CN102870680B - 一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法 - Google Patents
一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法 Download PDFInfo
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Abstract
一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法，其特征在于，采用外植体材料为当年生幼嫩枝，采用以下步骤获得优质脱毒苗：a、无菌苗的获得，b、丛生芽的诱导与增殖，c、叶片再生体系的建立，d、试管苗生根培养，e、炼苗；优质脱毒苗采用以下方法进行改良：f、丛生芽的诱导与增殖，g、叶片再生体系的优化，h、试管苗的瓶内生根优化，i、炼苗基质的优化。本方法从叶片再生、增殖培养、生根培养到炼苗这一系列环节进行了优化，建立了一种可高效、快速、持续获得优良的脱毒兔眼组培种苗技术。
Description
技术领域
本发明涉及一种脱毒蓝莓高效快繁技术，具体涉及一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法。
背景技术
蓝莓属杜鹃花科越橘属（Vaccinum），为多年生落叶或者常绿小果类灌木型果树。蓝莓果实富含花青素、不饱和脂肪酸、鞣花酸及钙、钾、锌、铁等元素, B 族维生素在蓝浆果中含量尤为突出，具有很高的保健功能，被国际粮农组织列为五大健康食品之一，堪称世界水果之王，是近几年来发展最迅速的集营养与保健于一身的第3代果树品种。
兔眼蓝莓(Vaccinium ashei Reade) 是越桔属中经济价值较高的一种，品质佳，口感好，其生态适应性、生长势和抗病虫性较强，无论高地还是低地、粘土或沙土上均能生长，非常适合我国南方栽培。随着引种规模日益扩大, 优良种苗需求量急剧增加，种苗生产供不应求。
因此，研究一种新型的脱毒适宜兔眼蓝莓高效快繁方法已为亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术存在的缺陷，本发明的目的是提出一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法，组织培养凭借其无性繁殖的独特优势，可以迅速去除病毒和更新品种，保留品种的本来特性，变异性小，并且可在较小空间内和较短时间内快速地获得大量无性系脱毒组培苗，成为蓝莓脱毒和快速繁殖的主要途径，本发明就兔眼蓝莓建立了一种脱毒高速快繁的有效方法。
本发明的技术方案是：一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法，采用外植体材料为当年生幼嫩枝，通过以下步骤获得脱毒试管苗：a、嫩枝摘除叶片，清洗嫩枝，嫩枝切段形成单芽茎段，然后放置在培养基中培养，完成无菌苗的获得步骤，b、待单芽茎段叶芽伸长后，切下叶芽转接在改良培养基中，完成丛生芽的诱导与增殖步骤，c、取无菌苗植株上碧绿的叶片，按照不同的叶片切法、不同的培养方式、不同浓度的ZT筛选最合适的叶片，培养在改良培养基中，完成叶片再生体系的建立步骤，d、剪取苗的单芽茎段，在改良培养基中培养，从不同盐浓度、不同活性碳浓度、不同IBA浓度的培养基中筛选出最适宜生根培养基，完成试管苗生根培养步骤，e、在炼苗基质中培养，炼苗时打开培养瓶的瓶盖进行培养环境的过渡，在湿度100%的室内环境下培养，然后过渡到湿度80%、透光度70%的室外条件下，然后再逐步通风换气环境下培养，统计成活率，完成炼苗步骤；幼嫩枝采用以下步骤进行优化改良：f、将获得的无菌苗转接到不同的增值培养基上进行比较，丛生芽生长速度慢，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本方面进行综合考虑，得到最佳的改良培养基，以完成丛生芽的诱导与增殖的改良，g、进行叶片不同部位对重生苗诱导的影响测试，按垂直叶片主脉方向将叶片切成二部分，叶片背面朝下接种于培养瓶内，统计重生率，进行不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响测试，随着暗培养时间的延长，重生苗诱导频率呈增高趋势，不经暗培养直接在光照培养条件下或暗培养条件下的重生率，进行ZT浓度对诱导叶片重生苗的影响测试，测试不同浓度的ZT对叶片重生苗的诱导作用，以完成叶片再生体系的建立的改良，h、进行盐浓度对生根的影响测试，进行单个芽苗在不同盐浓度的生根培养基中的生根诱导率存在差异比对，进行活性碳和生长素对生根的影响测试，活性碳对组培苗瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性碳时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后生根，由于茎根之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势差，活性碳对杰兔生根具有促进作用，以完成试管苗的瓶内生根改良，i、剪取2cm左右长的无菌苗新梢在生根培养基中生长，约45d左右苗高长至5-6cm时，生根率达95%，对生根苗移栽在5种不同基质上，统计成活率，以完成炼苗基质的优化。
