CN110810245B - 一种花棒的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种花棒的组织培养方法，取用花棒幼嫩枝条上的生长点作为外植体，灭菌后经过初代诱导培养、继代培养、生根培养和移栽，系统地研究了花棒的外植体的选择、最佳培养条件、不同阶段的最佳培养基及增殖培养代数。经过实验，得到了花棒的组培中不同阶段的最佳培养基以及培养基组合，最适的培养条件及培养方式，解决了花棒组织培养的玻璃化、缩短育苗时间、栽培中种源较少的问题的难题，为实现花棒的工厂化生产奠定了可靠的基础。本发明操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。

Description

一种花棒的组织培养方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体而言，涉及一种花棒的组织培养方法，该培养方法特别适用于花棒，包括花棒外植体的选择，生长点组织培养中初代培养基、继代培养基和生根培养基选择，组织培养过程中培养条件的选择等内容。
背景技术
花棒，别名细枝岩黄耆、花子柴、花柴、花秧子、花帽和牛尾梢等，为豆科蝶形花亚科岩黄耆属落叶大灌木，荒漠区典型的固沙先锋植物。分布于中亚干旱半干旱沙漠或沙地，中国的古尔班通古特沙漠、巴丹吉林沙漠、河西走廊沙地、腾格里沙漠、乌兰布和沙漠、库布齐沙漠西部有自然群体，其他沙漠或沙地有人工种植群体及其后代。东部沙地引种花棒，生长良好，甚至优于自然分布区。花棒是优良固沙灌木，有一定的经济效益，在沙区生态文明建设过程中，其苗木需求量很大。
植物组织培养是很重要的生物技术手段。植物的细胞、茎段、叶片等均可以培养。取植物的细胞、器官和组织，置入适当培养基的容器中，在一定的培养条件下，可分化形成完整植株。作为生物技术有力手段的组织培养，日益受到重视，在农林作物的脱毒快繁、突变诱发、细胞工程和基因工程等方面都发挥着重要作用。
组织培养在离体培养条件下，不同植物以及同种植物不同部位的组织细胞对营养要求不同，只有满足了它们各自的特殊要求，才能更好地生长发育。掌握培养基的配制及筛选方法是取得组培成功的关键环节之一。
通过组培扩繁技术提高工厂化花棒育苗数量是解决花棒生态用苗的有效途径。但目前现有技术对花棒的组织培养仍处于摸索阶段，在制定技术方案时可以参考的资料不多，都必须通过试验来逐一解决，关键要解决外植体取材部位、时期，各培养时期培养基的选择，培养条件以及成苗后快繁技术等。花棒的组培扩繁一般包括初代诱导→继代增殖→生根培养三个时期，寻找每个单独环节的培养基较为容易，要实现各代培养基效果的延续比较困难。本发明以开发利用，降低成本为目标，以形成工厂化、产业化生产为目的，提供了花棒组培扩繁的新方案。
发明内容
本发明系统地研究了花棒的外植体的选择、最佳培养条件、不同阶段的最佳培养基及增殖培养代数。
本发明提供了一种花棒的组织培养方法，其特征在于由以下步骤组成：
步骤1：外植体取自花棒嫩枝的生长点；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，诱导分化出丛生芽；
步骤3：将初代诱导的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
步骤4：将上述诱导生根后的花棒生根苗进行移栽。
所述的初代诱导培养的条件为培养温度25±1℃，光照强度1500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2000-3000Lx，除白天自然光照外，夜间补光1小时/天。
所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光。
所述步骤1中花棒外植体的灭菌处理过程为：采花棒幼嫩枝条上长约0.2-0.5cm的生长点，在超净台上放入无菌容器中，用0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗2次，每次5min，最后无菌滤纸上吸干水分。
所述步骤2和步骤3的接种过程中，将花棒生长点插入培养基。
所述步骤4还包括花棒生根后的炼苗移栽阶段，优选地栽培基质为质量比为蛭石0.5-1.5%，沙土40-60%，羊粪20-30%，草炭磷酸二铵20-28%，更优选为蛭石1%，沙土50%，羊粪25%，草炭磷酸二铵24%。
优选地，所述初代诱导培养基为B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.05-0.1 mg/L+CH 0.5-1g/L；更优选地为B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L。。
优选地，所述继代培养基为改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1-2mg/L+CH 0.5-1g/L，更优选为改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH 0.5g/L。
优选地，所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭1g/L。
