CN104429948A - 蓝靛果忍冬器官型再生培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法，包括以下步骤：1)外植体灭菌；2)基本培养基；3)附加激素；4)培养条件。本发明是蓝靛果忍冬直接从外植体上再生不定芽的器官型再生培养方法，器官型再生培养方法与器官发生型培养方法相比，减少了由外植体诱导愈伤组织的过程，直接从外植体上再生不定芽，缩短了组织培养的培养周期，节约了组织培养成本，加快了繁殖途径。培养基由大量元素、微量元素和附加激素组成，利用本项发明外植体不形成愈伤组织，直接再生不定芽，分化率达到100％，增殖倍数达到5.5倍，与器官发生型培养方法相比可缩短培养周期20～30天，节约培养基成本10％,其它成本13.3％。

Description

蓝靛果忍冬器官型再生培养方法

技术领域：本发明涉及一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法。

背景技术

蓝靛果忍冬(Lonicera caerulea)是忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属落叶灌木，高1.3～1.5m，主要分布在俄罗斯、中国、日本和北美。北日勒(Берель)是西伯利亚科学院理萨文科园艺研究所1980年从阿尔泰忍冬与勘察加忍冬的蓝鸟、蓝色纺锤、蔚蓝等品种的杂交种中选出的新品种，1996年被列入俄罗斯国家登记册。果实为小浆果，平均单果重1.3～1.6g，果汁多，味酸甜，含糖7.2％、酸2.8％，每100g鲜果含维生素C 23mg，维生素P 1263mg，果实较硬，耐贮运，是可综合利用的品种。果实适合鲜食以及用来加工成果汁、果酒、饮料等，也是加工天然食用色素的极好原料，具有很高的营养价值和保健功能，国际公认为是继越桔、黑穗醋栗、树莓和沙棘之后的又一新兴小浆果树种。蓝靛果忍冬中存在丰富的生理活性物质，对于治疗目前人类的许多常见疾病都有重大价值，因此，在食品和医疗保健品的开发上都具有重要的经济意义。

近年来，随着市场需求的不断增长，鲜果价格不断提高，加之对 蓝靛果饮料、果酒等产品的开发，导致其野生资源锐减，市场供不应求。我国从20世纪80年代开展了野生蓝靛果的驯化栽培试验以及开发利用工作，但新品种选育及定量化的培育试验工作才刚刚开始，因此开展优良品种组织培养技术研究尤为重要。

国内外关于蓝靛果忍冬组织培养与快速繁殖的报道很少，现有报道中对俄罗斯引进品种组织培养与植株再生的研究也是通过愈伤组织的器官发生型途径，尚没有不经过愈伤组织，直接从外植体上再生不定芽，缩短组织培养周期的相关报道。现有的蓝靛果忍冬组织培养方法，培养周期长，本发明采用器官型再生培养方法，与现有的由外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织再分化不定芽的器官发生型培养方法相比，减少了由外植体诱导愈伤组织的过程，直接从外植体上再生不定芽，缩短了组织培养的培养周期，节约了组织培养成本，加快了繁殖途径，并且形成的不定芽保持了原品种的优良特性。

发明内容：本发明的目的是提供一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法，改变现有蓝靛果忍冬组织培养由外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织再分化不定芽的器官发生型的培养方法，简化现有蓝靛果忍冬组织培养的环节，缩短培养周期，节约培养成本。本发明的技术方案为：

一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法，其特征是：由以下四个步 骤组成：

第一步、外植体灭菌

蓝靛果忍冬外植体接种至器官型再生培养基之前，外植体采集在6月初进行，外植体应选用定植后一年生或两年生植株新梢的茎尖或茎段，将采集的外植体放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉浸泡搅拌2～3min，然后放入流水冲洗4～6h，于超净工作台上用体积百分比浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒8～10min，然后用无菌水冲洗6～7次，再接种于器官型再生培养基上；

