繁方法。本发明以早花忍冬的幼嫩茎段为外植体，以MS为基本培养基，添加植物生长调节剂6-BA、NAA诱导腋芽萌发生长，再经继代增殖培养、生根诱导及炼苗移栽，可在短时间内获得大量再生植株。本发明为早花忍冬优质种苗的快速繁殖提供一条有效途径，其增殖系数较高,诱导生根率高，易移栽成活。在很大程度上满足东北地区早春园林绿化美化的需求，为进一步综合开发利用奠定基础。

Description

一种早花忍冬的离体快繁方法
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及一种早花忍冬的离体快繁方法。
背景技术
早花忍冬（Lonicera praeflorens Batalin）是忍冬科（Caprifoliaceae）忍冬属落叶灌木。主要分布于我国东北三省的东南部，俄罗斯(远东地区)、朝鲜、日本也有分布。早花忍冬四月中下旬花先于叶开放，成对生于总花梗上，淡紫色，在早春时节突显淡雅别致的韵味。该树种枝叶茂盛，开花早，果实成熟早，绿叶衬托着红果，甚是美观。能弥补东北地区早春时节的萧条景象，延长城市的绿化时间，丰富早春时节绿化景观，是一种具有开发价值的优良绿化树种。
忍冬属植物具有清热解毒、保肝利胆、抗氧化、提高免疫力等功效。其花蕾和果实中还含有人体必需的微量元素、氨基酸和其它一些营养成分，具有营养保健价值。今后有待进一步分析早花忍冬的化学成分及药理药效作用，可以考虑作为金银花的代用资源或开发为新的药用资源，满足医疗需求。早花忍冬叶片表面密被绒毛，具有很强的滞尘能力，同时经试验得出早花忍冬还具有很强的杀菌能力，适宜种植在厂矿、医院、街道等场所，能起到较好的净化效果。目前，早花忍冬主要采用扦插繁殖，而种子繁殖比较困难，野生资源数量少不能满足实际需要，因此开展其组织培养技术的研究显得尤为迫切。
早花忍冬具有很高的生态效益和经济价值，但目前现存野生资源数量少，因此培育大量优质苗木势在必行。目前早花忍冬主要靠扦插的方法繁殖，但受插穗来源和季节限制，生长速度慢。因此,有必要建立一种早花忍冬的离体快繁方法,为其良种快速繁育提供技术支撑和保障, 从实践上为园林绿化快速培育苗木解决技术上的难题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种早花忍冬离体快繁方法,通过外植体选择及消毒、启动诱导培养、增殖培养、生根诱导培养、炼苗移栽等过程实现早花忍冬的离体快繁,从而实现了本发明的目的。
本发明提供一种早花忍冬离体快繁技术,包括以下步骤：
（1）外植体的消毒及初代培养：选择生长健壮、无病虫害的当年萌发的幼嫩枝条为外植体，先用流水冲洗1h，然后加入洗洁精浸泡10min，再用2.0% NaCLO处理20min，无菌水冲洗3次。将嫩枝修剪成1cm左右带芽茎段接种于启动诱导培养基上，置于每天光照10～12h,光照强度约为20001x,培养温度为23～25℃条件下培养,直至诱导腋芽萌发生长；
（2）继代增殖培养：将腋芽萌发生长的芽苗转入增殖培养基上进行继代增殖培养,置于每天光照12小时,光照强度为20001x,培养温度为23～25℃条件下培养，直至腋芽萌发；
（3）生根诱导培养：将高度约为3cm的生长健壮的无根苗接种到生根培养基上进行生根诱导, 置于每天光照12小时,光照强度为2000～25001x,培养温度为23～25℃条件下培养至生根；
(4)炼苗移栽: 早花忍冬在生根培养基中培养30～35d后，挑选生长健壮、根系发达的组培苗, 先打开封口膜置于自然光照下炼苗3～5d, 然后用清水洗净根部残留的培养基,移栽到已消毒的含有等量珍珠岩和蛭石的基质中。
上述步骤(1)所述的启动培养基为MS+1.0mg/L 6-BA(6—苄氨基腺嘌呤)+0.05mg/L NAA（萘乙酸）+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉或MS+0.5mg/L 6-BA +30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH值为5.8。培养30d，腋芽萌发并伸长生长至3.5cm左右。
