CN102405836B - 利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）外植体的采集与消毒；（2）将前步所得茎段接种到外植体诱导培养基诱导30天至小芽长4-5cm长；（3）将前步所得小苗转入继代培养基培养20天；（4）取2-3cm长的无根幼苗转入生根培养基中培养40天；（5）将培养瓶置于温室中自然光炼苗2-3天后，将生根幼植株取出并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗；（6）漂洗后的生根幼株种植于栽培基质，当小苗长至20－30cm时移栽至大田苗圃进行栽植。本发明选择的工艺兼顾提高繁殖量、保持遗传性状和减少玻璃化三个方面,通过批量组培实现彩叶丁香的快速繁殖。

Description

利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法

技术领域

本发明涉及植物种苗繁殖技术，具体地说是利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法。

背景技术

彩叶丁香(Syringa vulgaris L.)叶片带有洒金斑点，在阳光照射下非常醒目。它根系发达、植株长势旺盛，萌蘖力和抗旱能力较强，并且冬天落叶迟，是不可多得的城市绿化美化树种。但作为近几年从欧洲引进的一个新品种，可供扦插、嫁接的数目少，既限制了其繁殖速度，也不利于其优良性状的保持，因而无法满足日益增加的社会需求。利用植物组织培养技术产业化生产优质彩叶丁香种苗是解决这一生产问题的有效途径。然而同其它木本植物一样，玻璃化是其组织培养需要解决的难题之一，而且对于彩叶丁香这类观赏彩叶类树种，由于其有不少遗传学上的嵌合体，如一些镶嵌色彩的种子，带金边、银边、花叶植物，在培养过程中，嵌合体各组分可能分离，使杂色体的植物将显示出改变的形态或完全丧失杂色形状，从而更加大了培养难度。只有通过改良培养条件，达到兼顾提高繁殖量、保持遗传性状和减少玻璃化的目的，才能通过批量组培实现彩叶丁香的快速繁殖。

发明内容

本发明的目的就是提供一种利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法，既可快速繁殖，又能保证其遗传学特性、减少玻璃化发生率，以满足城市绿化美化的需求。

本发明是这样实现的：利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法包括以下步骤：

(1)外植体的采集与消毒：将除掉叶片的彩叶丁香的茎段依次进行清洗、紫外照射、酒精消毒，再放入0.1％HgC12溶液消毒灭菌5min，所述消毒灭菌液中加入占灭菌液重量百分比0.5％的吐温-80，最后用无菌水冲洗，再切成带2-3个腋芽的1～1.5cm长的茎段；

(2)将前步所得茎段接种到外植体诱导培养基：MS+6-BA0.1mg/l+NAA0.01mg/l，彩叶丁香芽苗诱导30天至小芽长4-5cm长；

(3)将前步所得小苗转入继代培养基培养20天，在组培的前10代，所述继代培养基为：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l；从第11代起所述继代培养基为：1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l；从第17代起所述继代培养基为：1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l+硫酸庆大霉素4万单位/1；

(4)取2-3cm长的无根幼苗转入生根培养基中：1/2MS+NAA0.1mg/l，培养40天；

(5)将培养瓶置于温室中自然光炼苗2-3天后，将生根幼植株取出并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗；

(6)漂洗后的生根幼株种植于栽培基质并放于大棚内培养，单株套透明塑料袋，保持90％的相对湿度，光照强度为2000-4000lux；一周后弃袋；所述栽培基质为消毒灭菌后的草炭；当小苗长至20-30cm时移栽至大田苗圃进行栽植。

本发明第(1)步中，在对外植体的灭菌中，在灭菌剂中加入吐温-80可以降低植物材料表面的张力，达到更好的消毒效果，在0.1％HgC12溶液中加入0.1％的吐温-80，污染率随着吐温-80的增加逐渐降低，而枯死率则随吐温-80的增加逐渐增高，即加入吐温会对材料的伤害也在增加，所以应注意用量和灭菌时间。综合分析，加入灭菌液的0.5％，即在100ml灭菌液中加入15滴吐温-80，使药剂更易于展布，更容易浸入到灭菌的材料表面。污染率随灭菌时间的延长逐渐降低，而枯死率则随灭菌时间的延长逐渐增高。综合分析以上结果表明，用0.1％HgC12，灭菌5min成活率可达80％，效果最好，时间太长，材料容易死亡，时间太短灭菌不彻底，易造成污染。