本发明提供了一种花棒的组织培养方法，操作简便，成本低廉，具有良好的应用前景。本发明系统地研究了花棒的组培中不同阶段的最佳培养基，最适的培养条件及培养方式，解决了花棒组织培养的玻璃化、缩短育苗时间、栽培中种源较少的问题的难题，为实现花棒的工厂化生产奠定了可靠的基础。通过实验还发现了花棒的各代培养增殖不是独立的，各个环节是相互影响的，初代培养环境会影响继代培养的适应性，增殖阶段的培养环境又会影响生根培养，本申请在此基础上提供了一种较优的培养基组合，使花棒在组培扩繁的各个阶段不断促进，能大大提高工厂化花棒育苗的产量。
具体实施方式
为了更好地说明本发明，便于理解本发明的技术方案，下面对本发明进一步详细说明。但下述的实施例仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明保护范围以权利要求书为准。
一、花棒外植体的材料
实验用的花棒采自内蒙古蒙草生态环境（集团）股份有限公司抗旱植物研究院实验基地的试验苗圃，根据试验进展、不同时期取样并随时取样补充。采花棒幼嫩枝条上长约0.2-0.5cm的生长点，在无菌条件下切取。经流水冲洗后，用0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗2次，每次5min，无菌滤纸上吸干水分，接种于初代诱导培养基上，建立试管苗无性繁殖系。选取继代10d左右的丛生芽，丛生芽剪去基部；取丛生芽的生长点，长约0.2-0.5cm，作为再生的外植体。
二、筛选统计方法
成活率＝(有生活力的外植体数/接种的外植体总数)×100％
初代芽诱导率＝(出芽的外植体数/接种的外植体总数)×100％
继代增殖倍数＝(诱导出的丛生芽数/接入单株芽的总数)×100％
生根率＝(分化根的外植体数/接种的外植体总数)×100％
三、花棒组织培养各个阶段最佳培养基的筛选
以B5为基本培养基，用3.5g/L的卡拉胶作固化剂，40g/L食用白糖代替蔗糖作为碳源，以自来水代替蒸馏水，分别添加不同配比的细胞分裂素和生长素进行培养基的筛选。
1、初代诱导培养基的选择
将6-BA的浓度设0.2mg/L、0.5mg/L两个浓度梯度，NAA的浓度设0.01mg/L、0.05mg/L两个浓度梯度，GA3的浓度设0.1mg/L、0.05mg/L两个浓度梯度， CH的浓度设0.5mg/L、1mg/L两个浓度梯度，进行不同组配，接种时每瓶接2-3个花棒生长点(长约0.2-0.5cm)，观察生长点在不同培养基上不定芽的发生情况。
初代诱导培养的条件为培养温度25±1℃，光照强度1500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
从表1可见，8种激素组合均可诱导花棒分化丛生芽，但各个组合的分化率不同，1号B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L和9号B5+NAA0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 1g/L是花棒生长点培养基是较佳的诱导培养基，不但诱导率高，而且每个外植体新增芽数多，分化率最高，其分化率可达218.75％和226.25%。
表1：激素浓度及其组合对花棒生长点丛生芽诱导率的影响
处理编号 培养基成分 接种数（个） 丛生芽数 丛生芽诱导率（%）
1 B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L 80 175 218.75
2 B5+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.2mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L 80 77 96.25
3 B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L 80 34 42.5
4 B5+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L 80 62 77.5
5 B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.05 mg/L+CH 1g/L 80 146 182.5
6 B5+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.2mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0. 05 mg/L+CH 1g/L 80 82 102.5
7 B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.2mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0. 05 mg/L+CH 1g/L 80 113 141.25
8 B5+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0. 05 mg/L+CH 1g/L 80 37 46.25
9 B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 1g/L 80 181 226.25
10 B5+NAA 0.05mg/L+6-BA 0.2mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1mg/L+CH 1g/L 80 98 122.5
