CN103004609B - 白花灯台报春的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了珍稀濒危植物白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）的组培快繁方法。选取白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）的茎尖为外植体，经丛生芽诱导、增殖并生根培养和试管苗移栽。该组培方法最主要的特点为，在培育过程中，突破了传统的组培方式，精简了流程，采用增殖生根一体培养基，极大的缩短了繁殖时间，使用该方法可达到一个培养周期一个茎尖诱导产生约5丛，每丛10个左右的新芽，生根率达100%，移栽成活率95%以上，极大地提高了白花灯台报春的繁殖能力，为珍稀濒危植物白花灯台报春的种质资源保存和规模化生产提供了技术支撑。
Description
技术领域：
本发明属于植物生物技术中植物组织培养方法，具体地，涉及白花灯台报春的组织培养快繁方法。
背景技术：
白花灯台报春(Primula beesiana var. leucantha (Balf. f.et Forr.) Fletcher) 属于报春花科报春花属植物，花白色，其属于霞红灯台报春(Primula beesiana Forr.) 的一个变种，主要分布于云南丽江玉龙雪山及四川省的木里县，通常与霞红灯台报春混生在一起，在较大的霞红灯台报春群落中偶见，更确切地说其是霞红灯台报春的一个变型。报春花属植物花一般为粉红色、紫色或黄色，白色花种类在野外及已培育出来的品种中非常少见，因而白花灯台报春在园林园艺应用上为不可多得的报春花属植物。据观察发现，虽然白花灯台报春在野外能够正常开花，但由于其在野外的数量非常稀少，生殖隔离严重，其与一起混生的霞红灯台报春之间又没有合适的共有传粉昆虫，因而在野外很少结能育的果实。种子的缺乏给本种的繁育带来了困难，进而也使本种在野外的种群数量越来越少，目前已趋于濒危的边缘。报春花属植物组培相关方面虽有报道，如中国专利申请号为200710064057.8的桔红灯台报春的组培快繁方法、申请号为200710064055.9的海仙报春的组培快繁方法以及申请号为200710064056.3的滇北球花报春的组培快繁方法，虽然增殖强度也较大，但三者增殖与生根采用不同的培养基。迄今，还没有白花灯台报春生物技术方法繁殖的相关研究报道。
为了使白花灯台报春(Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher)在野外繁殖种源缺少的情况下，能成功进行繁殖使之能够保存和可持续利用，需要研究该种的组织培养，并形成一套专门的组织培养繁殖技术体系。
发明内容：
本发明的目的是提供濒危植物白花灯台报春(Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher)的组织培养繁育方法，使之在存在生殖隔离不能有效产生能育种子的情况下能够繁衍，使该物种的种质资源保存能够得到保障，同时采用了增殖生根一体培养基，缩短离体培养时间，提高生根率和幼苗移栽率，为濒危物种白花灯台报春的可持续利用奠定组培种苗繁育基础。
为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：
白花灯台报春的组培繁殖方法，包括选择外植体、消毒、丛生芽诱导，增殖生根培养，试管苗移栽步骤。外植体取白花灯台报春的茎尖，丛芽诱导培养基为MS+1.0mg/l ZT+1.0 KT+0.2mg/l NAA，pH5.8，丛芽增殖及生根转接入MS+1.5mg/l 6BA+1.0mg/l ZT+0.2mg/l NAA，pH5.8中进行，以上培养过程均在温度20-25℃，湿度为30%-45%，光照条件为自然光100-150LUX+1500-2000LUX下进行。
所述外植体消毒先用自来水滴加洗洁精2-3滴浸泡2-3分钟，用流动的自来水冲洗10分钟，然后用75%酒精进行表面消毒后用无菌水冲洗3-5遍，再用0.1%升汞溶液进行消毒7-8分钟，在无菌条件下用无菌水反复冲洗3-5遍，用滤纸吸干表面水分。
所述丛芽诱导和增殖及生根培养的温度为20-25℃，湿度30-45%。
所述丛芽诱导和增殖及生根培养的光照条件为自然光100-150LUX+1500-2000LUX。
