CN105794649B - 欧洲越橘组织快繁培养基及其培育方法 - Google Patents

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Abstract

欧洲越橘组织快繁培养基及其培育方法,它涉及植物组织培养领域,具体涉及欧洲越橘组织快繁培养基及其培育方法。本发明是要解决现有培养基对欧洲越橘组织离体快繁效果差的问题。欧洲越橘组织快繁培养基包括腋芽诱导培养基和分化增殖培养基两种培养基,所述的腋芽诱导培养基为含有玉米素的Dy培养基;所述的分化增殖培养基为含有6‑苄基胺基嘌呤和玉米素的Dy培养基。方法:一、取材,消毒;二、腋芽培养,分化增殖。本发明用于欧洲越橘组织的快速繁殖培育。

Description

欧洲越橘组织快繁培养基及其培育方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养领域,具体涉及欧洲越橘组织快繁培养基及其培育方法。
背景技术
欧洲越橘(Vaccinium myrtillus L.)是生长于中欧地区多年生浆果,主要分布于瑞典、芬兰、乌克兰、俄罗斯北部、拉脱维亚等中北欧高寒地区,我国新疆阿拉泰山区也有分布。其抗寒能力极强,能耐-50℃的极端低温。由于独特的地理环境及气候因素,欧洲越橘果实中的花青素成分种类及含量均高出其他越橘品种。欧洲越橘提取物、欧洲越橘鲜果、果酱和果汁在市场上极受欢迎,鲜果在欧洲市场达5欧元/kg,果酱、果汁在波兰市场售价比其他高出50%。欧洲越橘的果实与叶片中含有儿茶酚蹂质、黄酮、花青素等物质,具有抗氧化、抗炎及诱导癌细胞凋亡等作用,主要用于糖尿病、消化系统、循环系统、眼部疾病和抗肿瘤的治疗。欧洲越橘提取物(bilberry extract)具有较强的抗氧化活性,可以抑制自由基损伤组织机能,提高还原型谷胱甘肽的水平,作为保健食品已被消费者广泛接受,并被美国FDA列为无需认证的食品添加剂,多年来国际市场销售价格一直稳定在500~600美元/kg的水平。
欧洲越橘主要分布在中北欧高寒地区,我国分布极少。黑龙江省林业科学研究所从新疆阿拉泰保护区引种部分欧洲越橘品种开展研究。然而材料稀缺宝贵,只有通过植物组织培养技术才能在短期内繁殖大量苗木,又可保护现有品种的优良遗传特性。然而并未见欧洲越橘组织培养方面的报道,其他越橘品种的培养基并不能满足欧洲越橘试管苗的生长,因此必须开展欧洲越橘的组织快繁培养基的研究。
发明内容
本发明是要解决现有培养基对欧洲越橘组织离体快繁效果差的问题,而提供欧洲越橘组织快繁培养基及其培育方法。
本发明欧洲越橘组织快繁培养基包括腋芽诱导培养基和分化增殖培养基两种培养基;其中,所述的腋芽诱导培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
其中,所述的Dy培养基是由大量元素、钙盐、微量元素、铁的络合盐、有机物质、强度为1400g/cm2的琼脂和蒸馏水组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由180mg/L~200mg/L的KNO3、400mg/L~410mg/L的NH4NO3、365mg/L~380mg/L的MgSO4·7H2O和160mg/L~180mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为680mg/L~690mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73mg/L~74mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.0mg/L~38.0mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.05mg/L~0.15mg/L的盐酸硫胺素、0.45mg/L~0.55mg/L的烟酸、0.5mg/L~0.6mg/L的盐酸吡哆醇、90mg/L~110mg/L的肌醇和1.5mg/L~2.5mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.0g/L~7.0g/L,pH为5.6。
欧洲越橘组织培育方法具体是按以下步骤进行:
一、取材时应在晴好天气的中午或下午,从健壮无病的植株上选取欧洲越橘植物组织单节茎段,经流水冲洗15min后,在超净工作台消毒,方法为:采用0.1%HgCl2浸泡消毒2.0min,然后用无菌水冲洗3次,并浸泡在无菌水60min,得到灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段;
二、将灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段接种到腋芽诱导培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lux,培养时间25d~30d;然后将培养25d~30d的腋芽转到分化增殖培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度3000Lux,相对湿度60%~70%,培养时间60d;
经步骤一和步骤二处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为85%~93%;试管苗平均分化增殖倍数为12.8~19.6倍;
所述的腋芽诱导培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
