CN110972941A - 一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，本发明具体包括以下步骤：S1、对厚叶岩白菜外植体消毒处理，S2、然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20‑25天继代一次，S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养，本发明涉及植物培养技术领域。该防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，可实现通过在培养过程中添加交联聚维酮(PVPP)和特美汀，能够很好的缓解厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌的滋生，具有使用方便、效果好以及种苗品质高的优点。

Description

一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法
技术领域
本发明涉及植物培养技术领域，具体为一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法。
背景技术
厚叶岩白菜为虎耳草科岩白菜属多年生草本植物，具有非常高观赏价值和药用价值，厚叶岩白菜含有岩白菜素、酚类、黄酮以及多糖类物质，岩白菜素是治疗呼吸道疾病的特效药。
随着厚叶岩白菜药用价值的拓展和绿化观赏价值的提升，野生厚叶岩白菜植物资源被过度采挖利用，并且厚叶岩白菜种子萌发率低，根茎分株繁育速度慢，导致野生资源日益濒危枯竭，开展的组织培养可以在短期内繁育大量的优良植株，成为了厚叶岩白菜育种中最为有效的快速繁殖手段之一。植物组织培养而言，褐化是影响组培成功的关键难题，褐化是植物材料受伤后，体内释放的酚类物质被氧化成褐色的醌类物质的结果，植物组织培养而言，大量酚类化合物也是内生菌类移向这些部位。
本发明利用在培养基中添加防褐剂交联聚维酮(PVPP)缓解厚叶岩白菜外植体褐化，以及加特美汀防止内生菌滋生相关方法未见报道。
发明内容
(一)解决的技术问题
针对现有技术的不足，本发明提供了一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，解决了现有植物组织培养过程中易褐化和内生菌滋生的问题。
(二)技术方案
为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，具体包括以下步骤：
S1、外植体的选取和消毒：首先从室外生长的厚叶岩白菜中取完全张开健康的叶片，用流动自来水冲洗20min，转到超净工作台上再用75％酒精处理30s后再用无菌水冲洗干净，然后用6％NaClO次氯酸钠处理12min后用已无菌水冲洗3次，浸泡期间晃动4-6次，随后放置于已灭菌的滤纸晾干，切除已消毒叶片的首尾，在叶片主脉横切；
S2、防褐化培养：然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，培养处理后，可以有效缓解褐化和内生菌污染的现象，改善外植体整体的分化状态；
S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20-25天继代一次；
S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养。
优选的，所述步骤S2中防褐化培养基为：1/2DKW基本培养基中分别加入防褐添加剂0.1-0.2g/L交联聚维酮、抑制内生菌污染剂200mg/L特美汀、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉。
优选的，所述1/2DKW基本培养基的配方包括：1/2DKW、0.2-0.5mg/L的6-BA细胞分裂素、0.5mg/L的KT激动素、0.1mg/L的TDZ噻苯隆和0.1mg/L的GA3赤霉素。
优选的，所述步骤S2中防褐化培养基的pH值为5.8，并且在121℃的温度下灭菌20min。
优选的，所述步骤S3中增殖培养基的组成成分是由1/2MS、0.05mg/L的IBA吲哚乙酸、0.02mg/L的NAA萘乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
优选的，所述步骤S4中生根培养基的组成成分是由1/2MS、0.5-1.0mg/L的IBA吲哚乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
(三)有益效果
本发明提供了一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法。与现有技术相比具备以下有益效果：该防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，具体包括以下步骤：S1、外植体的选取和消毒：首先从室外生长的厚叶岩白菜中取完全张开健康的叶片，用流动自来水冲洗20min，转到超净工作台上再用75％酒精处理30s后再用无菌水冲洗干净，然后用6％NaClO次氯酸钠处理12min后用已无菌水冲洗3次，浸泡期间晃动4-6次，随后放置于已灭菌的滤纸晾干，切除已消毒叶片的首尾，在叶片主脉横切，S2、防褐化培养：然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，培养处理后，可以有效缓解褐化和内生菌污染的现象，改善外植体整体的分化状态，S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20-25天继代一次，S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养，可实现通过在培养过程中添加交联聚维酮(PVPP)和特美汀，能够很好的缓解厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌的滋生，改善外植体整体的分化状态，具有使用方便、效果好以及种苗品质高的优点。