移栽是生根组培苗在培养瓶内培养30天以后，在炼苗棚驯化15-20天，再移栽于温室大棚。
移栽基质为珍珠岩:腐殖土:红土=1:1:2，pH为5.5-6.0。
移栽在早上8-11点，温度为18-25℃下进行。
本发明的方法可具体描述为：外植体选取白花灯台报春的茎尖，用自来水滴加洗洁精2-3滴浸泡2-3分钟，再用流动的自来水冲洗10分钟，之后用75%酒精进行表面消毒后用无菌水冲洗3-5遍，用0.1%升汞溶液进行消毒7-8分钟，在无菌条件下用无菌水反复冲洗3-5遍，用滤纸吸干表面水分，切去损伤组织，将其接种至诱导培养基MS+1.0mg/l ZT+1.0 KT+0.2mg/l NAA，pH5.8上；丛芽增殖及生根转接入MS+1.5mg/l 6BA+1.0mg/l ZT+0.2mg/l NAA，pH5.8中进行；以上培养过程均在温度20-25℃，湿度为30%-45%，光照条件为自然光100-150LUX+1500-2000LUX下进行；以上培养基中均添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L；生根苗大棚炼苗15-20天后，移栽于基质为珍珠岩:腐殖土:红土=1:1:2，pH为5.5-6.0，湿度50-60%的大棚内，每天早晚各喷水一次。
本发明技术方案的提出是基于下述的研究基础：白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）是英国植物学家I. B. Balfour以及G. Forrest 1920年根据采自云南丽江的标本所定的一个新种，后1941 H. R. Fletcher根据其野外生活特性及与霞红灯台报春的特征对比定为霞红灯台报春的变种。本种的分布范围非常狭窄，目前为止只在云南丽江的玉龙雪山以及四川的木里地区有该种分布记载，且在国内外相关标本馆也未有该物种大范围分布记载。本发明人2004年以及2005年在云南丽江玉龙雪山发现了五株个体并引种到了丽江高山植物园与霞红灯台报春混合栽培在一起，经两年实验与研究，本种植物存在很强的生殖隔离，通过有性繁殖方式很难得到可育的种子，这在很大程度上影响到了对本种的种质资源保存以及可持续开发利用，且该颜色报春花属植物为不可多得的园艺材料，为了能有效地保存这些稀有的植物个体，急需通过离体繁殖的方式来对其进行繁殖，以保存该物种。
与现有技术相比，本发明的组培方法其优益性在于：
1、建立了有效的白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）组培快繁方法，解决了白花灯台报春缺乏种子不能繁育可能导致灭绝的危险，为该物种的繁殖、种质资源保存以及可持续开发利用提供保障。
2、通过组培快繁得到的幼苗，成苗容易，一致性强，生长健壮,叶色浓绿，病虫害少，易于管理。
3、利用组培快繁方法繁殖的白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）不受季节限制，任何时候都可以进行繁殖。
4、本发明的白花灯台报春组培方法，使用了增殖生根一体培养基，在报春花组培中还未见有报道，该培养基极大的缩短了培养时间，节约了生产成本。现有技术中，申请号为200710064057.8桔红灯台报春的组培快繁方法、申请号为200710064055.9海仙报春的组培快繁方法以及申请号为200710064056.3滇北球花报春的组培快繁方法，虽然增殖强度也较大，但三者增殖与生根是不同的培养基，本发明优点在于增殖与生根采用一体培养基，精简了流程、缩短了培育时间同时节约了成本。
本发明的组培快繁方法繁育的白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）在1个培养周期内增殖，每个顶芽可增殖5丛，每丛10个芽左右，生根率为100%，移栽成活率为95%以上，极大地提高了白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）的繁殖系数，阻止了由于生殖隔离缺乏种子导致该物种灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。
具体实施方式：
以下实施例用来进一步说明本发明的实质性内容。根据本发明技术方案和实施例的描述，也许同领域技术人员在本发明的基础上还可以对本发明技术方案进行一些修改和改进。因此，在不偏离本发明主要技术方案基础上所做的修改和改进，均应属于本发明所要求保护的范围。