其中,所述的Dy培养基是由大量元素、钙盐、微量元素、铁的络合盐、有机物质、强度为1400g/cm2的琼脂和蒸馏水组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由180mg/L~200mg/L的KNO3、400mg/L~410mg/L的NH4NO3、365mg/L~380mg/L的MgSO4·7H2O和160mg/L~180mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为680mg/L~690mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73mg/L~74mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.0mg/L~38.0mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.05mg/L~0.15mg/L的盐酸硫胺素、0.45mg/L~0.55mg/L的烟酸、0.5mg/L~0.6mg/L的盐酸吡哆醇、90mg/L~110mg/L的肌醇和1.5mg/L~2.5mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.0g/L~7.0g/L,pH为5.6。
氮是构成植物体蛋白质、核酸、ATP、NADPH或NADPH+、叶绿素等物质的主要元素,能促进植物的细胞分裂,是植物生长必需的营养元素之一。铵态氮和硝态氮都是植物良好的氮源,都能被植物很好地吸收利用,但二者的存在状态、吸收、运输、同化过程等不尽相同。NO3-N是阴离子,呈氧化态;NH4-N是阳离子,呈还原态,二者含氧不同,所带的电荷性质也不同,因此在不同的环境条件(特别是介质pH)下,同种植物对NO3-N和NH4-N的吸收量不同。当改变培养基本身的某些组分,按比例适当增加培养基中的的NO3-N,在pH值较小的情况下转化为NH4 +-N,对于欧洲越橘这种比较喜欢吸收NH4 +-N的植物来说,此类N素较易吸收。同时由于元素间的相互促进与拮抗作用,N素又可促进P、Fe、Mg元素的吸收,降低Ca元素的吸收,叶片通过光合作用将吸收的无机物转化成有机物,由源向库运输,从而促进欧洲越橘茎节伸长,腋芽分化,新叶片生长。本发明Dy培养基氮浓度为398.76mg/L,常用的WPM培养基氮浓度为325.35mg/L,本发明Dy培养基硝态氮占总氮源质量的73.99%,而WPM培养基硝态氮占总氮源质量的68.13%,在pH值为5.5~5.8的条件下,对欧洲越橘进行分化增殖培养,增殖倍数分别为19.6倍和6.4倍,证明对于欧洲越橘外植体,培养基的pH值在5.5~5.8的条件下,硝态氮占总氮源百分比越高,越有利于苗木的分化增殖。总之,两种培养基相比,Dy培养基中的氮源总浓度做到了合理的调整,硝态氮比例的增大,提高了肥效,培养出的苗木生长势强,分化增殖效果好。
本发明适当提高培养基中Ca元素的浓度,利用Ca(NO3)2·4H2O代替原来的CaCl2·4H2O。由于元素间的相互促进与拮抗作用,N素又可促进P、Fe、Mg元素的吸收,同时也降低了Ca元素的吸收,因此,在本发明的培养基中增加N素的使用时也同时合理地调高了Ca元素的浓度。
盐酸硫胺素(维生素B1)是植物组织培养培养基中必需添加的一类微量有机物质,在植物生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。但不同植物其适合浓度也不尽相同。本发明盐酸硫胺素适合浓度为0.1mg/L,对于欧洲越橘培养基中维生素B1过高,可导致试管苗总叶绿素含量、SOD活性和POD活性下降,而质膜相对透性、MDA含量和脯氨酸含量增加,生长分化受到抑制。
本发明的有益效果:
通过本发明的欧洲越橘组织快繁培养基利用植物组织培养方法可以在短时间内获得遗传性状高度一致的欧洲越橘群体,能够满足商品化、工厂化大规模快速生产欧洲越橘无菌容器苗的需要,大大缩短了良种推广的进程,并为遗传改良提供了新的途径。通过本发明的欧洲越橘组织快繁培养基利用植物组织培养方法处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为85%~93%;试管苗平均分化增殖倍数为12.8~19.6倍。
具体实施方式
具体实施方式一:本实施方式欧洲越橘组织快繁培养基包括腋芽诱导培养基和分化增殖培养基两种培养基;其中,所述的腋芽诱导培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
其中,所述的Dy培养基是由大量元素、钙盐、微量元素、铁的络合盐、有机物质、强度为1400g/cm2的琼脂和蒸馏水组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由180mg/L~200mg/L的KNO3、400mg/L~410mg/L的NH4NO3、365mg/L~380mg/L的MgSO4·7H2O和160mg/L~180mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为680mg/L~690mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73mg/L~74mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.0mg/L~38.0mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.05mg/L~0.15mg/L的盐酸硫胺素、0.45mg/L~0.55mg/L的烟酸、0.5mg/L~0.6mg/L的盐酸吡哆醇、90mg/L~110mg/L的肌醇和1.5mg/L~2.5mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.0g/L~7.0g/L,pH为5.6。
具体实施方式二:本实施方式与具体实施方式一不同的是:所述的腋芽诱导培养基为含有0.6mg/L玉米素的Dy培养基。其他与具体实施方式一相同。
具体实施方式三:本实施方式与具体实施方式一或二不同的是:所述的分化增殖培养基为含有0.5mg/L 6-苄基胺基嘌呤和1.0mg/L玉米素的Dy培养基。其他与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式四:本实施方式与具体实施方式一至三之一不同的是:每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成。其他与具体实施方式一至三之一相同。
具体实施方式五:本实施方式与具体实施方式一至四之一不同的是:每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O。其他与具体实施方式一至四之一相同。
