CN103392599B - 岩白菜嫩叶组培快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种岩白菜嫩叶组培快繁方法。岩白菜于自然野生条件下出苗率低和根状茎繁殖系数低；而播种育苗出苗率低，繁殖系数低；扦插育苗会消耗掉部分产品器官，造成生产效率下降。本方法包括以下步骤：外植体的取材和消毒灭菌、愈伤组织诱导培养、不定芽诱导培养、芽增殖培养、生根培养、炼苗移栽。本发明还提供了本方法所使用的培养基的组分配比。本发明将岩白菜嫩叶组培成苗，不仅比种子和根状茎易获取，且繁殖系数高，不受季节气候限制，可随时满足生产用苗；同时，嫩叶愈伤组织诱导可适用于各种叶用药物成分的工厂化生产；另外，本方法结合人工诱变和转基因技术，可创新种质，为岩白菜新品种培育奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及一种岩白菜嫩叶组培快繁方法，属于植物组织培养领域，具体为植物器官快繁培养。
背景技术
岩白菜[Bergenia purpurascens(Hook.f.et Thoms.)Engl.]为虎耳草科（Saxifragaceae）岩白菜属（Bergenia）的多年生草本植物，具有药用、提取化妆品增白剂和观赏等开发利用价值。单独依靠大量野生采挖已不能满足其原材料供给和可持续发展需求，因此岩白菜的驯化栽培近年已逐渐引起重视。目前，岩白菜的种苗繁育多采用播种育苗和扦插育苗两种方法。岩白菜种子为明发种子，无后熟休眠性，比较细小，千粒重仅为0.13g，自然播种出苗率低，仅为22.5％，而实际自然野生条件下更低，因为岩白菜自然分布都在海拔较高的冷凉山区，9-10月种子成熟撒落时萌发的种子幼苗很难在较恶劣的自然野生环境下存活，故野生实生种子苗较少，主要靠匍匐根状茎长出新的植株来扩繁后代。根状茎扦插易成活，可达97.2％，但繁殖系数低且消耗大量主要产品器官。
组织培养技术具有外植体来源广泛，繁殖系数高等优点，可以解决岩白菜种子繁殖成苗率低和扦插繁殖需要大量根状茎的难题。
岩白菜属植物共有十种，目前仅厚叶岩白菜[B.crassifolia(L.)Fritsch]一个种有组培快繁的报道，即新疆维吾尔自治区中药民族药研究所以其茎尖（朱军等，2012）、中国科学院新疆理化技术研究所以其叶片（刘敏等，2009）建立了离体快繁再生体系。其他有关岩白菜的组培研究未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是如何克服岩白菜种子出苗率低和根状茎繁殖系数低等均不利于种苗快速大量繁育的缺陷，提供一种岩白菜嫩叶组培快繁方法。
为解决上述技术问题，本岩白菜嫩叶组培快繁方法包括以下步骤，
步骤1）：外植体的取材和消毒灭菌
选取健康、新鲜的未展或初展开嫩叶，用自来水冲洗干净，先用70%酒精消毒30s，再用0.1%升汞溶液灭菌6～7min，最后用无菌水冲洗3～4次，在超净台无菌条件下将叶片切成约1.0cm2的方块作为待接种用外植体；
步骤2）：愈伤组织诱导培养
将由步骤1）得到的大小约1.0cm2的叶块接种到愈伤组织诱导培养基上，在23℃恒温培养箱中，1500～2500Lx，光照12h/d培养，25～30d形成愈伤组织；
步骤3）：不定芽诱导培养
将由步骤2）得到的愈伤组织块转接至不定芽诱导培养基上，在22±2℃，1500Lx，光照10～12h/d培养，15-20d形成不定芽；
步骤4）：芽增殖培养
将由步骤3）得到的丛生不定芽转接至芽增殖培养基中，在22±2℃，1500Lx，光照10～12h/d培养，15～25d形成继代丛生芽，依丛生芽数量的需求，每隔20～25d依同法进行转接再增殖；
步骤5）：生根培养
将由步骤4）得到的、苗高2～3cm的无根苗转接至生根培养基上，在22±2℃，1500Lx，每天10～12h光照条件下培养25～30d，基部形成10条根以上，即成为生根组培苗；
步骤6）：炼苗移栽