实施例1：
以白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf.f. et Forr.) Fletcher）的茎尖为外植体进行初培养、增殖与生根培养，选取白花灯台报春的茎尖，放入自来水加2滴洗洁精浸泡2分钟，用流动的自来水反复冲洗10分钟清除表面杂质，然后再用75%酒精进行表面消毒后用无菌水冲洗5遍，用0.1%升汞溶液进行消毒7分钟，在无菌条件下用无菌水反复冲洗3遍，用滤纸吸干表面水分，切去损伤组织，将茎尖接种至丛芽诱导培养基MS+1.0mg/l ZT+1.0KT+0.2mg/lNAA， pH5.8中，在湿度为40%，温度在20℃下进行启动培养，每瓶接种3个；7天后长出愈伤组织有丛芽分化后再转接在增殖生根培养基MS+1.5mg/l 6BA+1.0mg/l ZT+0.2mg/l NAA, pH5.8上，每瓶转接3个，培养30天，培养室的光照条件为自然光100LUX+人工辅助光1500LUX，光照时间12小时/天，湿度为40%，温度20℃。
当茎尖接种到启动培养基上，7天开始长愈伤组织，15天左右开始有丛芽的分化，后转入增殖生根培养基，统计结果显示在增殖培养基上接种30天，平均每个茎尖能分化出50个左右的丛芽，而且芽增殖及生根为同一培养基，无需单独生根，达到了缩短繁殖时间，简化培养方式的目的。此外，温度对丛芽的诱导和组培苗的生长和生根也起到了非常关键的作用，温度在20℃，光照为自然光100LUX+人工辅助光1500LUX，光照时间12小时/天，有利于丛芽分化，叶色浓绿，生长健壮，在这样的培养条件下，试管苗的增殖系数为1:50，生根率为100%，极大地提高了白花灯台报春的繁殖系数。
当每株白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）在瓶内生根7-8条，根长为2cm以上时可作移栽准备。首先连瓶盖在大棚内炼苗12天后，拧松瓶盖但不开盖炼苗5天；同时，在温室准备移栽准备，移栽基质珍珠岩:腐殖土:红土=1:1:2，pH为5.5。将炼苗17天的组培苗移栽于温室内的移苗盘内，浇定根水，移栽时间在早上8-9点进行，温度在18℃，覆薄膜并每天浇水2次，注意通风，保持炼苗棚湿度在50%左右，10天以后即可揭掉薄膜，进行正常管理。移栽成活率为98%
实施例2：
以白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf.f. et Forr.) Fletcher）的茎尖为外植体进行初培养、增殖与生根培养，选取白花灯台报春的茎尖，放入自来水加3滴洗洁精浸泡2分钟，用流动的自来水反复冲洗10分钟清除表面杂质，然后再用75%酒精进行表面消毒后用无菌水冲洗4遍，用0.1%升汞溶液进行消毒7分钟，在无菌条件下用无菌水反复冲洗3遍，用滤纸吸干表面水分，切去损伤组织，将茎尖接种至丛芽诱导培养基MS+1.0mg/l ZT+1.0KT+0.2mg/lNAA，pH5.8，进行启动培养，每瓶接种4个；7天后长出愈伤组织有丛芽分化后再转接在增殖生根培养基MS+1.5mg/l 6BA+1.0mg/l ZT+0.2mg/l NAA, pH5.8上，每瓶转接3个，培养30天，培养室的湿度为35%，温度为25℃，光照条件为自然光150LUX+人工辅助光2000LUX，光照时间12小时/天。
当茎尖接种到启动培养基上，7天开始长愈伤组织，15天左右开始有丛芽的分化，后转入增殖生根培养基，统计结果显示在增殖培养基上接种30天左右，平均每个茎尖能分化出50个左右的丛芽，而且芽增殖及生根为同一培养基，无需单独生根，达到了缩短繁殖时间，简化培养方式的目的。此外，温度对丛芽的诱导和组培苗的生长和生根也起到了非常关键的作用，温度在25℃，光照为自然光150LUX+人工辅助光2000LUX，光照时间12小时/天，有利于丛芽分化，叶色浓绿，生长健壮，在这样的培养条件下，试管苗的增殖系数为1：50，生根率为100%，极大地提高了白花灯台报春的繁殖系数。
当每株白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）在瓶内生根7-8条，根长为2cm以上时可作移栽准备。首先连瓶盖在大棚内炼苗15天后，拧松瓶盖但不开盖炼苗4天；同时，在温室准备移栽准备，移栽基质珍珠岩：腐殖土：红土=1:1:2，pH为6.0。将炼苗19天的组培苗移栽于温室内的移苗盘内，浇定根水，移栽时间在早上9-10点进行，温度在20℃，覆薄膜并每天浇水1次，注意通风，保持炼苗棚湿度在60%左右，10天以后即可揭掉薄膜，进行正常管理，移栽成活率为97%。