具体实施方式六:本实施方式与具体实施方式一至五之一不同的是:每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.5mg/L的Na2EDTA组成。其他与具体实施方式一至五之一相同。
具体实施方式七:本实施方式与具体实施方式一至六之一不同的是:每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成。其他与具体实施方式一至六之一相同。
具体实施方式八:本实施方式与具体实施方式一至七之一不同的是:每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。其他与具体实施方式一至七之一相同。
具体实施方式九:本实施方式的欧洲越橘组织培育方法具体是按以下步骤进行:
一、取材时应在晴好天气的中午或下午,从健壮无病的植株上选取欧洲越橘植物组织单节茎段,经流水冲洗15min后,在超净工作台消毒,方法为:采用0.1%HgCl2浸泡消毒2.0min,然后用无菌水冲洗3次,并浸泡在无菌水60min,得到灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段;
二、将灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段接种到腋芽诱导培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lux,培养时间25d~30d;然后将培养25d~30d的腋芽转到分化增殖培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度3000Lux,相对湿度60%~70%,培养时间60d;
经步骤一和步骤二处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为85%~93%;试管苗平均分化增殖倍数为12.8~19.6倍;
所述的腋芽诱导培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有0.1mg/L~1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L~1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
其中,所述的Dy培养基是由大量元素、钙盐、微量元素、铁的络合盐、有机物质、强度为1400g/cm2的琼脂和蒸馏水组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由180mg/L~200mg/L的KNO3、400mg/L~410mg/L的NH4NO3、365mg/L~380mg/L的MgSO4·7H2O和160mg/L~180mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为680mg/L~690mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73mg/L~74mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.0mg/L~38.0mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.05mg/L~0.15mg/L的盐酸硫胺素、0.45mg/L~0.55mg/L的烟酸、0.5mg/L~0.6mg/L的盐酸吡哆醇、90mg/L~110mg/L的肌醇和1.5mg/L~2.5mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.0g/L~7.0g/L,pH为5.6。
具体实施方式十:本实施方式与具体实施方式九不同的是:所述的腋芽诱导培养基为含有0.6mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有0.5mg/L 6-苄基胺基嘌呤和1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.5mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。其他与具体实施方式九相同。
具体实施方式一至十中所述玉米素和6-苄基胺基嘌呤的浓度都是相对于Dy培养基进行定量的。
采用以下实施例验证本发明有益效果:
实施例一:欧洲越橘组织培育方法具体是按以下步骤进行:
一、取材时应在晴好天气的中午或下午,从健壮无病的植株上选取欧洲越橘植物组织单节茎段,经流水冲洗15min后,在超净工作台消毒,方法为:采用0.1%HgCl2充分浸泡消毒2.0min,然后用无菌水冲洗3次,并浸泡在无菌水60min,得到灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段;
二、将灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段接种到腋芽诱导培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lux,培养时间25d~30d;然后将培养25d~30d的腋芽转到分化增殖培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度3000Lux,相对湿度60%~70%,培养时间60d;
经步骤一和步骤二处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为93%;试管苗平均分化增殖倍数为19.6倍;
所述的腋芽诱导培养基为含有0.6mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有0.5mg/L 6-苄基胺基嘌呤和1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.3mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。