瓶内炼苗：将由步骤5）得到的生根组培苗带瓶移出培养室外，在普通大棚内自然光照和温度条件下放置1周，然后打开瓶盖炼苗2～3d；
移栽炼苗：自来水洗净组培苗根部培养基，用灭菌和生根混合溶液浸泡根部30s至1min，稍沥干后移栽至珍珠岩和蛭石对半混合的基质中，注意喷雾保湿和避免强光照射，两周后进入常规管理，组培苗移栽成活率90%以上，继续培养1～2个月后即得岩白菜种苗。
作为优化，上述步骤2）中所述的愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D0.2mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+活性炭3g/L。
作为优化，上述步骤3）中所述的不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭3g/L。
作为优化，上述步骤4）中所述的芽增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT2.0mg/L+活性炭3g/L。
作为优化，上述步骤5）中所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭3g/L。
作为优化，上述MS为MS培养基，其中含有蔗糖30g/L，琼脂条8g/L，其pH为5.5～6.0。
本发明岩白菜嫩叶组培快繁方法将岩白菜嫩叶组培成苗，不仅比种子和根状茎易获取，且繁殖系数高，不受季节气候限制，可随时满足生产用苗；同时，嫩叶愈伤组织诱导可适用于各种叶用药物成分的工厂化生产；另外，本方法结合人工诱变和转基因技术，可创新种质，为岩白菜新品种培育奠定基础。
具体实施方式
步骤1）：外植体的取材和消毒灭菌
选取健康、新鲜的未展或初展开嫩叶，用自来水冲洗干净，先用70%酒精消毒30s，再用0.1%升汞溶液灭菌6～7min，最后用无菌水冲洗3～4次，在超净台无菌条件下将叶片切成约1.0cm2的方块作为待接种用外植体；
步骤2）：愈伤组织诱导培养
将由步骤1）得到的大小约1.0cm2的叶块接种到愈伤组织诱导培养基上，在23℃恒温培养箱中，1500～2500Lx，光照12h/d培养，25～30d形成愈伤组织；
所述的愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D0.2mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+活性炭3g/L；其中MS为MS培养基，其中含有蔗糖30g/L，琼脂条8g/L，其pH为5.5～6.0。
步骤3）：不定芽诱导培养
将由步骤2）得到的愈伤组织块转接至不定芽诱导培养基上，在22±2℃，1500Lx，光照10～12h/d培养，15-20d形成不定芽；
所述的不定芽诱导培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭3g/L；其中MS为MS培养基，其中含有蔗糖30g/L，琼脂条8g/L，其pH为5.5～6.0。
步骤4）：芽增殖培养
将由步骤3）得到的丛生不定芽转接至芽增殖培养基中，在22±2℃，1500Lx，光照10～12h/d培养，15～25d形成继代丛生芽，依丛生芽数量的需求，每隔20～25d依同法进行转接再增殖；
所述的芽增殖培养基为MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT2.0mg/L+活性炭3g/L；其中MS为MS培养基，其中含有蔗糖30g/L，琼脂条8g/L，其pH为5.5～6.0。
步骤5）：生根培养
将由步骤4）得到的、苗高2～3cm的无根苗转接至生根培养基上，在22±2℃，1500Lx，每天10～12h光照条件下培养25～30d，基部形成10条根以上，即成为生根组培苗；
所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5mg/L+活性炭3g/L；其中MS为MS培养基，其中含有蔗糖30g/L，琼脂条8g/L，其pH为5.5～6.0。
