CN103314862A - 一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：选择生命力较好的春兰种子，经15%双氧水、0.1%升汞和75%酒精消毒处理后接种在MF固体培养基中萌发，待种子萌发生长到形成2个嫩叶后，剪取春兰幼苗的嫩芽尖、茎尖或者根尖，消毒处理后放入到诱导原球茎培养基MY中进行脱分化培养形成原球茎，原球茎取出分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎再分化诱导培养基MZ中先后诱导形成新芽、新根，当幼苗株高长到4cm-6cm，具有5-6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，拿到光照培养架上培养，逐渐进行驯化培养。本发明能够提高春兰幼苗培育的成功率，而且还能大大缩短育种周期，得到脱毒的春兰幼苗。
Description
技术领域
本发明涉及一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法，具体涉及一种通过外植体脱分化、再分化高效获得春兰脱毒幼苗的方法。
背景介绍
春兰是中国兰花种系中一个重要的品种，春兰是地生兰常见的原种，一般生活在温带，在江浙一带种植较为广泛，春兰开花时有特殊的香气、花色丰富，花期一般2-4个月，形态秀丽，常作为盆栽，为室内布置之佳品，其根、叶、花均可入药，具有较高的观赏价值和药用价。
春兰的繁殖技术主要由三种，分株繁殖、种子繁殖和组织培养繁殖，分株繁殖速度非常慢，并且繁殖率低，周期长，易伤及母株；春兰种子极细，在自然条件下发芽率极低，很难满足规模化生产的需要。通过组织培养获得春兰幼苗目前越来越多被人们应用，例如申请号为CN201010127788.4的中国专利公开了“一种春兰种苗繁殖方法”，通过调整激素的浓度和根菌真菌的共生培养，有效利用兰科植物菌根共生促进生长的特点，缩短兰科植物组培苗的繁殖周期。真菌虽能够促进春兰生长，但真菌侵染春兰根部，可能会对春兰的品质造成一定的影响，因此需要寻找一条更好的春兰组织培养方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述春兰在繁殖过程中遇到的种种问题，提供了一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法。
为达到上述目的，本发明采取的技术方案为：一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法，包括春兰种子萌发、外植体选择与消毒处理、原球茎诱导、原球茎的保存与再分化诱导以及幼苗驯化培养，其特征在于：具体步骤如下：
a、春兰种子萌发
选择生活力较强的春兰种子若干，种子放置在孔径极细的聚丙烯筛网中，先用15%双氧水进行消毒处理5min，取出后用无菌水反复冲洗3次，然后再利用0.1%升汞溶液处理2min，最后将种子放在75%酒精中消毒处理30s，处理后用无菌水反复冲洗3遍；
处理后的种子播撒在MF固体培养基中，后将播种有春兰种子的培养基放在人工气候培养箱中培养，培养条件为相对湿度为65%，23℃，1500lux光照12h/d处理，1.5月后春兰种子萌发；
b、外植体选择与消毒处理
待春兰种子萌发后，生长到形成2个嫩叶后，在无菌操作环境中用解剖刀剪取春兰幼苗的嫩芽尖、茎尖或者根尖，剪下的嫩芽尖、茎尖或者根尖放在0.1%升汞溶液处理20s，后将其放在75%酒精中消毒处理10s，再用无菌水反复冲洗3遍；
c、原球茎诱导
冲洗后在无菌环境中用剪刀将嫩芽尖、茎尖或者根尖剪成2mm2大小的片状，加入到诱导原球茎培养基MY中，每个装有50ml的原球茎培养基MY中放入12个外植体碎片，接种后放在人工气候培养箱中培养，培养大约3个月后，培养基中出现黄色的球状紧密的细胞团，该细胞团即为春兰的胚性原球茎；所述诱导原球茎的培养条件为相对湿度为65%，23℃，200lux光照12h/d处理；
d、原球茎的保存
胚性原球茎形成后，将胚性原球茎取出放在干净无菌的塑料培养皿中，在无菌条件下用解剖刀将胚性原球茎分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎保存培养基MB中培养，培养条件为湿度设定为65%，23℃，200lux光照12h/d处理，每隔120天转接一次继续传代培养，提高原球茎的繁殖系数；所述原球茎保存培养基MB的配方同诱导原球茎形成培养基MY；
e、原球茎的再分化诱导
将胚性原球茎取出放在干净无菌的塑料培养皿中，在无菌条件下用解剖刀将胚性原球茎分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎再分化诱导培养基MZ1中诱导培养，大约培养3周左右，原球茎再分化形成新芽，然后再将形成新芽的原球茎转移到MZ2培养基中继续培养，诱导培养形成新根，培养3周开始形成新根，培养条件为为温度设定为65%，26℃，2000lux光照12h/d处理；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到4cm-6cm，具有5-6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1-2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。