优选方法，步骤：无菌苗的获得是以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片，用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后，经自来水冲洗，转到超净工作台上，先后用75%酒精和0.1%升汞对外植体分别进行50s与10min的表面灭菌,接着用无菌水冲洗4次, 每次约2min，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分，将枝条切成1-2cm长的单芽茎段，WPM培养基具体改良方法: 以Ca(NO3) 2·4H2O、KNO3代替原WPM培养基中的K2 SO4、CaCl2，在无菌条件下将单芽茎段接种于改良WPM、1.0mg /L ZT、20g /L 蔗糖和 9g/L日产琼脂粉的培养基（pH=5.2）上诱导侧芽萌发，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过光周期16h光照和8h黑暗的光周期，30d后茎段叶芽伸长约4-6cm，叶片数量达7-9枚。
优选方法，步骤：丛生芽的诱导与增殖是待茎段叶芽伸长后, 切下转接于以改良WPM为基本培养基, 加蔗糖20 g/L, 日产琼脂粉8.8 g/L, 附加不同浓度的ZT和/或6-BA，pH值为5.2的增殖培养基中，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过光周期16h光照和8h黑暗的光周期。6-苄氨基腺嘌呤（6-BA，英文通用名：6-Benzylaminopurine）细胞分裂素，可抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质的分解；保绿防老：将氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运。
优选方法，步骤：叶片再生体系的建立是以改良WPS 、1.0mg /LZT、20g/L蔗糖和9g/L琼脂粉pH=5.2为培养基，取无菌苗植株上碧绿的叶片，按不同的叶片切法、不同培养方式、不同浓度的ZT，筛选最合适的叶片再生体系，背面朝下，叶尖与叶柄分开放置，接种于培养瓶内，每瓶10片左右，每个处理组重复8-10瓶，叶片切法包括4种不同的叶片切法，4种不同的叶片切法为垂直叶片主脉切取叶片的1/2、1/3、2/3以及全叶；培养方式为：暗培养时间分别为0d、7d、20d和30d，每个处理重复15-20次，暗培养温度为25±2℃，几种浓度ZT为0.5、0.8、1.1、1.4、1.7或2.0，30d后观察记录叶片的出芽率与生长状况，计算诱导重生苗率=诱导重生苗形成的叶片数/接种叶片数，从而获得最佳的叶片再生体系，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过光周期16h光照和8h黑暗的光周期。
优选方法，步骤：试管苗生根培养为剪取苗高约2.0cm 左右的单芽茎段, 改良WPS为基本培养基，另添加蔗糖20g/L，琼脂9g/L，pH值5.3左右，从不同盐浓度（WPS、1/2WPS、1/4 WPS、1/8 WPS）、不同活性炭浓度（0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）、不同IBA浓度（0.1mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L）的培养基中筛选出最适宜的生根培养基，培养条件为：温度25±2℃、光强2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗，炼苗时, 提前3 d 打开瓶盖进行过渡，移栽后在组培室条件下保持湿度100%的塑料棚中培养20 d, 然后在湿度80%、透光度70%的室外条件下过渡7 d 再逐步通风换气，15d 后, 完全揭去棚膜，2 周后统计成活率，炼苗时, 每套基质的栽植量不少于50 株，各试验的重复次数不少于3 次。几种炼苗基质为：草炭∶河沙=1∶1；草炭∶田土=1∶1；草炭∶石英砂=2～3∶1；草炭∶珍珠岩=1～2∶1；全部采用水苔藓。吲哚丁酸（IBA，Indole-3-Butytric acid）促进植物主根生长，提高发芽率，成活率。用于促使插条生根。
优选方法，步骤：丛生芽的诱导与增殖是将获得的无菌苗转接到几种增殖培养基上进行比较，在WPM和ZT 中,不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系，当ZT 质量浓度为1 mg/L 时, 10d左右在茎基部开始出现丛生芽, 20 d后增殖率超过6倍，经几次继代后，增殖率高达40-50倍，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状；当ZT 质量浓度升高到2 mg/L 时, 开始生长和分化的时间与1 mg/L 时相差不大，其增殖率稍有所增加；当ZT质量浓度高于2 mg/L 时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2 次枝, 增殖率超过12倍，苗长势较弱且同时出现玻璃化苗现象，WPM与其它激素组合效果均差于WPM和ZT 组合，使用6-BA 时, 0.5 mg/L 和1 mg/L 2 种质量浓度差异不大, 它们均会在2 周后出现生长和萌芽态势, 增殖率为4～5 倍，其丛生芽生长缓慢，叶小且发红，而对于6-BA和ZT 组合来讲, 10 d 后出现少量愈伤, 增殖率为6～8 倍，丛生芽生长速度慢，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本方面进行综合考虑，继代培养基以改良WPM和1 mg/L ZT为最佳。
