CN101965796B - 一种岩生报春组织培养与快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种岩生报春(Primula saxatilis)组织培养与快速繁殖方法。本发明选取北京密云雾灵山采集的岩生报春野生种子为外植体，其中种子经过消毒后进行接种培养，萌发形成岩生报春无菌苗。将无菌苗上的腋芽进行增殖，经过丛生芽诱导、继代培养进行快速繁殖；或诱导丛生芽的叶片或叶柄产生愈伤组织、进行愈伤组织的增殖和不定芽分化进行快速繁殖。本发明提供的的岩生报春组织培养和快速繁殖方法，大大提高了岩生报春的育苗生产能力，缩短了成苗时间又降低了成本，为岩生报春优良单株的保存提供了技术保障。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体地说，涉及一种岩生报春(Primula saxatilis)的组织培养和快速繁殖的方法。
背景技术
岩生报春为报春花科报春属指叶报春组植物，被列入《中国植物红皮书(第二版)》以及《河北省重点保护野生植物名录》。早春开花，花粉红色具有较好的观赏性，在北京露地能顺利越夏越冬，是十分重要的观赏花卉和育种材料。岩生报春是多年生草本花卉，一般采用播种和分株繁殖，但以播种繁殖为主，一般于9月初播种，经过营养生长于次年5月份进入盛花期，从播种至开花时间为8个月，生长周期长，且繁殖系数低。同时，这些方法远不能满足生产需求，且成苗不整齐。
组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，报春花属已有不少种进行了组织培养的相关报道，但是岩生报春的组织培养在国内外均没有相关研究与报道，因此需要研究岩生报春的组织培养，并形成一套专门的快繁技术体系。
发明内容
本发明的目的是提供一种岩生报春的组织培养与快速繁殖方法，提高岩生报春的繁殖系数、生根率及移栽成活率。
为了实现本发明目的，本发明的一种岩生报春组织培养和快速繁殖方法，包括：种子表面消毒后进行接种，获得无菌苗后，接种腋芽进行丛生芽的诱导，将获得的不定芽进行生根培养和移栽。
其中，所述的种子消毒包括：用清水浸泡种子24h，在超净工作台内先用75％乙醇消毒15～30s，优选为15s，无菌水冲洗5～6次，优选5次，再用质量比为0.1％的升汞溶液消毒6～8min，优选为6min，无菌水洗涤5～6次，优选为5次，接种至MS或者1/2MS培养基中，优选为1/2MS培养基，pH为5.9，光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux。1～1.5个月后，将种子萌发获得的无菌苗移至MS培养基中继代，pH为5.9，光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux。
其中，所述的丛生芽诱导具体步骤为：取无菌苗腋芽接种在丛生芽诱导培养基MS+2.5mg/l 6-BA+1.0mg/l NAA中，pH为5.9，光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux；之后移至相同培养基增殖，继代2～3次。
其中，生根培养和试管苗移栽的具体步骤为：将不定芽接种至生根培养基进行生根。生根培养基为MS或MS+0.1～0.2mg/l NAA，优选为MS+0.1mg/l NAA，pH为5.9～6.0，光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光2500～3000Lux，光照时间为12h/d；温度保持在23～25℃之间。生根培养2～3周，炼苗4～5天后，移至细草炭土中培养，保持湿度高于80％，每天喷水2～3次。
本发明提供的岩生报春组织培养和快速繁殖方法，还包括在所述丛生芽的诱导后将丛生芽的叶片或叶柄接种至愈伤组织诱导培养基上，诱导愈伤组织，并将愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基中进行增殖培养，将增殖后的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基中培养，分化出不定芽。
其中所述的愈伤组织诱导培养基MS+1～2.5mg/l 6-BA+0.5～1.5mg/l NAA，优选为MS+1.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA中，pH为5.8～5.9，培养的光照条件为先暗培养20d，之后转为光照培养，自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux，光照时间为12h/d。
其中所述的愈伤组织增殖培养基为MS+0.5mg/l TDZ+0.5～1.5mg/l 2，4-D中，优选为MS+0.5mg/l TDZ+0.5mg/l 2，4-D，pH为5.8～5.9。其中所述的愈伤组织优选为诱导的初始黄绿色的愈伤组织。
其中，所述的愈伤组织分化培养基MS+10mg/l 6-BA+2mg/lNAA上。所述的用于不定芽的愈伤组织优选为黄绿色块状、质地疏密适中的愈伤组织。
本发明的组织培养与快速繁殖方法繁育岩生报春，2个月内增殖系数达到3～4，生根率达95％以上，移栽成活率为100％，极大地提高了岩生报春的繁殖系数，缩短成苗周期，又可降低成本，为今后大面积园林应用和工厂化育苗提供了非常有效的方法；同时，以腋芽为材料进行增殖和快繁，能够保持岩生报春的种性不变，为新品种培育中出现的较为珍贵稀有变种的保存提供了保障。对岩生报春无菌苗叶片和叶柄进行培养及再生，使外植体能够高频率地诱导出愈伤组织，建立高效的体细胞再生体系，为岩生报春遗传转化和细胞工程研究创造有利条件，为利用转基因技术育种奠定了良好的基础。为今后大面积园林应用和工厂化育苗提供了非常有效的方法；同时，为新品种培育中出现的较为珍贵稀有变种的保存提供了保障。
