CN101116425A - 一种用生物组织培养法制备厚叶岩白菜的方法 - Google Patents
一种用生物组织培养法制备厚叶岩白菜的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用生物组织培养法制备厚叶岩白菜的方法，是以野生厚叶岩白菜叶片为外植体，经过消毒处理后，接种于诱导愈伤培养基上，待愈伤形成后，再接入分化培养基诱导芽的形成，再接入生根培养基，幼苗的根生长到一定程度时，进行炼苗与移栽即可。采用本发明外植体来源广泛、繁殖系数高，短时间内可获得大量优质种苗，初步建立了厚叶岩白菜离体培养再生体系。该方法分别选用PVP和Na2S2O3作抗褐化剂，有效的解决了愈伤诱导过程中的褐化现象，在出芽培养时使用NAA+IBA+6－BA或TDZ+GA3的组合，使出芽和扩繁率有所提高，并且炼苗采用基质，不仅通气、保水性好，又有充足的营养，充分满足岩白菜幼苗生长需求，成活率达到95％。
Description
技术领域
本发明涉及一种用生物组织培养法制备野生厚叶岩白菜的方法。
背景技术
厚叶岩白菜[Bergenia crassifolia(Linn.)Fritsch]是虎耳草科岩白菜属的一种多年生草本植物，其全草长25-30厘米，根茎粗直，圆柱形，长约10厘米，粗1～1.5厘米，外表粗糙，有大型的环节状纹理，根皮棕褐色，多成片脱落，质脆，断面内心棕红色。厚叶岩白菜具有滋补虚损，止血、化痰、清热等多种功效，是一种宝贵的药材，其有效成分岩白菜素已经被广泛研究，最近有报道岩白菜提取物具有抗菌和抗氧化的作用，岩白菜素已经作为一种中药制剂被广泛应用于临床应用。并且，由于花期长，花色鲜艳，在南方可以布置在公园林下作为地被植物观赏，在北方则可盆栽欣赏。目前，由于过度采挖，岩白菜的资源逐渐开始枯竭，到90年代中期，岩白菜资源濒于消亡，国家已将其列为珍稀濒危二级保护植物。很多研究者开始采取引种驯化的办法来挽救岩白菜日趋枯竭的资源，目前，岩白菜的种苗繁育有播种育苗和扦插育苗两种方法。但是，岩白菜种子比较小，千粒重仅为0.21g，播种出苗率很低，春季时出苗率最高，也仅达22.5％，所以目前并未实现大规模的人工栽培。
组织培养是植物细胞组织培养是指在离体条件下利用人工培养基对植物器官、组织、细胞、原生质体等进行培养，使其长成完整的植株。由于组织培养法繁殖作物的突出特点是快速，因此，对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖的“名、优、特、新、奇”作物品种的繁殖意义更大。对于脱毒苗、新育成、新引进、稀缺育种、优良单株、濒危植物和基因工程植株等可通过离体快速繁殖，同时可不受地区、气候的影响，扩大繁殖速度比常规方法快很多，及时提供大量优质种薯和种苗。马铃薯茎类脱毒、无毒种苗和微型脱毒种薯已在马铃薯生产上广泛应用，从根本上解决了马铃薯的退化问题。目前，观赏植物、园艺作物、经济林木、无性繁殖作物等部分或大部分都用离体快繁提供苗木，试管苗已出现在国际市场上并形成产业化。
岩白菜播种出苗率低，要获得大量种苗较困难。用根状茎扦插育苗虽有较高的成活率，但繁殖系数小，若培育大量幼苗，必须采挖大量的野生根状茎，这对保护野生岩白菜资源是极为不利的。组织培养技术在药用植物上已经得到了大量应用，它具有外植体来源广泛、繁殖系数高等优点，在短时间内便可获得大量优质种苗。所以组织培养及再生体系的建立对于缓解岩白菜资源开发利用与保护之间的矛盾有着重要意义。
到目前为止，国内外关于岩白菜组织培养方面的研究尚未见报道，本技术通过对培养基组分、激素配比及环境因子的确定，建立了野生厚叶岩白菜完整的再生体系。为岩白菜的大规模快繁及其遗传转化研究奠定了基础。
发明内容
本发明目的在于，提供一种生物组织培养法制备的野生厚叶岩白菜，是以厚叶岩白菜叶片为外植体，经过消毒处理后，接种于诱导愈伤培养基上，待愈伤形成后，再接入分化培养基，诱导芽的形成，之后接入生根培养基，幼苗的根生长到一定程度时，进行炼苗与移栽即可。由于岩白菜种子比较小，播种出苗率很低，春季出苗率最高，也仅达22.5％，要获得大量种苗较困难，用根状茎扦插育苗虽有较高的成活率，但繁殖系数小，若培育大量幼苗，必须采挖大量的野生根状茎，破坏植被，采用本发明植物组织培养法外植体来源广泛、繁殖系数高短时间内便可获得大量优质种苗，得到的厚叶岩白菜出苗率均一性高，初步建立了野生厚叶岩白菜离体培养再生体系。在本发明所述的方法中，分别选用PVP和Na2S2O3作抗褐化剂，有效的解决了愈伤诱导过程中的褐化现象，在出芽培养时使用NAA+IBA+6-BA或TDZ+GA3的组合使出芽和扩繁率有所提高，并且炼苗采用珍珠岩+腐殖质+草炭土为基质，不仅通气、保水性好，又有充足的营养，充分满足岩白菜幼苗生长需求，使成活率达到95％。采用植物组织培养法不仅能提高提取岩白菜素，而且有效的控制岩白菜的花期。同时，用植物组织培养法培育的种苗不受地区、气候的影响，可以大面积种植，利用价值提高。
本发明所述的一种用生物组织培养法制备野生厚叶岩白菜的方法，按下列步骤进行：
a、外植体消毒：
将新鲜野生厚叶岩白菜叶片用洗洁精或洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.1-0.2％升汞消毒5-12分钟并加2-4滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗3-5遍；
b、愈伤诱导：
将消毒后的厚叶岩白菜其叶片切成小块作为外植体，接种于基础培养基MS或DKW或B5+3％蔗糖+NAA 0.05-3.0mg/L+6-BA0.05-3.0mg/L+2.4-D0.01-2.0mg/L进行愈伤诱导，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂；
c、芽诱导分化及丛芽的增殖：
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基为基础培养基MS或DKW或B5+NAA 0.05-3.0mg/L+IBA 0.05-3.0mg/L+6-BA0.05-3.0mg/L，或基础培养基MS或DKW或B5+TDZ 0.005-2.0mg/L+GA30.05-1.0mg/L诱导芽形成及丛芽的增殖；
d、生根：
生根培养基选用基础培养基1/2MS或B5+0.05-3.0mg/LNAA+0.05-3.0mg/LIBA；
