CN102972301A - 一种红桦组织培养育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红桦组织培养快速育苗方法，由无菌培养物的建立、芽苗的诱导、丛生芽的增殖、芽苗生根培养以及组培苗的移栽5个技术环节构成。利用本方法进行红桦组织培养快速育苗具有芽诱导率高、增殖系数大、生根率高和移栽成活率高的优点，一般芽诱导率可以达到75％以上，月增殖系数到达4，生根率80％以上，移栽成活率大于85％，可以为林业生产中红桦的大规模栽培提供一种繁殖速度快、生产周期短、遗传稳定性好的育苗方法，扩大红桦种源生产，解决生产中对红桦种苗的需求。

Description

一种红桦组织培养育苗方法

技术领域

本发明属于农林领域，更具体地涉及一种红桦组织培养快速育苗方法。

背景技术

红桦(Betula albo-sinensis Burk)是桦木科桦木属的落叶大乔木，中国特有种。红桦广泛分布于我国西南、西北和华北的天然林区，是该地区主要的森林建群树种之一，也是一种优异的生态和经济树种。红桦根系发达，林冠下植被繁茂，枯枝落叶多，土壤疏松，截持地表径流能力强，对于中山、亚高山地带水源涵养、水土保持具有重要作用。红桦木材淡红褐色，质地坚硬，纹理致密，色泽均匀，有弹性，可供枪托、飞机、枕木、火柴杆、家具、乐器、细木工及军工用材和特制用材，也是胶合板工业的重要材料。

在高海拔天然林区，由于天然分布的树种单一，适应人工栽植的针、阔叶树种较少，在造林时树种选择较为困难。而红桦不仅具有自然分布海拔较高、生长稳定、抗病虫害和适应性强等特性，而且天然更新能力强、生长快、材质好、遭受破坏后容易自然萌芽恢复及人工栽植成活率较高。基于此，作为我国西南、西北和华北天然林区高海拔区优良的乡土阔叶造林树种，红桦在造林实践中表现出非常突出的优势，可与其它针叶树种进行混交造林，形成生长稳定的针阔混交林，起到优化林分结构、提升林分质量、防止和减轻森林病虫害的作用，对提高森林生态安全、丰富森林景观、促进林业增效等具有重要的意义。

为此，加快红桦种苗生产，是依靠红桦进行各项造林工作的基础工作。目前，红桦苗木的培育主要还是传统的种子播种育苗手段，这种方法存在着育苗时间长(育苗周期长达2年，第3年才能出圃造林)、出苗率低等不足，而且这种方法培育的实生苗因为材料基因的多样性，造林后生长表型不一，很难达到群体高产的目的，也很难保持母本的优良特性而出现种性的衰退。

因而，如何在保持品种优良特性的基础上提高种苗繁殖系数，进而提供优质的红桦种苗，成为当前红桦造林工程的紧迫问题和关键问题。

植物组织培养快速繁殖是当代农业生物技术在生产上应用最广泛、产生经济效益最大的一个领域。组织培养快速繁殖种苗具有其独特的优越性，首先繁殖系数大，能以比常规方法快数千到数百万倍的速度进行扩大繁殖，及时提供大量优质种苗，使一个新的品种能够在短时间内满足生产的需要，加速引种和良种的推广进程；使用的繁殖材料小和少；繁殖苗木整齐一致，商品性高，能够保持原品种的优良特性；可进行周年工厂化育苗，生产效率高。对一些繁殖系数低、不能用种子繁殖(无种子或种子繁殖后代出现种性的衰退)的植物品种的繁殖，利用组织培养快速繁殖更为重要。

目前，虽然已有桦木属光皮桦、盐桦、西南桦、垂枝桦和白桦几个树种的组织培养育苗技术专利和报道发表，但还尚无红桦组织培养快速育苗的报道。目前，红桦组织培养育苗存在着以下一些问题：直接从野外红桦母树上取材，很难保证母树的遗传品质；野外红桦树龄往往较大，造成外植体再生能力低下；野外(高海拔林区)取材后难以及时返回实验室，外植体活力大大降低；红桦枝叶绒毛多，污染率高，难以建立无菌培养物。因此，寻求并探索红桦组织培养快速繁殖育苗技术，是扩大红桦种源生产，解决生产中种苗需求的迫切任务。

发明内容

本发明的目地是提供一种红桦组织培养快速育苗方法，利用本质为无性繁殖的植物组织培养繁殖技术，提高红桦的繁殖系数，扩繁出能保持母本原品种优良特性的无性系苗木，从而为保证造林材料的均一性，提高林木生产力打下扎实的物质基础。

为了实现本发明目的，本发明的一种红桦组织培养快速育苗方法由无菌培养物的建立、芽苗的诱导、丛生芽的增殖、芽苗生根培养以及组培苗的移栽5个技术环节构成，并按以下操作步骤分别实施。