本实施例所述玉米素和6-苄基胺基嘌呤的浓度都是相对于Dy培养基进行定量的。
实施例二:欧洲越橘组织培育方法具体是按以下步骤进行:
一、取材时应在晴好天气的中午或下午,从健壮无病的植株上选取欧洲越橘植物组织单节茎段,经流水冲洗15min后,在超净工作台消毒,方法为:采用0.1%HgCI2充分浸泡消毒2.0min,然后用无菌水冲洗3次,并浸泡在无菌水60min,得到灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段;
二、将灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段接种到腋芽诱导培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lux,培养时间25d~30d;然后将培养25d~30d的腋芽转到分化增殖培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度3000Lux,相对湿度60%~70%,培养时间60d;
经步骤一和步骤二处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为91%;试管苗平均分化增殖倍数为17.9倍;
所述的腋芽诱导培养基为含有1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.6mg/L玉米素的Dy培养基;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.3mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。
本实施例所述玉米素和6-苄基胺基嘌呤的浓度都是相对于Dy培养基进行定量的。
实施例三:欧洲越橘组织培育方法具体是按以下步骤进行:
一、取材时应在晴好天气的中午或下午,从健壮无病的植株上选取欧洲越橘植物组织单节茎段,经流水冲洗15min后,在超净工作台消毒,方法为:采用0.1%HgCI2充分浸泡消毒2.0min,然后用无菌水冲洗3次,并浸泡在无菌水60min,得到灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段;
二、将灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段接种到腋芽诱导培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lux,培养时间25d~30d;然后将培养25d~30d的腋芽转到分化增殖培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度3000Lux,相对湿度60%~70%,培养时间60d;
经步骤一和步骤二处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为85%;试管苗平均分化增殖倍数为19.3倍;
所述的腋芽诱导培养基为含有0.3mg/L玉米素的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为含有1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和1.0mg/L玉米素的Dy培养基;
每1L的Dy培养基中含有所述的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有所述的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.3mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。
本实施例所述玉米素和6-苄基胺基嘌呤的浓度都是相对于Dy培养基进行定量的。
综上所述:由Dy培养基和浓度为0.6mg/L的ZT组成欧洲越橘腋芽诱导培养诱导效果好,腋芽诱导萌发率达93%;由Dy培养基和浓度为6-BA0.5mg/L和1.0mg/L的玉米素组成欧洲越橘分化增殖培养基的增殖培养效果好,平均可达到19.6倍,培养的试管苗茎秆粗壮,苗高5.5~6.0cm,无玻璃化现象,长势良好,达到商业化、工厂化育苗标准。

Claims (10)

1.欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于欧洲越橘组织快繁培养基包括腋芽诱导培养基和分化增殖培养基两种培养基;其中,所述的腋芽诱导培养基是由0.1mg/L~1.0mg/L玉米素组成的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基为是由0.1mg/L~1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L~1.0mg/L玉米素组成的Dy培养基;
其中,所述的Dy培养基是由大量元素、钙盐、微量元素、铁的络合盐、有机物质、强度为1400g/cm2的琼脂和蒸馏水组成;
每1L的Dy培养基中含有的大量元素由180mg/L~200mg/L的KNO3、400mg/L~410mg/L的NH4NO3、365mg/L~380mg/L的MgSO4·7H2O和160mg/L~180mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有的钙盐为680mg/L~690mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有的铁的络合盐由73mg/L~74mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.0mg/L~38.0mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有的有机物质由25g/L的蔗糖、0.05mg/L~0.15mg/L的盐酸硫胺素、0.45mg/L~0.55mg/L的烟酸、0.5mg/L~0.6mg/L的盐酸吡哆醇、90mg/L~110mg/L的肌醇和1.5mg/L~2.5mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.0g/L~7.0g/L,pH为5.6。