优选方法，叶片不同部位对重生苗诱导的影响,离叶尖1/3、1/2、2/3或全叶，按垂直叶片主脉方向将叶片切成二部分，叶片背面朝下接种于培养瓶内，30天后统计叶片重生率；不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响，在建立植物再生体系的研究中，暗培养是某些植物外植体重生苗的重要影响因素，不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响，随着暗培养时间的延长，重生苗诱导频率呈增高趋势，不经暗培养直接在光照条件下的叶片重生率仅为29.3﹪，暗培养20d后的叶片重生率高达93.2﹪。当暗培养时间超过30天后，虽然叶片重生率超过90%，由于叶片重生苗在暗培养时形成白化畸形苗，其有效苗数反而减少，20天的暗培养时间最为适宜；ZT浓度对诱导叶片重生苗的影响，ZT是一种高活力的细胞分裂素，具有打破植株顶端优势、促进腋芽萌发、诱导不定芽形成的作用，将离叶尖1/3处按垂直叶片主脉方向将叶片切成叶尖端和叶柄端二部分，研究不同浓度的ZT对叶片重生苗的诱导作用，0.5-2.0mg/L ZT均能诱导叶片不经愈伤组织直接出芽，植株的变异性减少，不同浓度的ZT对叶片重生苗诱导的效果存在明显差异；0.5mg/L ZT对叶片重生苗的诱导率低，尚不足50%，叶片的叶尖端主要诱导簇生苗，叶柄端主要诱导单生苗；随着ZT浓度的升高，叶片重生苗的诱导率增加；在1.7mg/L ZT时达到最高，叶片的叶尖端与叶柄端的重生苗诱导率分别达到93.8%和79.5%，且主要为簇生苗，在2.0mg/L ZT时均有所下降，诱导叶片形成重生苗的最佳ZT 质量浓度为1.7mg/L。
优选方法，盐浓度对生根的影响，单个芽苗在不同盐浓度的生根培养基中的生根诱导率存在差异，高盐浓度不利于芽苗生根，大量元素不减少时仅在茎切段形成愈伤组织；大量元素减半时，在20天左右开始生根，生根率达40%；大量元素减少到原来的1/4时，开始生根的时间为10天左右，生根率提高到90%以上，苗长势强，叶色绿；而大量元素减少到原来的1/8时， 第8天左右就开始生根，生根率也达到了90%以上，由于营养物质的缺乏，苗长势弱，叶色黄且无光泽。因此适当降低盐浓度有利于生根且不影响苗的生长；活性碳和生长素对生根的影响，活性碳对组培苗瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性碳时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后生根，由于茎根之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势差。活性炭对杰兔生根具有促进作用，但是存在不同的浓度效应：效果最好的是0.1%活性碳，在0.1-0.8mg/L IBA的有效生根率均达到80%以上，特别是在0.1mg/L IBA时生根率达到了90%以上，茎基部产生愈伤组织较少或不产生愈伤组织，茎生长正常，10d左右可见茎基部有根形成，45d左右长出4-6条根，根长达6cm左右；效果其次的是0.15%活性碳，在0.1mg/L IBA时其有效生根率也达到了80%以上；当培养基中的活性碳为0.2%时，有效生根率明显降低，有效根数和根长也减少；培养瓶内生根培养基中最佳的活性炭浓度和IBA浓度分别为0.1%和0.1mg/L，有效生根率高达95%。
优选方法，步骤炼苗基质的优化是剪取2cm左右长的无菌苗新梢在生根培养基中生长，45d左右苗高长至5-6cm时，生根率达95%，对生根苗移栽在5种不同基质上，1.5个月后统计成活率。结果表明，水苔藓的效果最好，成活率高达100%，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片6-8枚。效果其次的是2～3∶1 的草炭与石英砂组合,其成活率为86%, 苗木的生长量较高。1∶1 的草炭与河沙基质的成活率仅为52%, 但成活苗的质量却很高，表现为生长墩实、植株健壮、生长量与“草炭+石英砂”相当。草炭+园土基质与草炭+珍珠岩基质的效果居中。
本发明的有益技术效果是：
本方法从叶片再生、增殖培养、生根培养到炼苗这几个环节进行了一系列的优化，建立了一套可高效、快速、持续获得优良的脱毒兔眼组培种苗的技术体系，有助与我国蓝莓产业化发展。
附图说明
图1是本发明实施例适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法的不同增值培养基上茎段的增值率的柱形图。
图2是本发明实施例适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法的不同炼苗基质对试管苗成活率的影响的柱形图。
本发明目的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
具体实施的一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法，采用外植体材料为当年生幼嫩枝，通过以下步骤快速获得脱毒试管苗：a、嫩枝摘除叶片，清洗嫩枝，嫩枝切段形成单芽茎段，然后放置在培养基中培养，完成无菌苗的获得步骤，b、待单芽茎段叶芽伸长后，切下叶芽转接在改良培养基中，完成丛生芽的诱导与增殖步骤，c、取无菌苗植株上碧绿的叶片，按照不同的叶片切法、不同的培养方式、不同浓度的ZT筛选最合适的叶片，培养在改良培养基中，完成叶片再生体系的建立步骤，d、剪取苗的单芽茎段，在改良培养基中培养，从不同盐浓度、不同活性炭浓度、不同IBA浓度的培养基中筛选出最适宜生根培养基，完成试管苗生根培养步骤，e、在炼苗基质中培养，炼苗时打开培养瓶的瓶盖进行培养环境的过渡，在湿度100%的室内环境下培养，然后过渡到湿度80%、透光度70%的室外条件下，然后再逐步通风换气环境下培养，统计成活率，完成炼苗步骤；幼嫩枝采用以下步骤进行优化改良：f、将获得的无菌苗转接到不同的增值培养基上进行比较，丛生芽生长速度慢，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本方面进行综合考虑，得到最佳的改良培养基，以完成丛生芽的诱导与增殖的改良，g、进行叶片不同部位对重生苗诱导的影响测试，按垂直叶片主脉方向将叶片切成二部分，叶片背面朝下接种于培养瓶内，统计重生率，进行不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响测试，随着暗培养时间的延长，重生苗诱导频率呈增高趋势，不经暗培养直接在光照培养条件下或暗培养条件下的重生率， 