第二步、基本培养基

蓝靛果忍冬器官型再生培养基，采用B₅混合培养基作为蓝靛果忍冬器官型再生培养基，基本培养基由大量元素、微量元素组成，为保证铁元素的稳定供应，采用Fe·EDTA形态的铁盐，未采用B₅铁盐成分，其中大量元素由质量百分比浓度为2500mg/L的硝酸钾(KNO₃)，150mg/L的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，250mg/L的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，134mg/L的硫酸铵【(NH₄)₂SO₄】，150mg/L的磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)组成，微量元素由质量百分比浓度为10mg/L的硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，3mg/L的硼酸(H₃BO₃)，2mg/L的硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.75mg/L的碘化钾(KI)，0.25mg/L的钼酸钠(Na₂M_oO₄·2H₂O)，0.025mg/L的硫 酸铜(CuSO₄·5H₂O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl₂·6H₂O)组成，铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA·2H₂O)的螯合剂(NaFe·EDTA)组成，蔗糖30g/L，琼脂粉5～6g/L，pH值5.8～6.2；

第三步、附加激素

蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素，由质量百分比浓度为1.0～3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.1～0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组成；

第四步、培养条件

蓝靛果忍冬器官型再生培养方法的培养条件是：培养温度白天为23℃±2℃，夜间不低于15℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为1800～2000Lx，30～35天继代一次。

本发明的优点：

(1)培养基成分：在组织培养时，各种营养元素主要从培养基中获得，矿物元素靠适宜的无机盐类提供，本发明的培养基是B₅混合培养基，培养基中的大量元素，微量元素，附加激素来源广泛，价格低廉，MS配方的特点是无机盐浓度较高，对某些植物甚至表现出抑制作用，本发明与现在主要采用的蓝靛果忍冬培养基配方(MS)相比降 低了无机盐的(NO₃ ^﹣、NH₄ ⁺、B³⁺、Mn²⁺、Zn²⁺)的离子浓度，有利于器官的分化培养。

(2)本发明一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法，与现有的培养方法相比，外植体不形成愈伤组织，直接从外植体上再生不定芽，减少了由外植体形成愈伤组织的环节，与器官发生型培养方法相比可缩短培养周期20～30天，节约培养基成本(琼脂粉、蔗糖、激素等)10％,其它成本(电费、人工费、耗材等)13.3％，分化率达到100％，增殖倍数达到5.5倍，加快了繁殖途径，技术路线如图1所示。

(3)本发明对优良蓝靛果种质资源开展研究，外植体形成的不定芽保持原品种的优良性状，并且遗传性状稳定，可以为蓝靛果忍冬北日勒(Берель)优良种苗繁育以及工厂化生产奠定基础。

本发明是蓝靛果忍冬直接从外植体上再生不定芽的器官型再生培养方法，器官型再生培养方法与器官发生型培养方法相比，减少了由外植体诱导愈伤组织的过程，直接从外植体上再生不定芽，缩短了组织培养的培养周期，节约了组织培养成本，加快了繁殖途径。培养基由大量元素、微量元素和附加激素组成，利用本项发明外植体不形成愈伤组织，直接再生不定芽，分化率达到100％，增殖倍数达到5.5倍，与器官发生型培养方法相比可缩短培养周期20～30天，节约培养基成本10％,其它成本13.3％。

附图说明：

图1组织培养技术流程对比图

图2接种的外植体 

图3激素配比对蓝靛果忍冬外植体诱导分化的影响

图4接种7天后诱导情况 

图5接种15天后诱导情况 

图6采用器官型再生培养方法继代增殖的组培苗

具体实施方式：由以下四个步骤组成：

第一步、外植体灭菌

蓝靛果忍冬外植体接种至器官型再生培养基之前，外植体采集在6月初进行，外植体应选用定植后一年生或两年生植株新梢的茎尖或茎段，将采集的外植体放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉浸泡搅拌2～3min，然后放入流水冲洗4～6h，于超净工作台上用体积百分比浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒8～10min，然后用无菌水冲洗6～7次，再接种于器官型再生培养基上；