e、炼苗和移栽：
当幼苗的根长到2-3厘米，幼苗形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为基质，在温度20℃-25℃，湿度60％-80％的条件下炼苗5-30天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土，视幼苗长势移入大田即可。
步骤b中厚叶岩白菜的叶片切块大小为0.8-1.2cm2。
步骤b中厚叶岩白菜叶片在9-20℃，1500-2500Lux，20-60天愈伤诱导率40-60％，可利用愈伤为20-30％。
步骤c中愈伤出芽在9-20℃，1500-3000Lux，20-60天，出芽率20-40％。
步骤c中丛芽增殖繁殖比1∶15-25。
步骤d中单苗高2-3厘米，4-7片叶在19-24℃，2000-3000Lux，8-30天生长出5-8条根长1-2厘米白根，生根率90-100％。
步骤e中基质珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1。
步骤e中幼苗移栽入营养土的成分为：营养土∶珍珠岩为1∶1。
本发明所述的一种用生物组织培养法制备野生厚叶岩白菜的方法，该方法中的褐化是很多木本植物组织培养过程中常见的问题，在本发明中，分别选用PVP和Na2S2O3作抗褐化剂，有效的解决了愈伤诱导过程中的褐化现象，同时我们发现PVP的抗褐化效果要优于Na2S2O3。不同生长素作用机理各异，因此有许多报道表明不同的生长素配合使用比单独使用效果好。该技术也证明了这一点：在出芽培养时使用NAA+IBA+6-BA或TDZ+GA3的组合使出芽和扩繁率有所提高，并且炼苗采用珍珠岩+腐殖植+草炭土为基质，不仅通气、保水性好，又有充足的营养，充分满足岩白菜幼苗生长需求，使成活率达到95％。
附图说明
图1为本发明诱导愈伤图
图2为本发明诱导出芽图
图3为本发明芽增殖图
图4为本发明芽扩繁图
图5为本发明生根图
图6为本发明炼苗图
具体实施方式
实施例1：
将野生厚叶岩白菜新鲜叶片用洗洁精仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.2％升汞消毒5分钟并加2滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗3遍；
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成0.8cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为MS+3％蔗糖+NAA1.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+2.4-D0.01mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂；厚叶岩白菜叶片在9℃，1500Lux，60天愈伤诱导率40％，可利用愈伤为20％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为MS+NAA 1.0mg/L+IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶25，愈伤出芽在9℃，1500Lux，60天，出芽率20％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用1/2MS培养基+0.005mg/LNAA，单苗高2厘米，4片叶在19℃，2000Lux，8天生长出5条根长1-2厘米白根，生根率90％；
当幼苗的根长到1厘米时，幼苗长出4片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1基质，在温度20℃，湿度60％的条件下炼苗10天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
实施例2：
将野生厚叶岩白菜新鲜叶片用洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.1％升汞消毒7分钟并加3滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗4遍；
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成1.0cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为DKW+3％蔗糖+NAA 0.05mg/L+6-BA 1.0mg/L+2.4-D0.05mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂，厚叶岩白菜叶片在12℃，1800Lux，40天愈伤诱导率45％，利用愈伤23％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为DKW+NAA0..05mg/L+IBA 1.0mg/L+6-BA 0.05mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶18，愈伤出芽在12℃，1800Lux，40天，出芽率22％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用1/2MS培养基+1.0mg/LIBA，单苗高3厘米，5片叶在19℃，2000Lux，15天生长出6条根长1-2厘米白根，生根率92％；
当幼苗的根长到2厘米，幼苗长出5片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1为基质，在温度22℃，湿度70％的条件下炼苗8天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
实施例3：
将厚叶岩白菜新鲜叶片用洗洁精仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.15％升汞消毒5分钟并加2滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗4遍。
