CN101766121B - 一种小报春的花药培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种小报春的花药培养方法，包括外植体的选择、外植体的消毒与接种、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化、组培苗生根培养与移栽，其中，所述愈伤组织诱导与增殖的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述生根培养基为MS，pH为5.9～6.0。利用本发明方法得到的幼苗，成长良好，一致性强，适应性较强，病虫害少，易于管理，易于规模化生产。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织培养，具体地说，涉及小报春(Primulaforbesii Franch.)的花药培养方法。
背景技术
小报春(Primula forbesii Franch.)为我国特有的报春花科报春花属二年生草本植物，原产海拔1500～2000m的我国云南地区。小报春(Primula forbesii Franch.)是典型的自交不亲和(self-incompatibility)植物，长期的异花授粉使其后代性状分离广泛，难以稳定遗传。传统的杂交方法费时费力，育种周期较长。
为了缩短育种进程，尽快将优异的报春资源进行纯化，稳定。需要采用花药培养的方法获得小报春单倍体，形成一套完整的花药培养技术体系，为今后的单倍体加倍获得双单倍体的纯合种质奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种小报春(Primula forbesii Franch.)的花药培养方法，以获得小报春单倍体植株，通过单倍体育种途径可快速获得纯合材料，增加有益性状的选择几率，加快育种进程。
本发明提供一种小报春的花药培养方法，包括外植体的选择、外植体的消毒与接种、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化、组培苗生根培养与移栽，其中，所述愈伤组织诱导与增殖的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述生根培养基为MS，pH为5.9～6.0。
所述的外植体为小报春稍露色的花药；应选择小孢子发育时期大多处于单核靠边期的花药进行培养，此时从外观上花蕾明显膨大，花瓣微露出花萼，长度在4.0-5.0mm之间。
所述愈伤组织诱导与增殖时，光照条件为人工辅助光1500～2000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
所述愈伤组织分化时，光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
所述生根培养时，光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
所述组培苗的移栽温度为18～25℃。
所述外植体采用流水下冲洗1h，70％(体积比)乙醇进行表面消毒，消毒时间为30s，无菌水冲洗3～5次后，2％次氯酸钠(重量比)进行表面消毒，消毒时间控制在8～10min，无菌水冲洗3～5次。
所述组培苗经在生根培养基中培养2～3周后，炼苗3～4天移栽至温室细草炭土中培养。
本发明所述的小报春的花药培养方法，具体为：选取小报春的稍露色、长度在4.0～5.0mm之间的花药为外植体，经流水下冲洗1h，70％乙醇进行表面消毒，消毒时间为30s，无菌水冲洗3～5次后，2％次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在8～10min，无菌水冲洗3-5次；接种到花药愈伤组织诱导培养基，MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；光照条件为人工辅助光1500～2000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d；之后移至相同培养基进行增殖，继代2～3次后转入愈伤组织分化培养基，MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d；将分化的组培苗转入生根培养基MS，pH为5.9～6.0；光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d；生根培养2～3周，炼苗3～4天后，移至细草炭土中培养，保持湿度高于80％，每天喷水2～3次。
组培苗移栽时的温度应控制在18～25℃之间，过高或过低都不利于组培苗的成活，夏季不宜进行组培苗的移栽。
一般来说，盛花期的小报春着花量很大，每株植株可以产生200朵以上的花朵数量，因此花药的取材十分充足。通过小报春(Primulaforbesii Franch.)花药培养再生的组培苗生长良好。
与传统技术相比，本发明小报春(Primula forbesii Franch.)的花药培养方法具有以下有益效果：