1、无菌培养物的建立

选取当年生新发嫩梢，剪去叶片和叶柄，切割成1.0～1.5cm长带有顶芽和腋芽的节段，将带芽节段置于自来水下冲洗2～3h，然后用洗衣粉液浸泡10～30min，用软刷刷洗节段后再置流水下冲洗30min。在超净工作台上，用70％乙醇浸泡15～30s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的氯化汞处理6～8min，用无菌水冲洗4～6次，最后用滤纸吸干带芽节段获得无菌培养物(外植体)。

2、芽苗的诱导

将上述步骤获得的无菌带芽节段接种到芽苗诱导培养基上促进腋芽的萌发和生长。诱导培养基为MS、1/2MS、1/4MS基本培养基，附加0.5～1.5mg/L的BA，0.1～0.5mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

3、芽苗的增殖

待培养物出现点状芽后，把上述步骤获得的培养物转移到芽苗增殖培养基进行芽苗的继代扩繁增殖。增殖培养基为1/2MS基本培养基，附加0.5～2.0mg/L的BA，0.2～0.8mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。在该阶段反复继代增殖，在获得足够的芽苗后进入下一步。

4、芽苗生根培养

选取步骤3中增殖的2.5cm左右长的芽苗转移到生根培养基中生根以获得完整的植株。生根培养基为MS、1/2MS、1/4MS基本培养基，附加0.6～1.0mg/L的IBA，0.1～0.3mg/L的NAA，以及20g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

以上诱导、增殖和生根培养，培养温度为22±2℃，湿度75％左右，光照强度3000lx，光照时间16h/d。

5、炼苗与移栽

移栽前，把步骤4获得的生根芽苗在培养架上炼苗1～2周，逐渐降低培养容器湿度，并适当增加光照，以促进茎叶保护组织的发生和气孔功能的恢复。炼苗后取出生根组培苗，洗净根上滞留的琼脂培养基，用杀菌剂护根处理后移入营养土中培养，控制环境湿度80～90％，稍后逐渐降低环境湿度。待有新芽发出后按常规苗圃育苗措施管理。

上述步骤2所述芽苗诱导培养基优选为1/2MS基本培养基，附加1.5mg/L的BA，0.3mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

上述步骤3所述芽苗增殖培养基优选为1/2MS基本培养基，附加2.0mg/L的BA，0.4mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

上述步骤4所述芽苗生根培养基优选为1/4MS基本培养基，附加0.8mg/L的IBA，0.1mg/L的NAA，以及20g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

本发明的红桦组织培养快速育苗方法，成功的将当代生物技术的重要组成部分一组织培养快繁技术应用于红桦的种苗繁育，采用以芽繁芽的增殖途径，兼顾了扩大种苗数量和保持遗传性状的目的。利用本方法进行红桦组织培养快速育苗具有芽诱导率高、增殖系数大、生根率高和移栽成活率高的优点，一般芽诱导率可以达到75％以上，月增殖系数到达4，生根率80％以上，移栽成活率大于85％，可以为林业生产中红桦的大规模栽培提供一种繁殖速度快、生产周期短、遗传稳定性好的育苗方法，扩大红桦种源生产，解决生产中对红桦种苗的需求。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。

但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。

1、取材

选择红桦优树家系优良单株作为取材母株，于5～6月晴天的中午，在母树上的上、中、下三个部位分别取生长健壮、无病虫害的当年生新发枝条作为外植体。

2、无菌培养物的建立

将采集的枝条，剪去叶片和叶柄后，切割成2.0cm长带有腋芽的节段，将带芽节段置于自来水下冲洗3h，然后用洗衣粉液浸泡20min，用软刷刷洗节段后再流水冲洗30min。在超净工作台上，用70％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗3次，然后用0.1％的氯化汞(加1～2滴吐温80)处理8min，用无菌水冲洗6次，最后用滤纸吸干带芽节段获得无菌培养物。

3、芽苗的诱导

在无菌接种室，先将上述步骤获得的无菌带芽节段的两端与消毒液接触的切口削去部分，保留节段长度1.5cm，以减轻消毒液的毒害，加快节段腋芽的启动生长。然后把制备后的带芽节段接种到芽苗诱导培养基上。诱导培养基为MS、1/2MS、1/4MS基本培养基的任意一种，附加0.5～1.5mg/L的BA，0.1～0.5mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

4、芽苗的增殖

待培养物出现点状芽后，把上述步骤获得的培养物转移到芽苗增殖培养基进行芽苗的继代扩繁增殖以获得丛生芽。增殖培养基为1/2MS基本培养基，附加0.5～2.0mg/L的BA，0.2～0.8mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。经增殖培养获得丛生芽后，按3～4苗分离丛生芽，转移到在增殖培养反复继代增殖，以获得更多的芽苗，在这一阶段实现芽苗数量的快速增加。