在本实施方案中，B5培养基具体组成为：
大量元素：KNO3 2500mg/L；MgSO4·7H2O 250mg/L；CaCl2·2H2O 150mg/L；(NH4)2SO4134mg/L；NaH2PO4·H2O 150mg/L
微量元素：KI 0.75mg/L；H3BO3 3mg/L；MnSO4·4H2O 10mg/L；ZnSO4·7H2O 2mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；CuSO4·5H2O 0.025mg/L；CoCl2·6H2O 0.025mg/L
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L
有机物质：肌醇100mg/L；烟酸1mg/L；盐酸吡哆醇(维生素B6)1mg/L；盐酸硫胺素(维生素B1)10mg/L。
2、继代增殖培养基的选择
将上述诱导分化出的不定芽分别接种到继代增殖培养基上，标记好初代培养基编号，NAA设0.3mg/L、0.5mg/L两个浓度梯度，6-BA设1mg/L、2mg/L两个浓度梯度，CH设0.5g/L、1g/L两个浓度梯度，共八种培养基，每瓶接4个单株，观察记录再生不定芽的分化生长情况，15天后统计不同激素组合条件下芽的增殖率。
继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2000-3000Lx，除白天自然光照外，夜间补光1小时/天。经诱导培养后，将在诱导培养基中产生的0.2-0.5cm的花棒丛生芽生长点分别移入继代增殖培养基中(见表2)，2-3天后部分材料的芽基部出现芽丛时开始观察记录，15天后统计试验结果，部分数据见表2（其他特征不明显或效果不明显的数据未记入）。
表2：激素浓度及其组合对花棒不定芽增殖的影响
处理编号 初代培养基编号 培养基成分 增殖倍数 不定芽生长状况
1 1 改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH 0.5g/L 21.68 强健，新出苗多，产生不定芽多
2 1 改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH 1g/L 10.49 较强健，新出苗较多，玻璃化较多
3 1 改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 2mg/L+CH 0.5g/L 1.96 细弱，基本没有新出苗
4 1 改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 2mg/L+CH 1g/L 15.64 较强健，新出苗多，产生玻璃化少
5 1 改良B5+NAA 0.5mg/L+6-BA 1mg/L+CH 0.5g/L 14.73 较强健，新出苗多，产生玻璃化少
6 1 改良B5+NAA 0.5mg/L+6-BA 1mg/L+CH 1g/L 5.84 细弱，新出苗少
7 1 改良B5+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+CH 0.5g/L 7.72 较强健，新出苗少，生长慢
8 1 改良B5+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+CH 1g/L 11.09 强健，新出苗较多，产生玻璃化较少
9 9 改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH 0.5g/L 16.73 较强健，新出苗多，产生不定芽多
10 9 改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 2mg/L+CH 1g/L 12.57 较强健，新出苗较多，产生玻璃化少
11 9 改良B5+NAA 0.5mg/L+6-BA 2mg/L+CH 1g/L 9.72 较强健，新出苗少，产生玻璃化较少
试验表明，花棒在改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH 0.5g/L的继代培养中，对丛生芽的生长有促进作用，相比其他组合更为理想，增值倍数最高可达21.68倍，丛生芽数量多，幼苗较大，移植出苗率效果最佳。但通过对比不同初代培基不定芽的继代增殖倍数，可以发现初代培养基的激素环境会对不定的芽后期增殖阶段的适应性带来影响，综合结果表明：初代培养基B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH0.5g/L和继代培养基B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH 0.5g/L的组合效果最佳。在本实施方案中，其中改良B5培养基是由B5培养基中的大量元素、微量元素使用量分别减半而得到的，用于花棒继代增殖培养的基本培养基,具体组成如下为：
大量元素：KNO3 1250mg/L；MgSO4·7H2O 125mg/L；CaCl2·2H2O 75mg/L；(NH4)2SO467mg/L； NaH2PO4·H2O 75mg/L