1)建立了一种小报春(Primula forbesii Franch.)的花药培养方法，相比传统的自交获得纯合系的方法比，后者至少需要3-5年才可获得纯系，而花药培养摆脱了季节与气候的限制因素，只需10-12个月就可获得大批量的单倍体，大大缩短了育种进程，为今后的单倍体直接加倍成纯合双单倍体奠定基础；
2)本发明方法中，生根率为70％左右，移栽成活率达到80％以上。通过组织培养方法得到的幼苗，成长良好，一致性强，适应性较强，病虫害少，易于管理，易于规模化生产；
3)利用花药培养优质的报春花资源，可以保持该优良种质的特性不变，之后直接染色体加倍后即可形成具有特异性、一致性、稳定性的新品种。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
小报春(Primula forbesii Franch.)小孢子发育时期的观察。
花期时采集不同大小的花蕾，分别测量花蕾长，观察花蕾发育时期等指标。用镊子剥去萼片、花瓣，剥出花药置于载玻片上，加一小滴卡宝品红，用镊子捣碎，去除残渣，盖上盖玻片，显微镜镜检，总结花蕾长度、外观等与小孢子发育时期的关系。经过试验观察发现，小报春(Primula forbesii Franch.)小孢子发育可分为4个时期，分别为四分体时期、单核中期、单核靠边期和成熟期。花蕾不饱满，长度小于3.0mm，此时萼片包裹着花冠的小孢子发育处在四分体时期；花蕾长在3.0～4.0mm，饱满，花萼与花瓣等长的花药小孢子发育处于单核中期；花蕾明显膨大，花瓣微露出花萼，长度在4.0～5.0mm之间的花蕾，其小孢子发育时期大多处于单核靠边期，满足花药培养的发育条件。花蕾长度大于5.0mm，花萼充分膨大，花瓣明显露出花萼的花药小孢子处于成熟期。
实施例2
以小报春(Primula forbesii Franch.)小孢子发育时期为单核靠边期的花药为外植体进行愈伤组织诱导培养。探讨愈伤组织诱导的最佳基本培养基以及激素浓度最佳配比。
天气晴朗、干燥的上午9时左右，采集温室内生长的单核靠边期的花蕾备用。先用70％的酒精浸泡30s，然后用2％的次氯酸钠溶液消毒10分钟，用无菌水冲洗3～4次。在超净工作台上用小镊子剥出花药，去除花丝，尽量避免花药受到伤害，接种于培养皿中，用保险膜封口。每个培养皿接种20个花药，每个处理接种5个培养皿。
选取MS、B5、N6三种培养基作为小报春花药培养的基本培养基。加入不同浓度配比的6-BA和2，4-D激素，以愈伤组织诱导率为依据选取最佳激素配比。6-BA的浓度设为1.0mg/L和2.0mg/L两个梯度，2，4-D的浓度设为0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L四个梯度，采用三因素完全随机试验设计，组合了24组培养基配方。30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0。光照条件为人工辅助光1500～2000Lux。温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
不同的基本培养基以及不同激素浓度配比影响着小报春(Primulaforbesii Franch.)花药愈伤组织的形成。接种60天左右，花药上开始形成浅黄绿色的愈伤组织，将产生愈伤组织的花药转入相同培养基，愈伤组织逐渐增大。经统计证明，MS、B5、N6的愈伤诱导率分别为1.2％、0.3％、0.5％。可以看出，MS是小报春花药培养的最为适合的基本培养基。MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L的培养基上，愈伤组织诱导率最大，为2.3％，该激素浓度为小报春花药愈伤组织诱导的最佳培养激素配比。
实施例3
小报春(Primula forbesii Franch.)愈伤组织分化培养基的筛选。
将增殖后的愈伤组织转入分化培养基中。分化培养基是以MS为基本培养基，以6-BA和NAA为激素种类，6-BA的浓度梯度为0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L，NAA的浓度梯度为0.01mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L、0.5mg/L，组合了10种分化培养基，探讨其对小报春愈伤组织分化的影响。40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0。光照条件为人工辅助光2000～3000Lux。温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
愈伤组织接入分化培养基后40～60d，6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L的分化培养基上分化出腋芽，不断抽出新叶，并在愈伤上不断大量形成不定芽，后长出叶片；而6-BA 1.0mg/L+NAA 0.5mg/L、6-BA2.0mg/L+NAA 0.1mg/L以及6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L这三种培养基上均分化出根，而抑制了芽的分化，最终组织变褐死亡。
实施例4
小报春(Primula forbesii Franch.)花药培养组培苗的生根培养。