5、芽苗生根培养

在增殖的芽苗中选取3cm长的芽苗转移到生根培养基生根中。生根培养基为MS、1/2MS、1/4MS基本培养基，附加0.6～1.0mg/L的IBA，0.1～0.3mg/L的NAA，以及20g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

以上诱导、增殖和生根培养，培养温度为22±2℃，湿度75％左右，光照强度3000lx，光照时间16h/d。

6、炼苗与移栽

移栽前，生根芽苗先在培养室培养架上炼苗1～2周，逐渐降低培养容器湿度，逐渐增加光照强度，以促进茎叶保护组织的发生和气孔功能的恢复。炼苗后取出生根组培苗，洗净根上滞留的琼脂培养基，马上用500倍多菌灵杀菌液浸根5min，护根处理后移入用甲醛消毒过的由蛭石+珍珠岩+园土(1∶1∶8)配制成的营养土中培养，控制环境湿度80～90％，稍后逐渐降低环境湿度，成活率可以达到85％以上。根据苗木生长状况，可以叶面喷施尿素和磷酸二氢钾的水溶液，待有新芽发出后按常规苗圃育苗措施管理。

对比实施例1：取材部位对外植体培养效果的影响

本实验是在母树不同部位采集枝条制备外植体，然后接种在相同的培养基上进行培养，考察污染率、褐变率以及存活率等指标。实验结果见下述表1。

表1不同部位外植体对培养效果的影响

取材部位	污染率(％)	褐变率(％)	死亡率(％)	存活率(％)
					上部	17.5	0	5.8	94.2
中部	14.3	0	5.5	94.5
					下部	22.2	0	6.1	93.9

从表1可知，母株上、中、下三个部位的外植体接种后成活率都可达到90％，但差异不明显。三个部位的外植体均没有发生褐变，但下部位枝条污染率要高些，可能主要与比较靠近地面，更容易受到的尘埃和病原微生物的侵染。综合考虑，以从母树中部采集的枝条制备外植体培养效果为好。

对比实施例2：基本培养基对芽苗启动培养效果的影响

本实验是在其他培养条件一致的基础上，考察红桦带芽节段在不同基本培养基上的启动培养效果。实验结果见下述表2。

表2基本培养基对芽苗启动培养效果的影响

基本培养基	启动率(％)	0.05水平
			MS	77.3	a
1/2MS	75.8	a
			1/4MS	68.0	b

注：0.05水平表示5％水平差异显著性检验，字母不同者表示差异显著。下同。

从表2得出，MS培养基和1/2MS培养基对红桦芽苗的启动培养效果一致，差异不显著，且启动率均显著高于1/4MS培养基的启动率。综上分析，MS培养基和1/2MS培养基均可以作为启动、增殖阶段的基本培养基，考虑到1/2MS培养基药品使用量只有MS培养基的一半，因此可优选1/2MS培养基作为红桦带芽节段芽启动和增殖培养阶段的基本培养基。

对比实施例3：细胞分裂素对芽苗增殖培养效果的影响

本实验是在其他培养条件一致的基础上，考察细胞分裂素BA不同浓度对红桦芽苗增殖培养的效果。实验结果见下述表3。

表3BA对芽苗增殖培养效果的影响

从表3可知，在红桦芽苗增殖阶段，随着细胞分裂素BA浓度的增加芽苗增殖系数呈现递增的趋势，在BA浓度为2.0mg/L时增殖系数达到最大值4.7，显著高于BA浓度在0.5～1.5mg/L时的增殖系数。因此，红桦芽苗增殖阶段细胞分裂素BA浓度优选为2.0mg/L。

对比实施例4：生长素对芽苗增殖培养效果的影响

本实验是在其他培养条件一致的基础上，考察生长素IBA不同浓度对红桦芽苗增殖培养的效果。实验结果见下述表4。

表4IBA对芽苗增殖培养效果的影响

从表4可知，在红桦芽苗增殖阶段，生长素IBA浓度在0.4mg/L和0.8mg/L时芽苗增殖系数达到4，二者之间无显著差异，但均显著高于IBA浓度在0.2mg/L和0.6mg/L时的增殖系数。因此，红桦芽苗增殖阶段生长素IBA浓度可确定为0.4mg/L或0.8mg/L，从降低成本角度考虑，IBA浓度优选为0.4mg/L。