第二步、基本培养基

蓝靛果忍冬器官型再生培养基，采用B₅混合培养基作为蓝靛果忍冬器官型再生培养基，基本培养基由大量元素、微量元素组成，为保 证铁元素的稳定供应，采用Fe·EDTA形态的铁盐，未采用B₅铁盐成分，其中大量元素由质量百分比浓度为2500mg/L的硝酸钾(KNO₃)，150mg/L的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，250mg/L的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，134mg/L的硫酸铵【(NH₄)₂SO₄】，150mg/L的磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)组成，微量元素由质量百分比浓度为10mg/L的硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，3mg/L的硼酸(H₃BO₃)，2mg/L的硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.75mg/L的碘化钾(KI)，0.25mg/L的钼酸钠(Na₂M_oO₄·2H₂O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl₂·6H₂O)组成，铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA·2H₂O)的螯合剂(NaFe·EDTA)组成，蔗糖30g/L，琼脂粉5～6g/L，pH值5.8～6.2；

第三步、附加激素

蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素，由质量百分比浓度为1.0～3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.1～0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组成；

第四步、培养条件

蓝靛果忍冬器官型再生培养方法的培养条件是：培养温度白天为23℃±2℃，夜间不低于15℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为 1800～2000Lx，30～35天继代一次。

所述的蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组成，外植体不形成愈伤组织，直接再生不定芽，且分化率达到100％。

实施例1

(1)第一步、外植体灭菌

蓝靛果忍冬外植体接种至器官型再生培养基之前，外植体采集在6月初进行，外植体应选用定植后一年生或两年生植株新梢的茎尖或茎段，将采集的外植体放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉浸泡搅拌2～3min，然后放入流水冲洗4～6h，于超净工作台上用体积百分比浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒8～10min，然后用无菌水冲洗6～7次，再接种于器官型再生培养基上，如图2所示。

(2)第二步、基本培养基

蓝靛果忍冬器官型再生培养基，采用B₅混合培养基作为蓝靛果忍冬器官型再生培养基，基本培养基由大量元素、微量元素组成，为保证铁元素的稳定供应，采用Fe·EDTA形态的铁盐，未采用B₅铁盐成分，其中大量元素由质量百分比浓度为2500mg/L的硝酸钾(KNO₃)， 150mg/L的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，250mg/L的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，134mg/L的硫酸铵【(NH₄)₂SO₄】，150mg/L的磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)组成，微量元素由质量百分比浓度为10mg/L的硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，3mg/L的硼酸(H₃BO₃)，2mg/L的硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.75mg/L的碘化钾(KI)，0.25mg/L的钼酸钠(Na₂M_oO₄·2H₂O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl₂·6H₂O)组成，铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA·2H₂O)的螯合剂(NaFe·EDTA)组成，蔗糖30g/L，琼脂粉5～6g/L，pH值5.8～6.2；

(3)第三步、附加激素

蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素，由质量百分比浓度为1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.1mg/L的吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为60.0％。

(4)第四步、培养条件

蓝靛果忍冬器官型再生培养方法的培养条件是：培养温度白天为(23℃±2℃)，夜间不低于15℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为1800～2000Lx，30～35天继代一次。

实施例2

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为66.7％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例3

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为1.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为76.9％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例4

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.1mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为81.5％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例5

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为89.3％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例6

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为100.0％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例7

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.1mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为69.2％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例8

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.2mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为63.6％，其它参数及步骤与实施例1相同。

实施例9

本实施方式与实施例1不同的是所述附加激素由质量百分比浓度为3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L吲哚丁酸(IBA)组成，分化率为56.5％，其它参数及步骤与实施例1 相同。