附图说明
图1为本发明的流程图；
图2为本发明厚叶岩白菜叶片外植体诱导初褐化培养过程图；
图3为本发明厚叶岩白菜叶片外植体诱导增殖培养图；
图4为本发明厚叶岩白菜叶片外植体诱导生根培养图；
图5为本发明对照组采用普通培养基培养褐化和内生菌情况图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
请参阅图1-5，本发明实施例提供三种技术方案：一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，具体包括以下实施例：
实施例1
S1、外植体的选取和消毒：首先从室外生长的厚叶岩白菜中取完全张开健康的叶片，用流动自来水冲洗20min，转到超净工作台上再用75％酒精处理30s后再用无菌水冲洗干净，然后用6％NaClO次氯酸钠处理12min后用已无菌水冲洗3次，浸泡期间晃动5次，随后放置于已灭菌的滤纸晾干，切除已消毒叶片的首尾，在叶片主脉横切；
S2、防褐化培养：然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，培养处理后，可以有效缓解褐化和内生菌污染的现象，改善外植体整体的分化状态，防褐化培养基为：1/2DKW基本培养基中分别加入防褐添加剂0.15g/L交联聚维酮、抑制内生菌污染剂200mg/L特美汀、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，1/2DKW基本培养基的配方包括：1/2DKW、0.3mg/L的6-BA细胞分裂素、0.5mg/L的KT激动素、0.1mg/L的TDZ噻苯隆和0.1mg/L的GA3赤霉素，防褐化培养基的pH值为5.8，并且在121℃的温度下灭菌20min；
S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20-25天继代一次，增殖培养基的组成成分是由1/2MS、0.05mg/L的IBA吲哚乙酸、0.02mg/L的NAA萘乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成；
S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养，生根培养基的组成成分是由1/2MS、0.7mg/L的IBA吲哚乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
实施例2
S1、外植体的选取和消毒：首先从室外生长的厚叶岩白菜中取完全张开健康的叶片，用流动自来水冲洗20min，转到超净工作台上再用75％酒精处理30s后再用无菌水冲洗干净，然后用6％NaClO次氯酸钠处理12min后用已无菌水冲洗3次，浸泡期间晃动4次，随后放置于已灭菌的滤纸晾干，切除已消毒叶片的首尾，在叶片主脉横切；
S2、防褐化培养：然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，培养处理后，可以有效缓解褐化和内生菌污染的现象，改善外植体整体的分化状态，防褐化培养基为：1/2DKW基本培养基中分别加入防褐添加剂0.1g/L交联聚维酮、抑制内生菌污染剂200mg/L特美汀、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，1/2DKW基本培养基的配方包括：1/2DKW、0.2mg/L的6-BA细胞分裂素、0.5mg/L的KT激动素、0.1mg/L的TDZ噻苯隆和0.1mg/L的GA3赤霉素，防褐化培养基的pH值为5.8，并且在121℃的温度下灭菌20min；
S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20-25天继代一次，增殖培养基的组成成分是由1/2MS、0.05mg/L的IBA吲哚乙酸、0.02mg/L的NAA萘乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成；
S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养，生根培养基的组成成分是由1/2MS、0.5mg/L的IBA吲哚乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
实施例3
S1、外植体的选取和消毒：首先从室外生长的厚叶岩白菜中取完全张开健康的叶片，用流动自来水冲洗20min，转到超净工作台上再用75％酒精处理30s后再用无菌水冲洗干净，然后用6％NaClO次氯酸钠处理12min后用已无菌水冲洗3次，浸泡期间晃动6次，随后放置于已灭菌的滤纸晾干，切除已消毒叶片的首尾，在叶片主脉横切；