综合对比实施例3和例4，可以确定芽苗增殖培养基优选为1/2MS基本培养基，附加2.0mg/L的BA，0.4mg/L的IBA。

对比实施例5：基本培养基芽苗生根培养效果的影响

本实验是在其他培养条件一致的基础上，考察增殖阶段获得的芽苗在不同基本培养基上的生根培养效果。实验结果见下述表5。

表5基本培养基对芽苗生根培养效果的影响

基本培养基	生根率(％)	0.05水平
			MS	67.7	b
1/2MS	68.2	b
			1/4MS	83.5	a

从表5可知，随着MS培养基浓度的降低，芽苗生根率呈增加的趋势，在1/4MS培养基上获得了最大生根率83.5％，且显著高于在MS培养基和1/2MS培养基上时的生根率。因此可确定1/4MS培养基为红桦增殖芽苗生根培养的基本培养基。

对比实施例6：生长素对芽苗生根培养效果的影响

本实验是在其他培养条件一致的基础上，考察生长素IBA和NAA不同浓度对红桦芽苗生根培养的效果。实验结果见下述表6和表7。

表6IBA对芽苗生根培养效果的影响

表7NAA对芽苗生根培养效果的影响

从表6和表7可知，不同浓度的生长素IBA和NAA对红桦芽苗生根率的影响均存在显著差异，IBA在0.8mg/L时有着最好的生根率，而NAA在0.1mg/L时有着最好的生根率。综合基本培养基的筛选，红桦组织培养快速繁殖生根阶段培养基配方优选为1/4MS基本培养基，附加0.8mg/L的IBA和0.1mg/L的NAA。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，本发明的技术方案在其它地点和其它时间都得到了基本相同的结果，因此本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (5)

1.一种红桦组织培养育苗方法，其包括如下步骤：

(1)无菌培养物的建立

选取当年生新发红桦嫩梢，剪去叶片和叶柄，切割成1.0～1.5cm长带有顶芽和腋芽的节段，将带芽节段置于自来水下冲洗2～3h，然后用洗衣粉液浸泡10～30min，用软刷刷洗节段后再置流水下冲洗30min；在超净工作台上，用60-80％乙醇浸泡15～30s，无菌水冲洗2～4次，然后用0.05～0.15％的氯化汞处理6～8min，用无菌水冲洗4～6次，用滤纸吸干带芽节段获得无菌培养物；

(2)芽苗的诱导

将上述步骤获得的无菌带芽节段接种到芽苗诱导培养基上促进腋芽的萌发和生长，诱导培养基为MS、1/2MS、1/4MS基本培养基中的任意一种或者两种的组合，加入0.5～1.5mg/L的BA，0.1～0.5mg/L的IBA，以及20～40g/L的蔗糖和5～8g/L的琼脂，用HCl和/或NaOH调节培养基pH为5.8～6.0；

(3)芽苗的增殖

待培养物出现点状芽后，把上述步骤获得的培养物转移到芽苗增殖培养基进行芽苗的继代扩繁增殖，增殖培养基为1/2MS基本培养基，加入0.5～2.0mg/L的BA，0.2～0.8mg/L的IBA，以及20～40g/L的蔗糖和5～8g/L的琼脂，用HCl和/或NaOH调节培养基pH为5.8～6.0；重复上述继代增殖步骤以获得足够的芽苗；

(4)芽苗生根培养

选取步骤(3)中增殖的2～3cm左右长的芽苗转移到生根培养基中生根以获得完整的植株，生根培养基为MS、1/2MS、1/4MS基本培养基，附加0.6～1.0mg/L的IBA，0.1～0.3mg/L的NAA，以及10～30g/L的蔗糖和5～8g/L的琼脂，用HCl和/或NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

(5)炼苗与移栽

移栽前，把步骤(4)获得的生根芽苗在培养架上炼苗1～2周，逐渐降低培养容器湿度，并适当增加光照，以促进茎叶保护组织的发生和气孔功能的恢复；炼苗后取出生根组培苗，洗净根上滞留的琼脂培养基，用杀菌剂护根处理后移入营养土中培养，控制环境湿度80～90％，稍后逐渐降低环境湿度，待有新芽发出后按常规苗圃育苗措施管理。

2.根据权利要求1所述的育苗方法，步骤(2)所述芽苗诱导培养基为1/2MS基本培养基，附加1.5mg/L的BA，0.3mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

3.根据权利要求1所述的育苗方法，步骤(3)所述芽苗增殖培养基优选为1/2MS基本培养基，附加2.0mg/L的BA，0.4mg/L的IBA，以及30g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

4.根据权利要求1所述的育苗方法，步骤(4)所述芽苗生根培养基优选为1/4MS基本培养基，附加0.8mg/L的IBA，0.1mg/L的NAA，以及20g/L的蔗糖和6.5g/L的琼脂，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养基pH为5.8～6.0。

5.根据权利要求1所述的育苗方法，其特征在于诱导、增殖和/或生根培养的条件为：培养温度为22±2℃，湿度70～80％，光照强度2000～4000lx，光照时间14～18h/d。