与现有技术相比，本发明岩生报春的组织培养与快速繁殖方法的优点在于：
1.建立了一种岩生报春的组织培养与快速繁殖方法，相比传统的报春花属植物育苗繁殖方法，如播种繁殖和分株繁殖，极大地提高了岩生报春的繁殖系数，为科研研究和生产栽培提供了技术支持；
2.通过组织培养与快速繁殖得到的幼苗，生长强健，叶色浓绿，一致性强，成苗容易，适应性较强，病虫害少，易于管理；
3.利用组织培养与快速繁殖方法繁育岩生报春，摆脱了季节与气候的限制因素，从而缩短了育苗周期，增加了繁殖量；
4.利用组织培养与快速繁殖方法繁育岩生报春，可以保持优良种或品种的特性不变，从而为新品种选育研究中变异保存提供了有效的方法；
5.通过组培再生体系的方法建立高效的体细胞再生体系，为岩生报春遗传转化和细胞工程研究创造有利条件；
6.利用组培再生体系繁育岩生报春，为通过遗传转化技术培育新品种奠定了基础。
附图说明
图1所示为接种种子2个月后长成的无菌苗。
图2所示为腋芽接种2周后开始有丛生芽的分化。
图3所示为在腋芽接种40天后分化出的大量丛生芽。
图4所示为叶片接种40d左右开始有形成愈伤组织。
图5所示为将形成的小愈伤组织进行切除，放入增殖培养基中进行增殖。
图6所示为将已增殖的愈伤组织进行分化培养。
图7所示为愈伤组织在分化培养基中分化出的再生植株。
图8所示为不定芽在生根培养基中的生根情况。
图9所示为再生植株在温室中培养。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
选取岩生报春种子，在无菌条件下先用75％酒精消毒15s，无菌水冲洗5～6次，再用质量比0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水冲洗5～6次，接种至1/2MS中，pH为5.9，一个月后移至MS，pH为5.9中继代，在MS中生长一个月(图1)后形成岩生报春无菌壮苗，，光照条件均为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux。
实施例2
选取岩生报春种子，在无菌条件下先用75％酒精消毒30s，无菌水冲洗6次，再用质量比为0.1％的升汞溶液消毒8min，无菌水冲洗6次，接种至MS中，pH为5.9，一个月后移至MS中继代，在MS中生长一个月后形成岩生报春无菌壮苗，光照条件均为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光1500～2000Lux。
实施例3
以岩生报春无菌苗的腋芽为外植体进行初培养和继代培养：选取生长健壮的无菌苗植株上的腋芽，无菌条件下接种在MS+6-BA 2.5mg/l+NAA 1.0mg/l丛生芽诱导培养基上，每瓶接种3个；光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间14h。
当腋芽接种在分化培养基上，不断抽出新叶，10天开始，抽出新叶的叶柄粗壮，基部变红，2周后(图2)开始有丛生芽的分化；接种40天(图3)后，在腋芽新抽出的叶柄上，分化出大量的丛生芽。
统计结果显示在MS+6-BA 2.5mg/l+NAA 1.0mg/l的培养基上接种2个月后，平均每个腋芽能分化出丛生芽的数目是40～50个。同时，温度对于丛生芽的诱导和组培苗的生长起到非常关键的作用，在20～23℃之间，组培苗叶色浓绿，生长健壮；超过25℃，组培苗变黄并逐渐死亡。在这样的培养条件下，试管苗2个月的增值系数达到3～4，极大地提高了岩生报春的繁殖系数。
实施例4
以岩生报春腋芽诱导的无菌苗的叶片为外植体进行愈伤组织的诱导：选取生长健壮的无菌苗植株上的叶片，无菌条件下将叶片(带叶脉)切成1.5cm×1.5cm大小，叶片正面贴近培养基，接种在MS+1.0mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA愈伤组织诱导培养基上，pH为5.8～5.9，每瓶接种5个叶片；先暗培养20d，培养温度为20～23℃，之后转为光照培养，自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间12h/d，培养温度为20～23℃。
当叶片接种在诱导培养基上20d左右，叶片边缘卷曲，部分叶柄基部膨大，40d左右(图4)叶片卷曲部分形成愈伤。
统计结果显示在MS+1.0mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA的培养基上接种叶片的愈伤组织诱导率为21.92％。
实施例5
以岩生报春腋芽诱导的无菌苗的叶柄为外植体进行愈伤组织的诱导：选取生长健壮的无菌苗植株上的叶柄，切成1cm长，接种在MS+1.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA愈伤组织诱导培养基上，pH为5.8～5.9，每瓶接种5个叶柄；先暗培养20d，培养温度为20～23℃，之后转为光照培养，自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间12h/d，培养温度为20～23℃。
当叶柄接种在诱导培养基上20d左右，叶柄基部开始形成愈伤。