实施例3：
以白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf.f. et Forr.) Fletcher）的茎尖为外植体进行初培养、增殖与生根培养，选取白花灯台报春的茎尖，放入自来水加3滴洗洁精浸泡3分钟，用流动的自来水反复冲洗10分钟清除表面杂质，然后再用75%酒精进行表面消毒后用无菌水冲洗5遍，用0.1%升汞溶液进行消毒8分钟，在无菌条件下用无菌水反复冲洗5遍，用滤纸吸干表面水分，切去损伤组织，将茎尖接种至丛芽诱导培养基MS+1.0mg/l ZT+1.0KT+0.2mg/lNAA，pH5.8，进行启动培养，每瓶接种4个；7天后长出愈伤组织有丛芽分化后后再转接在增殖生根培养基MS+1.5mg/l 6BA+1.0mg/l ZT+0.2mg/l NAA, pH5.8上，每瓶转接3个，培养30天，培养室的湿度为45%，温度为23℃，光照条件为自然光120LUX+人工辅助光1800LUX，光照时间12小时/天。
当茎尖接种到启动培养基上，7天开始长愈伤组织，15天左右开始有丛芽的分化，后转入增殖生根培养基，统计结果显示在增殖培养基上接种30天左右，平均每个茎尖能分化出50个左右的丛芽，而且芽增殖及生根为同一培养基，无需单独生根，达到了缩短繁殖时间，简化培养方式的目的。此外，温度对丛芽的诱导和组培苗的生长和生根也起到了非常关键的作用，温度在23℃，光照为自然光120LUX+人工辅助光1800LUX，光照时间12小时/天，有利于丛芽分化，叶色浓绿，生长健壮，在这样的培养条件下，试管苗的增殖系数为1：50，生根率为100%，极大地提高了白花灯台报春的繁殖系数。
当每株白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher）在瓶内生根7-8条，根长为2cm以上时可作移栽准备。首先连瓶盖在大棚内炼苗14天后，拧松瓶盖但不开盖炼苗6天；同时，在温室准备移栽准备，移栽基质珍珠岩：腐殖土：红土=1:1:2，pH为5.8。将炼苗20天的组培苗移栽于温室内的移苗盘内，浇定根水，移栽时间在早上10-11点进行，温度在25℃，覆薄膜并每天浇水2次，注意通风，保持炼苗棚湿度在60%左右，10天以后即可揭掉薄膜，进行正常管理。移栽成活率为95%。
通过上述本发明的组培快繁方法，繁育的白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf. f. et Forr.) Fletcher），一个培养周期一个茎尖诱导产生约5丛,每丛10个左右的新芽，生根率为100%，移栽成活率为95%以上，极大地提高了白花灯台报春（Primula beesiana var. leucantha (Balf.f. et Forr.) Fletcher）的繁殖系数，阻止了由于生殖隔离缺乏种子导致该物种灭绝的危险，为该物种的保存和可持续利用提供了非常有效的繁殖方法。
Claims (1)
1.白花灯台报春的组培繁殖方法，包括选择外植体、消毒、丛芽诱导、增殖并生根培养、试管苗移栽步骤，其特征在于外植体选取白花灯台报春的茎尖，用自来水滴加洗洁精2-3滴浸泡2-3分钟，再用流动的自来水冲洗10分钟，之后用75%酒精进行表面消毒后用无菌水冲洗3-5遍，用0.1%升汞溶液进行消毒7-8分钟，在无菌条件下用无菌水反复冲洗3-5遍，用滤纸吸干表面水分，切去损伤组织，将其接种至诱导培养基MS+1.0mg/l ZT+1.0mg/l KT+0.2mg/l NAA，pH5.8；丛芽增殖及生根转接入MS+1.5mg/l6-BA+1.0mg/l ZT+0.2mg/l NAA，pH5.8中进行；以上培养过程均在温度20-25℃，湿度为30%-45%，光照条件为自然光100-150LUX+人工辅助光1500-2000LUX下进行；以上培养基中均添加蔗糖30g/L，琼脂7g/L；生根苗大棚炼苗15-20天后，移栽于基质为珍珠岩:腐殖土:红土=1:1:2，pH为5.5-6.0，湿度50-60%的大棚内，每天早晚各喷水一次。
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