进行ZT浓度对诱导叶片重生苗的影响测试，测试不同浓度的ZT对叶片重生苗的诱导作用，以完成叶片再生体系的建立的改良，h、进行盐浓度对生根的影响测试，进行单个芽苗在不同盐浓度的生根培养基中的生根诱导率存在差异比对，进行活性碳和生长素对生根的影响测试，活性碳对组培苗瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性碳时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后生根，由于茎根之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势差，活性炭对杰兔生根具有促进作用，以完成试管苗的瓶内生根改良，i、剪取2cm左右长的无菌苗新梢在生根培养基中生长，约45d左右苗高长至5-6cm时，生根率达95%，对生根苗移栽在5种不同基质上，统计成活率，以完成炼苗基质的优化。
本发明还在于，步骤：无菌苗的获得是以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片，用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后，经自来水冲洗，转到超净工作台上，先后用75%酒精和0.1%升汞对外植体分别进行50s与10min的表面灭菌,接着用无菌水冲洗4次, 每次约2min，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分，将枝条切成1-2cm长的单芽茎段，WPM培养基具体改良方法: 以Ca(NO3) 2·4H 2O、KNO3代替原WPM培养基中的K2 SO4、CaCl2，在无菌条件下将单芽茎段接种于改良WPM、1.0mg /L ZT、20g /L 蔗糖和 9g/L日产琼脂粉的培养基（pH=5.2）上诱导侧芽萌发，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过光周期16h光照和8h黑暗的光周期，30d后茎段叶芽伸长约4-6cm，叶片数量达7-9枚。
本发明还在于，步骤：丛生芽的诱导与增殖是待茎段叶芽伸长后, 切下转接于以改良WPM为基本培养基, 加蔗糖20 g/L, 日产琼脂粉8.8 g/L, 附加不同浓度的ZT和/或6-BA的增殖培养基（pH=5.2）中，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过光周期16h光照和8h黑暗的光周期。
本发明还在于，步骤：叶片再生体系的建立是以改良WPS 、1.0mg/LZT、20g/L蔗糖和9g/L琼脂粉为培养基（pH=5.2），取无菌苗植株上碧绿的叶片，按不同的叶片切法、不同培养方式、不同浓度的ZT，筛选最合适的叶片再生体系，背面朝下，叶尖与叶柄分开放置，接种于培养瓶内，每瓶10片左右，每个处理组重复8-10瓶，叶片切法包括4种不同的叶片切法，4种不同的叶片切法为垂直叶片主脉切取叶片的1/2、1/3、2/3以及全叶；培养方式为：暗培养时间分别为0d、7d、20d和30d，每个处理重复15-20次，暗培养温度为25±2℃，几种浓度ZT为0.5、0.8、1.1、1.4、1.7或2.0，30d后观察记录叶片的出芽率与生长状况，计算诱导重生苗率=诱导重生苗形成的叶片数/接种叶片数，从而获得最佳的叶片再生体系，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过光周期16h光照和8h黑暗的光周期。
本发明还在于，步骤：试管苗生根培养为剪取苗高约2.0cm 左右的单芽茎段, 改良WPS为基本培养基，另添加蔗糖20g/L、琼脂9g/L（pH=5.3），从不同盐浓度、不同活性碳浓度、不同IBA浓度的培养基中筛选出最适宜的生根培养基，培养条件为：温度25±2℃、光强2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗，炼苗时, 提前3 d 打开瓶盖进行过渡，移栽后在组培室条件下保持湿度100%的塑料棚中培养20 d, 然后在湿度80%、透光度70%的室外条件下过渡7 d 再逐步通风换气，15 d后, 完全揭去棚膜，2 周后统计成活率，炼苗时, 每套基质的栽植量不少于50 株，各试验的重复次数不少于3 次。
本发明还在于，炼苗基质选择草炭∶河沙=1∶1；或者草炭∶田土=1∶1；或者草炭∶石英砂=2～3∶1；或者草炭∶珍珠岩=1～2∶1；或者全部采用水苔藓。结果发现，水苔藓的效果最好，成活率高达100%，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片6-8枚。效果其次的是2～3∶1 的草炭与石英砂组合，其成活率为86%，苗木的生长量较高。1∶1 的草炭与河沙基质的成活率仅为52%, 但成活苗的质量却很高，表现为生长墩实、植株健壮、生长量与“草炭+石英砂”相当。草炭+园土基质与草炭+珍珠岩基质的效果居中