将消毒后的厚叶岩白菜其叶片切成1.1cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为B5+3％蔗糖+NAA 2.0mg/L+6-BA 0.05mg/L+2.4-D0.08mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂，厚叶岩白菜叶片在15℃，2000Lux，30天愈伤诱导率50％，可利用愈伤为25％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为B5+NAA 2.0mg/L+IBA 2.0mg/L+6-BA 1.0mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶20，愈伤出芽在15℃，2000Lux，40天，出芽率30％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用B5培养基+2.0mg/LIBA，单苗高2.5厘米，6片叶在19℃，2000Lux，18天生长出7条根长1-2厘米白根，生根率95％；
当幼苗的根长到2厘米，幼苗长出5片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1为基质，在温度25℃，湿度75％的条件下炼苗20天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
实施例4：
将野生厚叶岩白菜新鲜叶片用洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.1％升汞消毒9分钟并加3滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗5遍；
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成0.9cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为MS+3％蔗糖+NAA1.5mg/L+6-BA 1.5mg/L+2.4-D1.0mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂，厚叶岩白菜叶片在17℃，2200Lux，50天愈伤诱导率55％，可利用愈伤为30％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为B5+TDZ0.005mg/L+GA30.05mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶22，愈伤出芽在17℃，2500Lux，50天，出芽率35％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用B5培养基+0.5mg/LNAA，单苗高3厘米，7片叶在19℃，2000Lux，27天生长出8条根长1-2厘米白根，生根率98％；
当幼苗的根长到2厘米，幼苗长出5片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1为基质，在温度25℃，湿度80％的条件下炼苗20天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
实施例5：
将野生厚叶岩白菜新鲜叶片用洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.1％升汞消毒10分钟并加2滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗5遍；
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成1.2cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为DKW+3％蔗糖+NAA 0.5mg/L+6-BA 3.0mg/L+2.4-D1.5mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂，厚叶岩白菜叶片在20℃，2500Lux，55天愈伤诱导率57％，可利用愈伤为20％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为DKW+TDZ0.05mg/L+GA30.5mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶25，愈伤出芽在20℃，3000Lux，60天，出芽率40％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用B5培养基+3.0mg/LIBA，单苗高2厘米，4片叶在19℃，2000Lux，25天生长出5条根长1-2厘米白根，生根率92％；
当幼苗的根长到2厘米，幼苗长出5片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1为基质，在温度25℃，湿度80％的条件下炼苗25天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
实施例6：
将野生厚叶岩白菜新鲜叶片用洗洁精仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.2％升汞消毒12分钟并加3滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗4遍；