2.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于所述的腋芽诱导培养基是由0.6mg/L玉米素组成的Dy培养基。
3.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于所述的分化增殖培养基是由0.5mg/L 6-苄基胺基嘌呤和1.0mg/L玉米素组成的Dy培养基。
4.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于每1L的Dy培养基中含有的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成。
5.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于每1L的Dy培养基中含有的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O。
6.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于每1L的Dy培养基中含有的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.5mg/L的Na2EDTA组成。
7.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于每1L的Dy培养基中含有的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成。
8.根据权利要求1所述的欧洲越橘组织快繁培养基,其特征在于每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。
9.欧洲越橘组织培育方法,其特征在于欧洲越橘组织培育方法具体是按以下步骤进行:
一、取材时应在晴好天气的中午或下午,从健壮无病的植株上选取欧洲越橘植物组织单节茎段,经流水冲洗15min后,在超净工作台消毒,方法为:采用0.1%HgCl2浸泡消毒2.0min,然后用无菌水冲洗3次,并浸泡在无菌水60min,得到灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段;
二、将灭菌后的欧洲越橘植物组织单节茎段接种到腋芽诱导培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度2000Lux,培养时间25d~30d;然后将培养25d~30d的腋芽转到分化增殖培养基中,培养条件为白天培养温度23℃~27℃,夜间培养温度18℃~22℃,光照时间12h/d,光照强度3000Lux,相对湿度60%~70%,培养时间60d;
经步骤一和步骤二处理后的欧洲越橘植物组织单节茎段的腋芽诱导萌发率为85%~93%;试管苗平均分化增殖倍数为12.8~19.6倍;
所述的腋芽诱导培养基是由0.1mg/L~1.0mg/L玉米素组成的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基是由0.1mg/L~1.0mg/L 6-苄基胺基嘌呤和0.1mg/L~1.0mg/L玉米素组成的Dy培养基;
其中,所述的Dy培养基是由大量元素、钙盐、微量元素、铁的络合盐、有机物质、强度为1400g/cm2的琼脂和蒸馏水组成;
每1L的Dy培养基中含有的大量元素由180mg/L~200mg/L的KNO3、400mg/L~410mg/L的NH4NO3、365mg/L~380mg/L的MgSO4·7H2O和160mg/L~180mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有的钙盐为680mg/L~690mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有的铁的络合盐由73mg/L~74mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.0mg/L~38.0mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有的有机物质由25g/L的蔗糖、0.05mg/L~0.15mg/L的盐酸硫胺素、0.45mg/L~0.55mg/L的烟酸、0.5mg/L~0.6mg/L的盐酸吡哆醇、90mg/L~110mg/L的肌醇和1.5mg/L~2.5mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.0g/L~7.0g/L,pH为5.6。
10.根据权利要求9所述的欧洲越橘组织培育方法,其特征在于所述的腋芽诱导培养基是由0.6mg/L玉米素组成的Dy培养基;
所述的分化增殖培养基是由0.5mg/L 6-苄基胺基嘌呤和1.0mg/L玉米素组成的Dy培养基;
每1L的Dy培养基中含有的大量元素由190mg/L的KNO3、405mg/L的NH4NO3、375mg/L的MgSO4·7H2O和175mg/L的KH2PO4组成;
每1L的Dy培养基中含有所述的钙盐为684mg/L的Ca(NO3)2·4H2O;
每1L的Dy培养基中含有的微量元素由6.3mg/L的H3BO3、22.4mg/L的MnSO4·4H2O、8.5mg/L的ZnSO4·7H2O、0.24mg/L的Na2MoO4·2H2O和0.24mg/L的CuSO4·5H2O组成;
每1L的Dy培养基中含有的铁的络合盐由73.5mg/L的C10H13FeN2NaO8和37.5mg/L的Na2EDTA组成;
每1L的Dy培养基中含有的有机物质由25g/L的蔗糖、0.1mg/L的盐酸硫胺素、0.55mg/L的烟酸、0.55mg/L的盐酸吡哆醇、110mg/L的肌醇和2.2mg/L的甘氨酸组成;
每1L的Dy培养基中强度为1400g/cm2的琼脂的含量为6.5g/L,pH为5.6。
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