本发明还在于，步骤：丛生芽的诱导与增殖是将获得的无菌苗转接到几种增殖培养基上进行比较，在WPM和ZT 中,不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系，当ZT 质量浓度为1 mg/L 时, 10d左右在茎基部开始出现丛生芽, 20 d后增殖率超过6倍，经几次继代后，增殖率高达40-50倍，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状；当ZT 质量浓度升高到2 mg/L 时, 开始生长和分化的时间与1 mg/L 时相差不大，其增殖率稍有所增加；当ZT质量浓度高于2 mg/L 时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2 次枝,增殖率超过12倍，苗长势较弱且同时出现玻璃化苗现象，WPM与其它激素组合效果均差于WPM和ZT 组合，使用6-BA 时, 0.5 mg/L 和1mg/L 2 种质量浓度差异不大, 它们均会在2 周后出现生长和萌芽态势, 增殖率为4～5 倍，其丛生芽生长缓慢，叶小且发红，而对于6-BA和ZT 组合来讲, 10 d 后出现少量愈伤, 增殖率为6～8倍，丛生芽生长速度慢，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本方面进行综合考虑，继代培养基以改良WPM和1 mg/L ZT为最佳。
本发明还在于，叶片不同部位对重生苗诱导的影响，离叶尖1/3、1/2、2/3或全叶，按垂直叶片主脉方向将叶片切成二部分，叶片背面朝下接种于培养瓶内，30d后统计叶片重生率；不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响，在建立植物再生体系的研究中，暗培养是某些植物外植体重生苗的重要影响因素，不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响，随着暗培养时间的延长，重生苗诱导频率呈增高趋势，不经暗培养直接在光照条件下的叶片重生率仅为29.3﹪，暗培养20d后的叶片重生率高达93.2﹪。当暗培养时间超过30d后，虽然叶片重生率超过90%，由于叶片重生苗在暗培养时形成白化畸形苗，其有效苗数反而减少，20d的暗培养时间最为适宜；ZT浓度对诱导叶片重生苗的影响，ZT是一种高活力的细胞分裂素，具有打破植株顶端优势、促进腋芽萌发、诱导不定芽形成的作用，将离叶尖1/3处按垂直叶片主脉方向将叶片切成叶尖端和叶柄端二部分，研究不同浓度的ZT对叶片重生苗的诱导作用，0.5-2.0mg/L ZT均能诱导叶片不经愈伤组织直接出芽，植株的变异性减少，不同浓度的ZT对叶片重生苗诱导的效果存在明显差异； 0.5mg/L ZT对叶片重生苗的诱导率低，尚不足50%，叶片的叶尖端主要诱导簇生苗，叶柄端主要诱导单生苗；随着ZT浓度的升高，叶片重生苗的诱导率增加；在1.7mg/L ZT时达到最高，叶片的叶尖端与叶柄端的重生苗诱导率分别达到93.8%和79.5%，且主要为簇生苗，在2.0mg/L ZT时均有所下降，诱导叶片形成重生苗的最佳ZT 质量浓度为1.7mg/L。
本发明还在于，盐浓度对生根的影响，单个芽苗在不同盐浓度的生根培养基中的生根诱导率存在差异，高盐浓度不利于芽苗生根，大量元素不减少时仅在茎切段形成愈伤组织；大量元素减半时，在20d左右开始生根，生根率达40%；大量元素减少到原来的1/4时，开始生根的时间为10d左右，生根率提高到90%以上，苗长势强，叶色绿；而大量元素减少到原来的1/8时， 第8天左右就开始生根，生根率也达到了90%以上，由于营养物质的缺乏，苗长势弱，叶色黄且无光泽。因此适当降低盐浓度有利于生根且不影响苗的生长；活性碳和生长素对生根的影响，活性碳对组培苗瓶内生根具有重要影响，当培养基中无活性碳时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后生根，由于茎根之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势差。活性炭对杰兔生根具有促进作用，但是存在不同的浓度效应：效果最好的是0.1%活性碳，在0.1-0.8mg/L IBA的有效生根率均达到80%以上，特别是在0.1mg/L IBA时生根率达到了90%以上，茎基部产生愈伤组织较少或不产生愈伤组织，茎生长正常，10d左右可见茎基部有根形成，45d左右长出4-6条根，根长达6cm左右；效果其次的是0.15%活性碳，在0.1mg/L IBA时其有效生根率也达到了80%以上；当培养基中的活性碳为0.2%时，有效生根率明显降低，有效根数和根长也减少；培养瓶内生根培养基中最佳的活性炭浓度和IBA浓度分别为0.1%和0.1mg/L，有效生根率高达95%。
本发明还在于，步骤炼苗基质的优化是剪取2cm左右长的无菌苗新梢在生根培养基中生长，45d左右苗高长至5-6cm时，生根率达95%，对生根苗移栽在5种不同基质上，1.5个月后统计成活率。
具体实施时：
1 材料与方法
1.1材料
植物材料为智博生物科技公司种植园种植的兔眼蓝莓品种—杰兔。外植体材料为当年生幼嫩枝。
1.2 方法
1.2.1 无菌苗的获得
以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片。用洗衣粉水溶液洗净灰尘等污物后, 自来水冲洗。转到超净工作台上, 先后用75%酒精和0. 1%升汞对外植体分别进行50s与10min的表面灭菌,接着用无菌水冲洗4次( 每次约2分钟) , 最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分。将枝条切成1-2cm长的单芽茎段，在无菌条件下将单芽茎段接种于WPM( 改良) + 1.0mg /L ZT + 20g /L 蔗糖+ 9g/L日产琼脂粉的培养基（pH=5.2）上诱导侧芽萌发。培养条件为：温度25±2℃、光强2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗。30d后茎段叶芽伸长约4-6cm，叶片数量达7-9枚。WPM培养基具体改良方法: 以Ca(NO3) 2·4H 2O、KNO3代替原WPM培养基中的K2 SO4、CaCl2。