步骤6）：炼苗移栽
瓶内炼苗：将由步骤5）得到的生根组培苗带瓶移出培养室外，在普通大棚内自然光照和温度条件下放置1周，然后打开瓶盖炼苗2～3d；
移栽炼苗：自来水洗净组培苗根部培养基，用灭菌和生根混合溶液浸泡根部30s至1min，稍沥干后移栽至珍珠岩和蛭石对半混合的基质中，注意喷雾保湿和避免强光照射，两周后进入常规管理，组培苗移栽成活率90%以上，继续培养1～2个月后即得岩白菜种苗。
对比实验
1、嫩叶愈伤组织诱导：以MS基本培养基加入活性炭3g/L、蔗糖30g/L、琼脂条8g/L，pH5.5～6.0，添加下列不同激素配比，可诱导形成部分愈伤组织。
2、不定芽诱导培养基：添加蔗糖30g/L、琼脂条8g/L，pH5.5～6.0。
3、生根培养基配方：添加蔗糖30g/L、琼脂条8g/L，pH5.5-6.0。
由对比实验结构：本发明中的各培养基组分配比为最优方案。
上述实施方式旨在举例说明本发明可为本领域专业技术人员实现或使用，对上述实施方式进行修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，故本发明包括但不限于上述实施方式，任何符合本权利要求书或说明书描述，符合与本文所公开的原理和新颖性、创造性特点的方法、工艺、产品，均落入本发明的保护范围之内。
Claims (1)
1.一种岩白菜嫩叶组培快繁方法，其特征是：该方法包括以下步骤，
步骤1)：外植体的取材和消毒灭菌
选取健康、新鲜的未展或初展开嫩叶，用自来水冲洗干净，先用70％酒精消毒30s，再用0.1％升汞溶液灭菌6～7min，最后用无菌水冲洗3～4次，在超净台无菌条件下将叶片切成约1.0cm2的方块作为待接种用外植体；
步骤2)：愈伤组织诱导培养
将由步骤1)得到的大小约1.0cm2的叶块接种到愈伤组织诱导培养基上，在23℃恒温培养箱中，1500～2500Lx，光照12h/d培养，25～30d形成愈伤组织；
步骤3)：不定芽诱导培养
将由步骤2)得到的愈伤组织块转接至不定芽诱导培养基上，在22±2℃，1500Lx，光照10～12h/d培养，15-20d形成不定芽；
步骤4)：芽增殖培养
将由步骤3)得到的丛生不定芽转接至芽增殖培养基中，在22±2℃，1500Lx，光照10～12h/d培养，15～25d形成继代丛生芽，依丛生芽数量的需求，每隔20～25d依同法进行转接再增殖；
步骤5)：生根培养
将由步骤4)得到的、苗高2～3cm的无根苗转接至生根培养基上，在22±2℃，1500Lx，每天10～12h光照条件下培养25～30d，基部形成10条根以上，即成为生根组培苗；
步骤6)：炼苗移栽
瓶内炼苗：将由步骤5)得到的生根组培苗带瓶移出培养室外，在普通大棚内自然光照和温度条件下放置1周，然后打开瓶盖炼苗2～3d；
移栽炼苗：自来水洗净组培苗根部培养基，用灭菌和生根混合溶液浸泡根部30s至1min，稍沥干后移栽至珍珠岩和蛭石对半混合的基质中，注意喷雾保湿和避免强光照射，两周后进入常规管理，组培苗移栽成活率90％以上，继续培养1～2个月后即得岩白菜种苗；
步骤2)中所述的愈伤组织诱导培养基为MS+2,4-D 0.2mg/L+6-BA0.5mg/L+NAA 0.4mg/L+活性炭3g/L；
步骤3)中所述的不定芽诱导培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+活性炭3g/L；
步骤4)中所述的芽增殖培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA0.2mg/L+KT 2.0mg/L+活性炭3g/L；
步骤5)中所述的生根培养基为1/2MS+NAA 0.5mg/L+活性炭3g/L；
所述MS为MS培养基，其中含有蔗糖30g/L，琼脂条8g/L，其pH为5.5～6.0。
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