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成0.8cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为MS+3％蔗糖+NAA3.0mg/L+6-BA 1.0mg/L+2.4-D2.0mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂，厚叶岩白菜叶片在11℃，1650Lux，25天愈伤诱导率43％，可利用愈伤为20％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为B5+TDZ 2.0mg/L+GA30.1mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶25，愈伤出芽在16℃，2400Lux，45天，出芽率24％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用1/2MS培养基+2.0mg/LNAA，单苗高3厘米，6片叶在19℃，2000Lux，12天生长出5条根长1-2厘米白根，生根率98％；
当幼苗的根长到2厘米，幼苗长出5片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1为基质，在温度25℃，湿度65％的条件下炼苗20天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
实施例7：
将野生厚叶岩白菜新鲜叶片用洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.1％升汞消毒9分钟并加3滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗5遍；
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成1.2cm2的小块作为外植体，接种于培养基上进行愈伤诱导，培养基成分为MS+3％蔗糖+NAA
0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D1.5mg/L的组合，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂，厚叶岩白菜叶片在10℃，1900Lux，45天愈伤诱导率60％，利用愈伤30％；
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基成分为B5+TDZ 1.5
mg/L+GA30.5mg/L，诱导芽形成及丛芽的增殖，丛芽增殖繁殖比1∶23，愈伤出芽在13℃，1900Lux，25天，出芽率22％；
待芽形成苗后，转入生根培养基中，生根培养基选用B5培养基+1.5mg/LNAA，单苗高3厘米，7片叶在19℃，2000Lux，18天生长出7条根长1-2厘米白根，生根率100％；
当幼苗的根长到2厘米，幼苗长出5片叶形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基(严格洗净，防止烂根)，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1为基质，在温度25℃，湿度75％的条件下炼苗30天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土∶珍珠岩为1∶1的基质中，视幼苗长势移入大田即可。
Claims (8)
1.一种用生物组织培养法制备厚叶岩白菜的方法，其特征在于按下列步骤进行：
a、外植体消毒：
将新鲜野生厚叶岩白菜叶片用洗洁精或洗衣粉仔细擦洗表面，流动水冲洗10分钟，75％乙醇消毒30秒，0.1-0.2％升汞消毒5-12分钟并加2-4滴吐温80，再用含有0.2％的Na2S2O3无菌水清洗3-5遍；
b、愈伤诱导：
将消毒后的野生厚叶岩白菜其叶片切成小块作为外植体，接种于基础培养基MS或DKW或B5+3％蔗糖+NAA 0.05-3.0mg/L+6-BA0.05-3.0mg/L+2.4-D0.01-2.0mg/L进行愈伤诱导，同时添加水解酪蛋白100mg/L+0.2％PVP作为抗褐化剂；
c、芽诱导分化及丛芽的增殖：
愈伤形成后，转入增殖培养基，增殖培养基为基础培养基MS或DKW或B5+NAA 0.05-3.0mg/L+IBA 0.05-3.0mg/L+6-BA0.05-3.0mg/L，或基础培养基MS或DKW或B5+TDZ 0.005-2.0mg/L+GA3 0.05-1.0mg/L诱导芽形成及丛芽的增殖；
d、生根：
生根培养基选用基础培养基1/2MS或B5+0.05-3.0mg/LNAA+0.05-3.0mg/LIBA；
e、炼苗和移栽：
当幼苗的根长到2-3厘米，幼苗形体已显健壮时，将幼苗取出，在清水中洗净附着在根上的培养基，将洗净的幼苗排好，用清水喷湿，然后分别以珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为基质，在温度20℃-25℃，湿度60％-80％的条件下炼苗5-30天，炼苗后，将幼苗移栽入营养土，视幼苗长势移入大田即可。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中野生厚叶岩白菜的叶片切块大小为0.8-1.2cm2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤b中野生厚叶岩白菜叶片在9-20℃，1500-2500Lux，20-60天愈伤诱导率40-60％，可利用愈伤为20-30％。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中愈伤出芽在9-20℃，1500-3000Lux，20-60天，出芽率20-40％。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤c中丛芽增殖繁殖比1∶15-25。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤d中单苗高2-3厘米，4-7片叶在19-24℃，2000-3000Lux，8-30天生长出5-8条根长1-2厘米白根，生根率90-100％。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e中基质珍珠岩∶草炭土∶腐殖质为1∶1∶1。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤e中幼苗移栽入营养土的成分为：营养土∶珍珠岩为1∶1。
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