上述步骤（2)所述的增殖培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.05～0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/琼脂粉，pH值为5.8，增殖系数平均为6.5，继代周期为40d。
上述步骤(3)所述的生根培养基为1/2MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L NAA+15g/L蔗糖+7g/L琼脂粉,pH值为5.8。生根培养40d后，平均生根数量为5，根长约3cm，生根率达100%。
上述步骤(4)移栽前将基质用0.3%高锰酸钾溶液淋透消毒，然后再用清水冲淋3～5遍。移栽前期覆盖塑料薄膜保湿并用遮荫网适当遮阴，每天喷雾2次，每隔5天喷施800倍多菌灵杀菌溶液，移栽后期逐渐降低湿度，增加光照。移栽15d左右长出新根，移栽成活率达85％以上。保证温湿度平衡和光照需求是移栽成功的关键。
本发明的有益效果：1.本发明为早花忍冬优质种苗的快速繁殖提供一条有效途径，弥补了种子繁殖难的问题。
本发明采用植物组织培养技术，培养条件可控，重复性强，可周年生产。本发明通过诱导腋芽萌发的途径，既保持了母株的优良遗传特性又可在短时间内繁育大量苗木。本发明具有增殖系数高、生根时间短、根系发达、移栽成活率高、生长周期短等特点，大大提高了早花忍冬的育苗效率，利于工厂化生产。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体描述,有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明,不能理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
1.无菌培养体系的建立
5月初剪取早花忍冬当年萌发的嫩枝，先用流水冲洗1h，然后修剪掉叶片，再加入洗洁精浸泡10 min，用流水冲洗干净。最后置超净工作台上分别采用以下3种处理筛选适宜的灭菌方法。
第1种为0.1％升汞浸泡5min，无菌水冲洗6次；
第2种为0.1％升汞浸泡7min，无菌水冲洗6次；
第3种为2.0％次氯酸钠浸泡20min，无菌水冲洗3次。
将长约1cm带芽的茎段接种于MS空白培养基，每种处理接种60瓶，3次重复。培养30d统计污染率和成活率。污染率（%）= 污染的外植体数/接种的外植体总数×100%；成活率（%）= 鲜绿的无菌外植体数/接种的外植体总数×100%。
表1不同处理的灭菌效果
灭菌剂 灭菌时间/min 污染率/% 成活率/% 外植体生长情况
0.1％HgCl2 5 16.7 60.0 生长差，少数变褐
0.1％HgCl2 7 10.0 43.3 生长差，多数变褐
2.0％NaClO 20 13.3 86.7 生长良好，绿色
2.初代培养
以MS培养基为基本培养基，剪取约1cm带芽的幼嫩茎段接种到以下4种不同培养基，每种培养基均添加7g/L琼脂粉，30g/L蔗糖，pH值均为5.8。
1. MS+0.5mg/L 6-BA
2. MS+1.0mg/L 6-BA
3. MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA
4. MS+1.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA
培养30天后观察，早花忍冬启动培养对生长素浓度的要求比较低，只添加细胞分裂素6-BA就可以诱导腋芽萌发生长，细胞分裂素和生长素配合使用诱导分化效果更好，但随生长素浓度升高，腋芽萌发时间长，生长慢。生长素浓度在0.05mg/L时生长迅速，分化率达93.3%；当生长素浓度达到0.1mg/L时腋芽生长缓慢且茎基部形成致密的黄绿色愈伤组织。
3.增殖继代培养
将启动培养获得的无菌苗转接到以下3种增殖培养基。每种培养基均添加7g/L琼脂，30g/L蔗糖，pH值均为5.8。
1. MS+2.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA
2. MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA
3. MS+3.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA
培养40 d后得出：当6-BA浓度为2.0 mg/L时，早花忍冬的腋芽分化增殖快，但随NAA浓度升高腋芽分化率降低。当6-BA浓度为3.0 mg/L时，外植体基本不分化，甚至干枯而死。NAA浓度达到0.1 mg/L时，外植体基部即形成致密的绿色的愈伤组织。
4.生根培养
选择增殖培养中生长比较健壮的无菌苗，剪取2～3cm无菌苗接种到以下4种培养基中，每种培养基均添加7g/L琼脂，15g/L蔗糖，pH值均为5.8。
1.1/2MS+0.5mg/L IBA
2.1/2MS+0.5mg/L NAA
3.1/2MS+0.3mg/L NAA+0.3mg/L IBA
4.1/2MS+0.5mg/L NAA+0.5mg/L IBA
培养40天，观察并统计不同处理的生根率、生根数量及长度。
植物生长素对早花忍冬生根的影响
NAA/mg·L-1 IBA/mg·L-1 平均生根率/% 平均生根数/条 平均主根长/cm
0 0.5 0 0 0
0.5 0 83.3 4 2.2
0.3 0.3 100.0 5 3.0
0.5 0.5 83.3 4 2.4
炼苗与移栽
挑选生长健壮、根系发达的组培苗, 打开封口膜，先在室内散射光条件下培养3 d, 然后用镊子将试管苗从培养瓶中取出, 洗净根部残留的培养基, 移栽到含有等量珍珠岩和蛭石的基质中。移栽前将基质用0.3%高锰酸钾溶液淋透消毒，然后用清水冲淋3～5遍。
移栽后7～10d覆盖塑料薄膜保湿并用遮荫网适当遮阴，每天喷雾2次，随后逐渐降低湿度，增加光照。15d左右长出新根，移栽成活率达85％以上。

Claims (4)

1.一种早花忍冬的离体快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）外植体的消毒及初代培养：选择生长健壮的无病虫害的当年萌发的幼嫩枝条为外植体，先用流水冲洗1h，然后加入洗洁精浸泡10 min，再用2.0% NaCLO处理20 min，无菌水冲洗3次；将嫩枝修剪成1cm左右带芽茎段接种于启动诱导培养基上，置于每天光照10～12h,光照强度约为20001x,培养温度为23～25℃条件下培养,直至诱导腋芽生长；
（2）继代增殖培养：将腋芽萌发生长的芽苗转入增殖培养基上进行继代增殖培养,置于每天光照12小时,光照强度为20001x,培养温度为23～25℃条件下培养，直至腋芽萌发，继代周期为40d；
（3）生根诱导培养：将高度约为3cm的生长健壮的无根苗接种到生根培养基上进行生根诱导, 置于每天光照12小时,光照强度为2000～25001x,培养温度为23～25℃条件下培养至生根；
(4)炼苗移栽: 早花忍冬在生根培养基中培养30～35d后，挑选生长健壮、根系发达的组培苗, 先打开封口膜置于自然光照下炼苗3～5d, 然后用清水洗净根部残留的培养基,移栽到已消毒的含有等量珍珠岩和蛭石的基质中。
2.根据权利要求1所述的一种早花忍冬的离体快繁方法,其特征在于步骤(1)所述的初代培养基为:MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉或MS+0.5mg/L6-BA+30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述的一种早花忍冬的离体快繁方法,其特征在于步骤(2)所述的增殖培养基为MS+2.0mg/L 6-BA+0.05～0.1mg/L NAA++30g/L蔗糖+7g/L琼脂粉，pH值为5.8。
4.根据权利要求1所述的一种早花忍冬的离体快繁方法,其特征在于步骤(3)所述的生根培养基为1/2MS+0.3mg/L IBA+0.3mg/L NAA +15g/L蔗糖+7g/L琼脂粉,pH值为5.8。
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