S2、防褐化培养：然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16小时/天，培养时间为40天，培养处理后，可以有效缓解褐化和内生菌污染的现象，改善外植体整体的分化状态，防褐化培养基为：1/2DKW基本培养基中分别加入防褐添加剂0.2g/L交联聚维酮、抑制内生菌污染剂200mg/L特美汀、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉，1/2DKW基本培养基的配方包括：1/2DKW、0.5mg/L的6-BA细胞分裂素、0.5mg/L的KT激动素、0.1mg/L的TDZ噻苯隆和0.1mg/L的GA3赤霉素，防褐化培养基的pH值为5.8，并且在121℃的温度下灭菌20min；
S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20-25天继代一次，增殖培养基的组成成分是由1/2MS、0.05mg/L的IBA吲哚乙酸、0.02mg/L的NAA萘乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成；
S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养，生根培养基的组成成分是由1/2MS、1.0mg/L的IBA吲哚乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
对比实验
某生物培养研究所采用本发明实施例1-3防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法分别进行三组厚叶岩白菜叶片外植体诱导培养，同时采用现有的普通培养基进行培养作为对照组，普通培养基组成成分为1/2DKW基本培养基，培养过程中，分别记录每组外植体褐化情况。
表1对比实验的数据表
Figure BSA0000197379610000071
由表1可知，采用本发明实施例1-3防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法分别进行三组厚叶岩白菜叶片外植体上褐化情况不明显，而采用现有的普通培养基进行培养的对照组培养的厚叶岩白菜叶片外植体上有明显褐化和内生菌滋生情况，且实施例1-3的内生菌菌落数量明显比对照组的少，因此本发明可实现通过在培养过程中添加交联聚维酮(PVPP)和特美汀，能够很好的缓解厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌的滋生，改善外植体整体的分化状态，具有使用方便、效果好以及种苗品质高的优点。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (6)

1.一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，其特征在于：具体包括以下步骤：
S1、外植体的选取和消毒：首先从室外生长的厚叶岩白菜中取完全张开健康的叶片，用流动自来水冲洗20min，转到超净工作台上再用75％酒精处理30s后再用无菌水冲洗干净，然后用6％ NaClO次氯酸钠处理12min后用已无菌水冲洗3次，浸泡期间晃动4-6次，随后放置于已灭菌的滤纸晾干，切除已消毒叶片的首尾，在叶片主脉横切；
S2、防褐化培养：然后对步骤S1消毒后的外植体愈伤组织在防褐化培养基中进行防褐化和内生菌污染培养，控制白天温度为28℃，夜间温度为25℃，光照强度为2000Lux，光照时间为16小时/天，培养时间为40天；
S3、增殖培养：将步骤S2诱导生成的不定芽切下，在增殖培养基中进行培养，20-25天继代一次；
S4、生根培养：将步骤S3增殖培养的组培苗切成单株接种于生根培养基培养。
2.根据权利要求1所述的一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，其特征在于：所述步骤S2中防褐化培养基为：1/2DKW基本培养基中分别加入防褐添加剂0.1-0.2g/L交联聚维酮、抑制内生菌污染剂200mg/L特美汀、30g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉。
3.根据权利要求2所述的一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，其特征在于：所述1/2DKW基本培养基的配方包括：1/2DKW、0.2-0.5mg/L的6-BA细胞分裂素、0.5mg/L的KT激动素、0.1mg/L的TDZ噻苯隆和0.1mg/L的GA3赤霉素。
4.根据权利要求1所述的一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，其特征在于：所述步骤S2中防褐化培养基的pH值为5.8，并且在121℃的温度下灭菌20min。
5.根据权利要求1所述的一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，其特征在于：所述步骤S3中增殖培养基的组成成分是由1/2MS、0.05mg/L的IBA吲哚乙酸、0.02mg/L的NAA萘乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
6.根据权利要求1所述的一种防止厚叶岩白菜外植体褐化和内生菌污染的方法，其特征在于：所述步骤S4中生根培养基的组成成分是由1/2MS、0.5-1.0mg/L的IBA吲哚乙酸、200mg/L特美汀、30.0g/L蔗糖和5.0g/L琼脂粉组成。
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