所述MF培养基配方为NH4NO3 为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，生长素类物质为0.1-0.2mg/L，细胞分裂素类物质为0.1-0.2mg/L mg/L，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
所述诱导原球茎培养基MY的配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，生长素类物质为0.5-1.0mg/L，细胞分裂素类物质为1.5-2.0mg/L mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
所述原球茎再分化诱导培养基MZ1配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，细胞分裂素类物质为1.5-2.0mg/L mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
原球茎再分化诱导培养基MZ2配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，生长素类物质为0.5-1.0mg/L mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
所述生长素类物质为6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的任意一种或几种的组合。
所述细胞分裂素物质为玉米素、还有玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、二苯脲或KT-30中的任意一种或几种的组合。
本发明所述的一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法，与现有技术相比其有益效果为：1、先后通过15%双氧水、0.1%升汞和75%酒精消毒处理，经过春兰种子萌发培养基MF中的物质诱导，能够显著提高春兰种子的发芽率，发芽率可达43%以上，远远高于自然条件下的发芽率；2、通过改变原球茎诱导培养基MY中的生长素种类以及细胞分裂素的种类组合以及配比，能够有效地提高了原球茎形成的成功率，诱导外植体经过脱分化形成原球茎，诱导率可达85%以上；3、通过改变培养基的激素含量与配比以及培养条件，能够很好地保存原球茎，同时还能将原球茎切成小块，诱导增殖，在原球茎保存的同时，实现原球茎数量呈指数增长， 提高原球茎的繁殖系数，一般春兰一年的繁殖倍数均低于3倍，通过本发明方法能够使春兰的繁殖倍数提高到6倍以上；4、通过将诱导形成的原球茎移入到MZ1培养基中，将MZ1培养基培养基中只加入细胞分裂素，诱导原球茎形成新芽，培养一段时间后将长出新芽的原球茎转入MZ2培养基中，在MZ2培养基中只加入生长素，能够诱导原球茎形成新根，这样有目的性地诱导原球茎形成新芽、新根；5、将具有5-6个根的幼苗的组织培养瓶无菌瓶盖打开，拿到光照培养架上培养，再逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，最后将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，经过连续的炼苗处理，大大提高无菌苗移栽的成活率，成活率可达90%以上，同时又避免采用根菌真菌侵染，使春兰的品质不至于出现下降等现象。
具体实施方式
以下结合具体实施方式，对本发明进行详细说明。
实施例1
一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法，包括春兰种子萌发、外植体选择与消毒处理、原球茎诱导、原球茎的保存与再分化诱导以及幼苗驯化培养，具体步骤如下：
a、春兰种子萌发
选择生活力较强的春兰种子若干，种子放置在孔径极细的聚丙烯筛网中，先用15%双氧水进行消毒处理5min，取出后用无菌水反复冲洗3次，然后再利用0.1%升汞溶液处理2min，最后将种子放在75%酒精中消毒处理30s，处理后用无菌水反复冲洗3遍；
处理后的种子播撒在MF固体培养基中，后将播种有春兰种子的培养基放在人工气候培养箱中培养，培养条件为相对湿度为65%，23℃，1500lux光照12h/d处理，1.5月后春兰种子萌发，发芽率为45%；
b、外植体选择与消毒处理
待春兰种子萌发后，生长到形成2个嫩叶后，在无菌操作环境中用解剖刀剪取春兰幼苗的嫩芽尖、茎尖或者根尖，剪下的嫩芽尖、茎尖或者根尖放在0.1%升汞溶液处理20s，后将其放在75%酒精中消毒处理10s，再用无菌水反复冲洗3遍；