当不定芽在分化培养基上长出3-4片真叶时，将其从愈伤组织上切除，转入生根培养基上，配方为MS、MS+IBA(0.05mg/L、0.1mg/L、0.2mg/L)，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0。光照条件为人工辅助光2000～3000Lux。温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。各培养基均可使组培苗生根，观察发现，随着IBA浓度的增大，根逐渐变得粗短，MS培养基中的生根量最大且须根长而密集，生根率为70％左右，是花药培养组培苗的最佳生根培养基。
实施例5
小报春(Primula forbesii Franch.)花药培养组培苗的移栽。
生根培养两周以后，待组培苗平均每株生根4～5条，根长达到1cm时，即可开始为移栽作准备。炼苗是组培苗移栽前的过渡，可以帮助组培苗逐步适应外界环境，使组培苗更健壮，叶色更加深绿，从而提高成活率。小报春(Primula forbesii Franch.)组培苗炼苗3～4天后，移栽至温室细草炭土中，草炭土提前铺满穴盘，清水浸透；组培苗移栽后保持湿度80％以上，覆薄膜并每天喷水2～3次，2周以后即可逐步进行正常管理，移栽成活率达到80％以上。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (9)
1.一种小报春的花药培养方法，包括外植体的选择、外植体的消毒与接种、愈伤组织诱导与增殖、愈伤组织分化、组培苗生根培养与移栽，其特征在于，所述愈伤组织诱导与增殖的培养基为MS+6-BA1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述愈伤组织分化培养基为MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；所述生根培养基为MS，pH为5.9～6.0。
2.根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述的外植体为小报春稍露色的花药，长度在4.0～5.0mm之间，此时的大部分小孢子的发育时期为单核靠边期。
3.根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导与增殖时，光照条件为人工辅助光1500～2000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
4.根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述愈伤组织分化时，光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
5.根据权利要求1所述的花药培养方法，其特征在于，所述生根培养时，光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，所述组培苗的移栽温度为18～25℃。
7.根据权利要求1～5任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，所述外植体采用流水下冲洗1h，70％乙醇进行表面消毒，消毒时间为30s，无菌水冲洗3～5次后，2％次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在8～10min，无菌水冲洗3～5次。
8.根据权利要求1～5任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，所述组培苗经在生根培养基中培养2～3周后，炼苗3～4天移栽至温室细草炭土中培养。
9.根据权利要求1～5任意一项所述的花药培养方法，其特征在于，选小报春的稍露色、长度在4.0～5.0mm之间的花药为外植体，经流水下冲洗1h，70％乙醇进行表面消毒，消毒时间为30s，无菌水冲洗3～5次后，2％次氯酸钠进行表面消毒，消毒时间控制在8～10min，无菌水冲洗3-5次；接种到花药愈伤组织诱导培养基，MS+6-BA 1.0mg/L+2，4-D 0.5mg/L，30g/L蔗糖，6g/L琼脂，pH为5.9～6.0；光照条件为人工辅助光1500～2000 Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d；之后移至相同培养基进行增殖，继代2～3次后转入愈伤组织分化培养基，MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.01mg/L，40g/L蔗糖，7g/L琼脂，pH为5.9～6.0；光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d；将分化的组培苗转入生根培养基MS，pH为5.9～6.0；光照条件为人工辅助光2000～3000Lux；温度为24～26℃，光照时间12～14h/d；生根培养2～3周，炼苗3～4天后，移至细草炭土中培养，保持湿度高于80％，每天喷水2～3次。
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