1.2.2 丛生芽的诱导与增殖
待茎段叶芽伸长后, 切下转接于以改良WPM为基本培养基, 加蔗糖20 g/L, 日产琼脂粉8.8 g/L, 附加不同浓度的ZT和/或6-BA的增殖培养基（pH=5.2）中，具体是：0.5mg/L ZT，1.0mg/L ZT， 2.0mg/L ZT，5.0mg/L ZT，0.5mg/L 6-BA， 1.0mg/L 6-BA，0.5mg/L6-BA+1.0 mg/L ZT，1.0mg/L6-BA+ 1.0mg/L ZT。培养条件同上。
1.2.3 叶片再生体系的建立
以改良WPS +1.0mg /LZT+20g/L蔗糖+9g/L琼脂粉为培养基（pH=5.2），取无菌苗植株上碧绿的叶片，按不同的叶片切法、不同培养方式、不同浓度的ZT，筛选最合适的叶片再生体系。4种不同的叶片切法：垂直叶片主脉切取叶片的1/2、1/3、2/3以及全叶，背面朝下，叶尖与叶柄分开放置，接种于培养瓶内，每瓶10片左右，每个处理组重复8-10瓶。不同培养方式：暗培养时间分别为0d、7d、20d、30d,每个处理重复15-20（暗培养温度为25±2℃）。几种浓度ZT：0.5、0.8、1.1、1.4、1.7、2.0。30d后观察记录叶片的出芽率与生长状况，计算诱导重生苗率=诱导重生苗形成的叶片数/接种叶片数，从而获得最佳的叶片再生体系。培养条件同上。
1.2.4 试管苗生根培养
剪取苗高约2.0cm 左右的单芽茎段, 改良WPS为基本培养基，另添加蔗糖20g/L，琼脂9g/L（pH=5.3）。从不同盐浓度（WPS、1/2WPS、1/4 WPS、1/8 WPS）、不同活性炭浓度（0%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%）、不同IBA浓度（0.1mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L）的培养基中筛选出最适宜的生根培养基。培养条件同上。
1.2.5 炼苗
炼苗时, 提前3 d 打开瓶盖进行过渡。移栽后在组培室条件下保持湿度100%的塑料棚中培养20 d, 然后在湿度80%、透光度70%的室外条件下过渡7 d 再逐步通风换气。15 d 后, 完全揭去棚膜。2周后统计成活率。炼苗时, 每套基质的栽植量不少于50 株。各试验的重复次数不少于3 次。几种炼苗基质为：草炭∶河沙=1∶1；草炭∶田土=1∶1；草炭∶石英砂=2～3∶1；草炭∶珍珠岩=1～2∶1；全部采用水苔藓。
2.结果与分析
2.1 丛生芽的诱导与增殖
将获得的无菌苗转接到几种增殖培养基上进行比较。图1是本发明实施例适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁技术的不同增值培养基上茎段的增值率的柱形图，图1的结果表明，改良WPM+ZT的增殖效果明显优于改良WPM+6-BA和改良WPM+6-BA+ZT的组合。在WPM+ZT 中,不定芽的发生率与培养基中的ZT有密切的关系。当ZT 质量浓度为1 mg/L 时, 10d左右在茎基部开始出现丛生芽, 20 d后增殖率超过6倍，经几次继代后，增殖率高达40-50倍，丛生芽粗壮，生长势头好，呈鲜嫩状。当ZT质量浓度升高到2 mg/L 时, 开始生长和分化的时间与1 mg/L 时相差不大，其增殖率稍有所增加。当ZT质量浓度高于2 mg/L 时，再生苗开始生长和分化现象提前，多数分化出来的新梢枝上出现2 次枝, 增殖率超过12倍，苗长势较弱且同时出现玻璃化苗现象。WPM与其它激素组合效果均差于WPM+ZT 组合。使用6-BA 时, 0.5 mg/L和1 mg/L 2 种质量浓度差异不大, 它们均会在2 周后出现生长和萌芽态势, 增殖率为4～5 倍，其丛生芽生长缓慢，叶小且发红。而对于6-BA+ZT 组合来讲, 10 d 后出现少量愈伤, 增殖率为6～8 倍，丛生芽生长速度慢。因此，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本等方面进行综合考虑，继代培养基以改良WPM+1 mg/L ZT为最佳。
2.2 叶片再生体系的建立
2.2.1叶片不同部位对重生苗诱导的影响
离叶尖1/3、1/2、2/3和全叶，按垂直叶片主脉方向将叶片切成二部分，叶片背面朝下接种于培养瓶内，30天后统计叶片重生率，结果见表1。从表1中可以看出，离叶尖1/3处切法的诱导重生苗率最高，达到50%以上，而全叶的诱导重生苗率最低，仅26.1%。在几种叶片切法中，叶尖端的重生苗诱导率比叶柄端高。
表1 叶片不同部位对重生苗诱导的影响
2.2.2不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响
在建立植物再生体系的研究中，暗培养是某些植物外植体重生苗的重要影响因素。不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响见表2。从表2可以看出，随着暗培养时间的延长，重生苗诱导频率呈增高趋势，不经暗培养直接在光照条件下的叶片重生率仅为29.3﹪，暗培养20d后的叶片重生率高达93.2﹪。当暗培养时间超过30d后，虽然叶片重生率超过90%，由于叶片重生苗在暗培养时形成白化畸形苗，其有效苗数反而减少。由此可见20d的暗培养时间最为适宜。
表2 不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响
2.2.3 ZT浓度对诱导叶片重生苗的影响