c、原球茎诱导
冲洗后在无菌环境中用剪刀将嫩芽尖、茎尖或者根尖剪成2mm2大小的片状，加入到诱导原球茎培养基MY中，每个装有50ml的原球茎培养基MY中放入12个外植体碎片，接种后放在人工气候培养箱中培养，培养大约3个月后，培养基中出现黄色的球状紧密的细胞团，该细胞团即为春兰的胚性原球茎；所述诱导原球茎的培养条件为相对湿度为65%，23℃，200lux光照12h/d处理；诱导率为91.1%；
d、原球茎的保存
胚性原球茎形成后，将胚性原球茎取出放在干净无菌的塑料培养皿中，在无菌条件下用解剖刀将胚性原球茎分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎保存培养基MB中培养，培养条件为湿度设定为65%，23℃，200lux光照12h/d处理，每隔120天转接一次继续传代培养，提高原球茎的繁殖系数；所述原球茎保存培养基MB的配方同诱导原球茎形成培养基MY；繁殖系数为6.5；
e、原球茎的再分化诱导
将胚性原球茎取出放在干净无菌的塑料培养皿中，在无菌条件下用解剖刀将胚性原球茎分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎再分化诱导培养基MZ1中诱导培养，大约培养3周左右，原球茎再分化形成新芽，然后再将形成新芽的原球茎转移到MZ2培养基中继续培养，诱导培养形成新根，培养3周开始形成新根，培养条件为为温度设定为65%，26℃，2000lux光照12h/d处理；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到5cm，具有6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1-2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态，成活率为93.2%。
所述MF培养基配方为NH4NO3 为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，6-苄氨基嘌呤0.05 mg/L，吲哚乙酸0.05 mg/L，萘乙酸0.05mg/L，玉米素0.05 mg/L，激动素0.05 mg/L，6-苄基腺嘌呤0.05 mg/L，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
所述诱导原球茎培养基MY的配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，6-苄氨基嘌呤0. 3 mg/L，吲哚乙酸0.2 mg/L、萘乙酸0.3mg/L，玉米素0.5 mg/L，激动素玉米素0.5 mg/L，6-苄基腺嘌呤玉米素0.5 mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5；
所述原球茎再分化诱导培养基MZ1配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，玉米素0.6 mg/L，激动素0.6 mg/L，6-苄基腺嘌呤0.6 mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5；
原球茎再分化诱导培养基MZ2配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，6-苄氨基嘌呤0.3 mg/L，吲哚乙酸0.3 mg/L，萘乙酸0.3mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
Claims (7)
1.一种高效获得春兰脱毒幼苗的方法，包括春兰种子萌发、外植体选择与消毒处理、原球茎诱导、原球茎的保存与再分化诱导以及幼苗驯化培养，其特征在于，具体步骤如下：
a、春兰种子萌发
选择生活力较强的春兰种子若干，种子放置在孔径极细的聚丙烯筛网中，先用15%双氧水进行消毒处理5min，取出后用无菌水反复冲洗3次，然后再利用0.1%升汞溶液处理2min，最后将种子放在75%酒精中消毒处理30s，处理后用无菌水反复冲洗3遍；
处理后的种子播撒在MF固体培养基中，后将播种有春兰种子的培养基放在人工气候培养箱中培养，培养条件为相对湿度为65%，23℃，1500lux光照12h/d处理，1.5月后春兰种子萌发；
b、外植体选择与消毒处理
待春兰种子萌发后，生长到形成2个嫩叶后，在无菌操作环境中用解剖刀剪取春兰幼苗的嫩芽尖、茎尖或者根尖，剪下的嫩芽尖、茎尖或者根尖放在0.1%升汞溶液处理20s，后将其放在75%酒精中消毒处理10s，再用无菌水反复冲洗3遍；
c、原球茎诱导
冲洗后在无菌环境中用剪刀将嫩芽尖、茎尖或者根尖剪成2mm2大小的片状，加入到诱导原球茎培养基MY中，每个装有50ml的原球茎培养基MY中放入12个外植体碎片，接种后放在人工气候培养箱中培养，培养大约3个月后，培养基中出现黄色的球状紧密的细胞团，该细胞团即为春兰的胚性原球茎；所述诱导原球茎的培养条件为相对湿度为65%，23℃，200lux光照12h/d处理；