统计结果显示在MS+1.5mg/l 6-BA+0.5mg/l NAA的培养基上接种叶柄的愈伤组织诱导率为28.27％。
实施例6
对诱导的初始黄绿色愈伤组织进行增殖培养：将实施例4诱导的黄绿色小愈伤组织(图5)进行切除，接种到MS+0.5mg/l TDZ+0.5mg/l 2，4-D的培养基上进行增殖。光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间12h/d，培养温度为20～23℃。
实施例7
对诱导的初始黄绿色愈伤组织进行增殖培养：将实施例5诱导的黄绿色小愈伤组织进行切除，接种到MS+0.5mg/l TDZ+1.5mg/l2，4-D的培养基上进行增殖。光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间12h/d，培养温度为20～23℃。
实施例8
将经过增殖之后得到的块状、质地疏密适中的愈伤组织(图6)进行分化培养：将愈伤组织接种到MS+10mg/l6-BA+2mg/l NAA分化培养基上进行培养，光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源1800±200Lux，光照时间12h/d，培养温度为20～23℃。
实施例9
岩生报春组培苗的生根培养：当丛生芽和再生植株在分化培养基上长出2～3片叶子(图7)时，将其转移至生根培养基，配方：MS、MS+NAA(0.1mg/l、0.2mg/l、0.5mg/l)中，pH为5.9～6.0；光照条件为自然散射光3000Lux加上人工辅助光源2500Lux，光照时间14h。结果表明，MS、MS+NAA 0.1mg/l、MS+NAA 0.2mg/l的培养基中均能诱导出不定根。从生根所需要的时间来看，在培养基MS和MS+0.1mg/l NAA中生根所需时间最短，为8～10天，但在MS+0.1mg/l NAA中，组培苗生根量和长势明显好于MS基本培养基，组培苗平均高度可达4.8cm，生根率为95％以上(图8)。
实施例10
岩生报春组培苗的移栽：生根培养两周以后，待组培苗平均每株生根4～5条，根长达到1cm时，即可开始为移栽作准备。炼苗是试管苗移栽前的过渡，可以帮助试管苗逐步适应外界环境，使试管苗更健壮，叶色更加深绿，从而提高成活率。岩生报春试管苗炼苗3～4天后，移栽至温室细草炭土中，草炭土提前铺满穴盘，清水浸透；试管苗移栽后保持湿度80％以上，覆薄膜并每天喷水2～3次，2周以后即可逐步进行正常管理，移栽成活率几乎为100％(图9)。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种岩生报春的组织培养与快速繁殖方法，包括如下步骤：将种子表面消毒后进行接种，获得无菌苗后，接种腋芽进行丛生芽的诱导，将获得的不定芽进行生根培养和移栽，其中，所述的种子接种至1/2MS或MS培养基；丛生芽诱导培养基为MS+2.5mg/L 6-BA+1.0mg/LNAA，pH为5.9～6.0；不定芽生根培养基为MS或MS+0.1～0.2mg/L NAA，pH 5.9～6.0。
2.根据权利要求1所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，还包括在所述丛生芽诱导后，将丛生芽的叶片或叶柄接种至愈伤组织诱导培养基上，诱导愈伤组织，并将愈伤组织接种至愈伤组织增殖培养基上进行增殖培养，将增殖后的愈伤组织接种到愈伤组织分化培养基上培养，分化出不定芽，其中，所述的愈伤组织诱导培养基为MS+1～1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA，pH 5.8～5.9；所述的愈伤组织增殖培养基为MS+0.5mg/L TDZ+0.5～1.5mg/L 2，4-D，pH5.8～5.9；所述的愈伤组织分化培养基为MS+10mg/L 6-BA+2mg/L NAA，pH5.8～5.9。
3.根据权利要求1所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，所述的种子表面消毒包括：用清水浸泡种子24h，在超净工作台内先用75％乙醇消毒15～30s，无菌水冲洗5～6次，再用质量比为0.1％的升汞溶液消毒6～8min，无菌水洗涤5～6次。
4.根据权利要求3所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，种子表面消毒包括：用清水浸泡种子24h，在超净工作台内先用75％乙醇消毒15s，无菌水冲洗5次，再用质量比为0.1％的升汞溶液消毒6min，无菌水洗涤5次。
5.根据权利要求1所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，所述生根培养时，光照条件为自然散射光2500～3000Lux加人工辅助光2500～3000Lux。
6.根据权利要求2所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，用于增殖培养的愈伤组织为诱导的初始黄绿色的愈伤组织。
7.根据权利要求2所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，用于不定芽分化的愈伤组织为块状质地疏密适中的愈伤组织。
8.根据权利要求1所述的组织培养与快速繁殖方法，其特征在于，所述的移栽是在生根培养基中培养2～3周后，炼苗4～5天移栽至温室细草炭土中培养，移栽温度为18～25℃。
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