ZT是一种高活力的细胞分裂素，具有打破植株顶端优势、促进腋芽萌发、诱导不定芽形成的作用。将离叶尖1/3处按垂直叶片主脉方向将叶片切成叶尖端和叶柄端二部分，研究不同浓度的ZT对叶片重生苗的诱导作用，结果见表3。从表3可以看出，0.5-2.0mg/L ZT均能诱导叶片不经愈伤组织直接出芽，植株的变异性减少。不同浓度的ZT对叶片重生苗诱导的效果存在明显差异。0.5mg/L ZT对叶片重生苗的诱导率低，尚不足50%，叶片的叶尖端主要诱导簇生苗，叶柄端主要诱导单生苗；随着ZT浓度的升高，叶片重生苗的诱导率增加，在1.7mg/L ZT时达到最高，叶片的叶尖端与叶柄端的重生苗诱导率分别达到93.8%和79.5%，且主要为簇生苗，在2.0mg/L ZT时均有所下降。因此，诱导叶片形成重生苗的最佳ZT 质量浓度为1.7mg/L。
表3 不同质量浓度ZT对诱导叶片重生苗的影响
2.3 试管苗的瓶内生根
2.3.1 盐浓度对生根的影响
单个芽苗在不同盐浓度的生根培养基中的生根诱导率存在差异。从表4可以看出，高盐浓度不利于芽苗生根，大量元素不减少时仅在茎切段形成愈伤组织；大量元素减半时，在20d左右开始生根，生根率达40%；大量元素减少到原来的1/4时，开始生根的时间为10d左右，生根率提高到90%以上，苗长势强，叶色绿；而大量元素减少到原来的1/8时， 第8d左右就开始生根，生根率也达到了90%以上，由于营养物质的缺乏，苗长势弱，叶色黄且无光泽。因此适当降低盐浓度有利于生根且不影响苗的生长。
表4不同盐浓度对生根的影响
2.3.2 活性碳和生长素对生根的影响
活性碳对组培苗瓶内生根具有重要影响。由表5可看出，当培养基中无活性碳时，插入培养基中的茎基部均先长愈伤组织然后生根，由于茎根之间维管束不通，不久茎即停止生长，叶色发红脱落，苗长势差。活性炭对杰兔生根具有促进作用，但是存在不同的浓度效应：效果最好的是0.1%活性碳，在0.1-0.8mg/L IBA的有效生根率均达到80%以上，特别是在0.1mg/L IBA时生根率达到了90%以上，茎基部产生愈伤组织较少或不产生愈伤组织，茎生长正常，10d左右可见茎基部有根形成，45d左右长出4-6条根，根长达6cm左右；效果其次的是0.15%活性碳，在0.1mg/L IBA时其有效生根率也达到了80%以上；当培养基中的活性碳为0.2%时，有效生根率明显降低，有效根数和根长也减少。
另外，IBA浓度对杰兔生根具有明显作用，表5的结果表明，低浓度的IBA更有利于杰兔生根，在活性碳浓度为0.05-0.2%的培养基中，0.1mg/L IBA的有效生根率均达到70%以上，随着IBA浓度的升高，有效生根率降低。
综合以上结果，杰兔瓶内生根培养基中最佳的活性炭浓度和IBA浓度分别为0.1%和0.1mg/L，有效生根率高达95%。
表5 活性碳及IBA浓度对组培苗瓶内生根的影响
2.4 炼苗基质的优化
剪取2cm左右长的无菌苗新梢在生根培养基中生长，约45d左右苗高长至5-6cm时，生根率达95%。对生根苗移栽在5种不同基质上，1.5个月后统计成活率。图2是本发明实施例适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁技术的不同炼苗基质对试管苗成活率的影响的柱形图，从图2可看出，水苔藓的效果最好，成活率高达100%，苗木的生长量达3cm以上，新增叶片6-8枚。效果其次的是2～3∶1 的草炭与石英砂组合,其成活率为86%, 苗木的生长量较高。1∶1 的草炭与河沙基质的成活率仅为52%,但成活苗的质量却很高，表现为生长墩实、植株健壮、生长量与“草炭+石英砂”相当。草炭+园土基质与草炭+珍珠岩基质的效果居中。
3、讨论
已有研究表明, 蓝莓快繁的培养基以改良WPM的效果最好，且在芽的诱导和增殖中细胞分裂素的作用至关重要。玉米素是一种高活力的细胞分裂素，因此, 我们主要采用了改良WPM培养基,重点探讨了玉米素的效应。
本研究表明，利用1mg/L ZT进行增殖培养，增殖倍数达到6倍以上，且丛生芽生长健壮，生长速度快；2mg/L ZT的增殖倍数稍高于1mg/LZT；5mg/L ZT的增殖倍数高达12倍，然而玻璃化现象的出现使有效苗数减少。由于ZT价格贵，结合生产成本考虑，1mg/L ZT的增殖效率最佳，通过几次继代，其增殖倍数可达30-40倍。在叶片再生方面，本研究用无菌苗叶片为材料，按垂直叶片主脉方向离叶尖1/3处将叶片切成二部分，同时接种于改良WPM+1.7 mg/L ZT的培养基中，先暗培养20d后光照培养，叶片的叶尖端和叶柄端均能不经愈伤组织形成再生苗，保持了再生苗的优良特性。将叶尖端和叶柄端的再生率合起来，叶片再生率高达173.3%。组培苗叶片的数量多和高的叶片再生率，再结合茎的增殖培养，其增殖倍数非常可观，远远高于前人在兔眼蓝莓增殖研究中的结果。生根培养方面，本研究采用1/4WPM（改良）+0.1%活性碳+0.1mg/LIBA配方，能使新梢在10d左右开始生根，生根率高达95%，苗健壮且生长速度快，大约45d就可出瓶炼苗。在炼苗方面，国内报道的多种配方均以考虑如何为蓝莓生长提供适宜的pH值，他们以草炭土或其类似物为基本介质，再附加支撑材料调节基质的通透性。蓝莓组培苗小而弱，根纤细，移栽较其它植物组培苗困难。移栽成活的关键是小环境保湿和基质通气性好，以保证小植株不失水和根的再生长。本研究采用塑料小拱棚保湿和水苔藓为炼苗基质，由于水苔藓的通透性非常好，其pH为5.0左右且富含有机质，幼苗成活率高达100%，幼苗生长快且健壮，炼苗效果明显优于国内已报道的以草炭土为基本介质的炼苗基质。因此，本研究从叶片再生、增殖培养、生根培养到炼苗这几个环节进行了一系列的优化，建立了一套可高效、快速、持续获得优良的兔眼组培种苗的技术体系，有助与我国蓝莓产业化发展。