d、原球茎的保存
胚性原球茎形成后，将胚性原球茎取出放在干净无菌的塑料培养皿中，在无菌条件下用解剖刀将胚性原球茎分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎保存培养基MB中培养，培养条件为湿度设定为65%，23℃，200lux光照12h/d处理，每隔120天转接一次继续传代培养，提高原球茎的繁殖系数；所述原球茎保存培养基MB的配方同诱导原球茎形成培养基MY；
e、原球茎的再分化诱导
将胚性原球茎取出放在干净无菌的塑料培养皿中，在无菌条件下用解剖刀将胚性原球茎分切成1mm2大小的小块，接种在原球茎再分化诱导培养基MZ1中诱导培养，大约培养3周左右，原球茎再分化形成新芽，然后再将形成新芽的原球茎转移到MZ2培养基中继续培养，诱导培养形成新根，培养3周开始形成新根，培养条件为为温度设定为65%，26℃，2000lux光照12h/d处理；
f、幼苗驯化培养
当幼苗株高长到4cm-6cm，具有5-6个根时，将植物组织培养瓶的无菌瓶盖打开，将组织培养瓶从人工气候培养箱中拿出放在光照培养架上培养，逐渐将室内恒温空调关闭，连续驯化一周左右，然后将组培幼苗从组培瓶中移出，转移到灭菌后的百合营养花卉培养土中，移至室外遮阳网下生长，处理1-2周后，将生长健壮的百合苗移栽到土壤中，定期浇水、施肥处理，关注植株的生长状态。
2.根据权利要求1所述的高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：所述MF培养基配方为NH4NO3 为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，生长素类物质为0.1-0.2mg/L，细胞分裂素类物质为0.1-0.2mg/L mg/L，蔗糖30g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
3.根据权利要求1所述的高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：所述诱导原球茎培养基MY的配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，生长素类物质为0.5-1.0mg/L，细胞分裂素类物质为1.5-2.0mg/L mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
4.根据权利要求1所述的高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：所述原球茎再分化诱导培养基MZ1配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，细胞分裂素类物质为1.5-2.0mg/L mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
5.根据权利要求1所述的高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：原球茎再分化诱导培养基MZ2配方为500 mg/L，KNO3为400 mg/L，CaCl2·2H2O为150 mg/L，MgSO4·7H2O为200 mg/L，KH2PO4为80mg/L，KI为0.5 mg/L，H3BO3为3mg/L，MnSO4·4H2O为10mg/L，ZnSO4·7H2O为4 mg/L，Na2MoO4·2H2O为0.1 mg/L，CuSO4·5H2O为0.01 mg/L，CoCl2·6H2O为0.01mg/L，FeSO4·7H2O为14mg/L，Na2-EDTA·2H2O为10mg/L，肌醇100 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，维生素C为0.5 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，活性炭10g/L，烂树叶5g/L，椰子汁10ml/L，生长素类物质为0.5-1.0mg/L mg/L，蔗糖20g/L，琼脂条10g/L，pH为5.3-5.5。
6.根据权利要求2-5任一项所述的高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：所述生长素类物质为6-苄氨基嘌呤、吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的任意一种或几种的组合。
7.根据权利要求2-5任一项所述的高效获得春兰脱毒幼苗的方法，其特征在于：所述细胞分裂素物质为玉米素、还有玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、二苯脲或KT-30中的任意一种或几种的组合。
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