(5)综上具体实施方式的蓝靛果忍冬器官型再生培养基，采用B₅混合培养基作为基本培养基，其中B₅培养基合理降低了培养基中的无机盐含量，有利于器官的分化培养。蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素，由6-苄基氨基嘌呤(6BA)质量百分比浓度分别为(1.0、2.0、3.0mg/L)和吲哚丁酸(IBA)质量百分比浓度分别为(0.1、0.2、0.3mg/L)组成，采用2因素3水平正交设计如图3(实施例1～9)所示，每次接种30瓶，每处理3次重复，30天后统计各处理的分化率(分化率＝分化瓶数/(接种瓶数－污染瓶数)。通过方差分析对影响蓝靛果忍冬植株离体培养与植株再生的因素进行了优化研究，从中选出处理6(实施例6)即附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组合是外植体直接分化为不定芽的最佳激素组合，北日勒外植体接种于B₅(混合)+6BA2.0mg/L+IBA0.3mg/L培养基上，5～7天后不定芽开始萌发并逐渐伸长如图4所示，10～15天后芽可以长到2.5～3.0cm，如图5所示，30天后芽的平均高度可达4.0cm左右，分化率达到了100％，与其它处理间差异显著，因此基本培养基B₅混合培养基附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组合 是外植体直接分化为不定芽的最佳激素组合，可作为蓝靛果忍冬器官型再生培养基。器官型再生培养基可使外植体不经过愈伤组织直接产生不定芽，分化率可达到100％，增殖倍数可达5.5倍，可缩短培养周期20～30天，节约培养基成本10％，其它成本13.3％，外植体形成的不定芽保持原品种的优良性状，并且遗传性状稳定如图6所示。

(6)本实施方式的培养基配制方法与常规培养基配制方法相同，培养基配方中的大量元素，微量元素，附加激素其来源广泛，价格低廉，但培养基配方要求严格，其中大量元素、微量元素与激素浓度一定要按照配方所述进行配制。

Claims (2)

1.一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法，其特征是：由以下四个步骤组成：

第一步、外植体灭菌

蓝靛果忍冬外植体接种至器官型再生培养基之前，外植体采集在6月初进行，外植体应选用定植后一年生或两年生植株新梢的茎尖或茎段，将采集的外植体放入清水中浸泡，加入少量洗衣粉浸泡搅拌2～3min，然后放入流水冲洗4～6h，于超净工作台上用体积百分比浓度为75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗3次，再用质量百分比浓度为0.1％的氯化汞溶液消毒8～10min，然后用无菌水冲洗6～7次，再接种于器官型再生培养基上；

第二步、基本培养基

蓝靛果忍冬器官型再生培养基，采用B₅混合培养基作为蓝靛果忍冬器官型再生培养基，基本培养基由大量元素、微量元素组成，为保证铁元素的稳定供应，采用Fe·EDTA形态的铁盐，未采用B₅铁盐成分，其中大量元素由质量百分比浓度为2500mg/L的硝酸钾(KNO₃)，150mg/L的氯化钙(CaCl₂·2H₂O)，250mg/L的硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)，134mg/L的硫酸铵【(NH₄)₂SO₄】，150mg/L的磷酸二氢钠(NaH₂PO₄·H₂O)组成，微量元素由质量百分比浓度为10mg/L的硫酸锰(MnSO₄·H₂O)，3mg/L的硼酸(H₃BO₃)，2mg/L的硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)，0.75mg/L的碘化钾(KI)，0.25mg/L的钼酸钠(Na₂M_oO₄·2H₂O)，0.025mg/L的硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)，0.025mg/L的氯化钴(CoCl₂·6H₂O)组成，铁盐由质量百分比浓度为27.8mg/L的硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)和质量百分比浓度为37.3mg/L的乙二胺四乙酸二钠(Na₂·EDTA·2H₂O)的螯合剂(NaFe·EDTA)组成，蔗糖30g/L，琼脂粉5～6g/L，pH值5.8～6.2；

第三步、附加激素

蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素，由质量百分比浓度为1.0～3.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.1～0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组成；

第四步、培养条件

蓝靛果忍冬器官型再生培养方法的培养条件是：培养温度白天为23℃±2℃，夜间不低于15℃，光照时间为12～14h/d，光照强度为1800～2000Lx，30～35天继代一次。

2.根据权利要求1所述的一种蓝靛果忍冬器官型再生培养方法，其特征是：所述的蓝靛果忍冬器官型再生培养基附加激素由质量百分比浓度为2.0mg/L的6-苄基氨基嘌呤(6BA)和质量百分比浓度为0.3mg/L的吲哚丁酸(IBA)组成，外植体不形成愈伤组织，直接再生不定芽，且分化率达到100％。