为获得兔眼蓝莓高效快繁的技术体系，以杰兔幼嫩茎段为试验材料，对增殖培养基、叶片再生体系、生根培养基、炼苗基质进行了优化。结果表明， WPM（改良）+1.0 mg/L ZT的增殖培养基能使新梢增殖率提高6倍以上，且丛生苗生长健壮和生长速度快；按垂直叶片主脉方向将无菌苗叶片离叶尖1/3处切成二部分，叶片背面朝下接种于WPM（改良）+1.7 mg/L ZT的培养基中，先暗培养20d后光照培养，叶尖端和叶柄端的再生率分别达93.8%和79.5%以上；1/4 WPM（改良）+0.1%活性碳+0.1mg/LIBA的生根培养基能使试管苗生根率达95%；以水苔藓为炼苗基质可使幼苗的成活率高达100%。因此，本方法从叶片再生、增殖培养、生根培养到炼苗这一系列环节进行了优化，建立了一种可高效、快速、持续获得优良的兔眼组培种苗的技术。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (1)
1.一种适宜脱毒兔眼蓝莓的高效快繁方法，其特征在于，采用外植体材料为当年生幼嫩枝，通过以下步骤获得优质脱毒苗：
a、嫩枝摘除叶片，清洗嫩枝，嫩枝切段形成单芽茎段，然后放置在培养基中培养，完成无菌苗的获得步骤；
b、待单芽茎段叶芽伸长后，切下叶芽转接在改良培养基中，完成丛生芽的诱导与增殖步骤，将获得的无菌苗转接到不同的增殖培养基上进行比较，丛生芽生长速度慢，从增殖率、丛生芽长势、玉米素成本方面进行综合考虑，得到最佳的改良培养基，以完成丛生芽的诱导与增殖的改良；
c、取无菌苗植株上碧绿的叶片，按照不同的叶片切法、不同的培养方式、不同浓度的ZT筛选最合适的叶片，培养在改良培养基中，完成叶片再生体系的建立步骤，进行叶片不同部位对重生苗诱导的影响测试，按垂直叶片主脉方向将叶片切成二部分，叶片背面朝下接种于培养瓶内，统计重生率，进行不同暗培养时间对叶片重生苗诱导的影响测试，进行ZT浓度对诱导叶片重生苗的影响测试，测试不同浓度的ZT对叶片重生苗的诱导作用，以完成叶片再生体系的建立的改良；
d、剪取苗的单芽茎段，在改良培养基中培养，从不同盐浓度、不同活性炭浓度、不同IBA浓度的培养基中筛选出最适宜生根培养基，完成试管苗生根培养步骤，进行盐浓度对生根的影响测试，进行单个芽苗在不同盐浓度的生根培养基中的生根诱导率存在差异比对，进行活性碳和生长素对生根的影响测试，以完成试管苗的瓶内生根改良；
e、在炼苗基质中培养，炼苗时打开培养瓶的瓶盖进行培养环境的过渡，在湿度100％的室内环境下培养，然后过渡到湿度80％、透光度70％的室外条件下，然后在逐步通风换气环境下培养，统计成活率，完成炼苗步骤，对生根苗移栽在5种不同基质上，统计成活率，以完成炼苗基质的优化；
无菌苗的获得是以田间生长的当年生嫩枝为初始外植体，摘除叶片，用洗衣粉水溶液洗净灰尘污物后，经自来水冲洗，转到超净工作台上，先后用75％酒精和0.1％升汞对外植体分别进行50s与10min的表面灭菌，接着用无菌水冲洗4次，每次约2min，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分，将枝条切成1-2cm长的单芽茎段，WPM培养基具体改良方法：以Ca(NO3)2·4H2O、KNO3代替原WPM培养基中的K2SO4、CaCl2，在无菌条件下将单芽茎段接种于改良WPM、1.0mg/L ZT、20g/L蔗糖、9g/L日产琼脂粉、pH＝5.2的培养基上诱导侧芽萌发，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过16h光照和8h黑暗的光周期，30d后茎段叶芽伸长4-6cm，叶片数量达7-9枚；
丛生芽的诱导与增殖是待茎段叶芽伸长后，切下转接于以改良WPM为基本培养基，加蔗糖20g/L，日产琼脂粉8.8g/L，附加不同浓度的ZT和/或6-BA，pH＝5.2的增殖培养基中，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过16h光照和8h黑暗的光周期；
叶片再生体系的建立是以改良WPM、1.0mg/LZT、20g/L蔗糖、9g/L琼脂粉、pH＝5.2为培养基，取无菌苗植株上碧绿的叶片，按不同的叶片切法、不同培养方式、不同浓度的ZT，筛选最合适的叶片再生体系，背面朝下，叶尖与叶柄分开放置，接种于培养瓶内，每瓶10片，每个处理组重复8-10瓶，叶片切法包括4种不同的叶片切法，分别为垂直叶片主脉切取叶片的1/2、1/3、2/3以及全叶；培养方式为：暗培养时间分别为0d、7d、20d和30d，每个处理重复15-20次，暗培养温度为25±2℃，ZT的终浓度分别为0.5、0.8、1.1、1.4、1.7或2.0mg/L，30d后观察记录叶片的出芽率与生长状况，计算诱导重生苗率＝诱导重生苗形成的叶片数/接种叶片数，从而获得最佳的叶片再生体系，培养条件为温度25±2℃、光强2500Lx、经过16h光照和8h黑暗的光周期；
试管苗生根培养为剪取苗高约2.0cm的单芽茎段，改良WPM为基本培养基，另添加蔗糖20g/L、琼脂9g/L、pH＝5.3，从不同盐浓度WPS、1/2WPS、1/4WPS、1/8WPS、不同活性碳浓度0％、0.05％、0.10％、0.15％、0.20％、不同IBA浓度0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L的培养基中筛选出最适宜的生根培养基，培养条件为：温度25±2℃、光强2500Lx、光周期16h光照/8h黑暗，炼苗时，提前3d打开瓶盖进行过渡，移栽后在组培室条件下保持湿度100％的塑料棚中培养20d，然后在湿度80％、透光度70％的室外条件下过渡7d再逐步通风换气，15d后，完全揭去棚膜，2周后统计成活率，炼苗时，每套基质的栽植量不少于50株，各试验的重复次数不少于3次；
炼苗基质选择草炭∶河沙＝1∶1；或者草炭∶田土＝1∶1；或者草炭∶石英砂＝2～3∶1；或者草炭∶珍珠岩＝1～2∶1；或者全部采用水苔藓。
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