微量元素：KI 0.375mg/L；H3BO3 1.5mg/L；MnSO4·4H2O 5mg/L；ZnSO4·7H2O 1mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L；CuSO4·5H2O 0.0125mg/L；CoCl2·6H2O 0.0125mg/L
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L
有机物质：肌醇100mg/L；烟酸1mg/L；盐酸吡哆醇(维生素B6)1mg/L；盐酸硫胺素(维生素B1)10mg/L。
3、生根培养基的选择
将继代培养基中长势较好的苗，分成单株转入生根培养基中，每瓶接入4株，观察记录不同培养基上苗的生根情况，10天后统计生根率。
生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光。
从生根培养10天的试验结果来看(表3)，两个培养基对根的形成均有诱导作用，其中2号生根培养基生根效果较好，生根率达91.56％。生根基部可新增带根的丛生芽，平均可达3-4个。可见低盐浓度对花棒根的生长有利，对比初代培养基和继代培养基的影响，可以看出，在初代培养或继代培养过程中受高激素刺激的幼苗会更适应高盐浓度生根培养基。但采用低激素含量和低盐浓度的培养基配合，使花棒在初代培养、继代培养和生根培养均保持较好的增殖、生根效果更是本领域技术人员想要的结果，不仅可以降低成本，还可以减少花棒扩繁生长对人造因素的依赖。因此，适宜生根的培养基是1/2MS+IAA 0.1mg/L+NAA0.5mg/L+活性炭1g/L。
表3：无机盐对幼苗生根的影响
处理编号 继代培养基编号 培养基成分 生根率（%） 根系生长状况
1 1 MS+IAA 0.2mg/L+NAA 1mg/L+活性炭2g/L 65.89 粗短，数量少
2 1 1/2MS+IAA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭1g/L 91.56 长，数量多
3 9 MS+IAA 0.2mg/L+NAA 1mg/L+活性炭2g/L 74.48 粗短，数量少
4 9 1/2MS+IAA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭1g/L 86.74 长，数量多
生根培养后，为了提高花棒幼苗对移栽环境的适应性，可以对其进行炼苗，优选地栽培基质为质量比为蛭石0.5-1.5%，沙土40-60%，羊粪20-30%，草炭磷酸二铵20-28%，更优选为蛭石1%，沙土50%，羊粪25%，草炭磷酸二铵24%。
以上实施例目的是为具体说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

Claims (5)

1.一种花棒的组织培养方法，其特征在于由以下步骤组成：
步骤1：自花棒嫩枝的生长点取外植体；
步骤2：将外植体接种于初代诱导培养基上，诱导分化出丛生芽；初代诱导培养基为B5+NAA 0.1mg/L+6-BA 0.5mg/L+2.4-D 0.1mg/L+GA3 0.1 mg/L+CH 0.5g/L；
步骤3：将初代诱导的丛生芽在继代培养基上培养；将继代培养基中长势较好的苗转入生根培养基中，诱导生根；
步骤4：将上述诱导生根后的花棒生根苗进行移栽；移栽后的栽培基质质量比为蛭石1%、沙土50%、羊粪25%、草炭磷酸二铵24%；
所述继代培养基为改良B5+NAA 0.3mg/L+6-BA 1mg/L+CH0.5g/L；
所述改良B5培养基是由B5培养基中的大量元素、微量元素使用量分别减半而得到的，用于花棒继代增殖培养的基本培养基，具体组成如下为：
大量元素：KNO3 1250mg/L；MgSO4·7H2O 125mg/L；CaCl2·2H2O 75mg/L；(NH4)2SO467mg/L；NaH2PO4·H2O 75mg/L；
微量元素：KI 0.375mg/L；H3BO3 1.5mg/L；MnSO4·4H2O 5mg/L；ZnSO4·7H2O 1mg/L；Na2MoO4·2H2O 0.125mg/L；CuSO4·5H2O 0.0125mg/L；CoCl2·6H2O 0.0125mg/L；
铁盐：FeSO4·7H2O 27.8mg/L；Na2-EDTA 37.3mg/L；
有机物质：肌醇100mg/L；烟酸1mg/L；盐酸吡哆醇(维生素B6)1mg/L；盐酸硫胺素(维生素B1)10mg/L；
所述生根培养基为1/2MS+IAA 0.1mg/L+NAA 0.5mg/L+活性炭1g/L。
2.根据权利要求1所述的花棒组织培养方法，其特征在于：所述的初代诱导培养的条件为培养温度25±1℃，光照强度1500Lx，除白天自然光照外，夜间补光4小时/天。
3.根据权利要求1所述的花棒组织培养方法，其特征在于：所述的继代培养条件为培养温度25±1℃，光照强度2000-3000Lx，除白天自然光照外，夜间补光1小时/天。
4.根据权利要求1所述的花棒组织培养方法，其特征在于：所述的生根培养条件为培养温度25±1℃，除白天自然光照外，夜间不补光。
5.根据权利要求1所述的花棒组织培养方法，其特征在于：步骤1中花棒外植体的灭菌处理过程为采花棒幼嫩枝条上长约0.2-0.5cm的生长点，在超净台上放入无菌容器中，用0.1％的升汞溶液消毒5min，无菌水冲洗2次，每次5min，最后无菌滤纸上吸干水分。
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