本发明第(2)步中，彩叶丁香腋芽在第10天就开始萌动，15天伸长并长出嫩叶，30天茎段芽点诱导成高4-5cm，具有8余片叶子的芽苗。

本发明第(3)步中，按组培代数不同，选择不同的培养基，以兼顾控制褐化、不影响增殖率和减少玻璃化三方面，从而达到效益最大化。

本发明第(4)步中，取2-3cm长的无根幼苗转入生根培养基中，大约12d左右开始生根，培养40天后，根系主根粗壮，侧根发达，苗壮，叶绿，长势好，试管苗小苗长至5cm以上时，几乎占满整个接种瓶，这时即可进行移栽。

本发明第(5)步中，试管苗移栽前，炼苗2-3天，此时可适当加大光照，以提高小苗的木质化程度。用0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗，不仅可以洗去组培苗上的培养基而且也对小苗进行了杀菌处理并且没有药害的产生。

本发明第(6)步中，弃袋后光照强度要逐渐加强，否则小苗易徒长，彩叶特性就会减弱。每周浇一次肥水，用通用肥N-P-K＝20-10-20，每天往小苗叶片上喷2次雾，以增加小苗的相对湿度。当小苗长至20-30cm时就可移栽至大田苗圃进行栽植。

本发明利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖，通过消毒工艺的选择，解决了控制褐化与提高增殖率之间的矛盾问题；通过对不同代数的继代培养，选择不同的培养基，有针对性地解决了快速繁殖与玻璃化率升高之间的矛盾问题，兼顾提高繁殖量、保持遗传性状和减少玻璃化的目的，通过批量组培实现彩叶丁香的快速繁殖，从而满足城市绿化美化对彩叶丁香苗的需求。

具体实施方式

供试材料为由荷兰引种栽培在我园内的彩叶丁香(小步圆舞曲)，取材时间为选在5月-8月，植株生长旺盛时期，供试材料以当年生嫩枝作为外植体进行培养，要求新生枝生长健壮，叶片具有母本的优良性状，并且有饱满而未萌发的腋芽。

组织培养材料一般取自田间正常生长的植株，但生长在自然环境下的植物，不仅生长条件不清洁卫生，而且容易受到病虫害的侵袭，尤其是多年生的木本植物，组织表面和内部都可能感染微生物。为了获得健康、无菌的植物材料，有时需要在材料采集之前进行预处理，将植株栽培在特殊管理的大田和温室中，或进行室内盆栽。然后从温室栽培的植株中取材。所谓特殊管理是：生长环境要通风透气，湿度要尽可能低，光线充足，远离肮脏、污浊的环境，土壤要用药物和蒸汽熏蒸消毒，或采用蛭石、珍珠岩等特殊基质进行无土栽培。浇水不能从植株上面浇施，只能浇湿土壤。施肥要尽量用无机肥料，保持土壤清洁，降低病菌存活的几率。同时要用防虫网等设施，或定期喷施农药，确保植株不受病虫害侵袭。在人工控制的环境条件下，促使母株的生长代谢活跃，外植体的生理状态可能得到改善，有利于外植体的培养。同时方便取材，容易灭菌，降低污染率，提高成活率。

培养条件

所有培养基均添加3％的白砂糖和0.5％琼脂粉，PH值调至6.0，高温高压灭菌，培养温度为25±2℃，光照强度为3000-4000lux，光照时间为14-16h/d。

实施例

(1)外植体的采集与消毒：

首先除掉多余的叶片，只保留茎段，放在流水下用毛刷蘸肥皂水或洗衣粉进行刷洗，洗掉表面附着的尘土和细菌。然后在超净台上先用紫外灯照射10分钟，再用75％的酒精消毒30秒。再放入0.1％HgC12溶液消毒灭菌5min，所述消毒灭菌液中加入占灭菌液重量百分比0.5％的吐温-80，最后用无菌水冲洗6～8次.每次2-3分钟，消毒杀菌过程完成后，将茎段放在无菌滤纸中吸干，并将茎段两头切去一小段，以减少灭菌药物的毒害。然后将其切成1～1.5cm长的茎段(带2-3个腋芽)，分别接种到外植体诱导培养基中。

在如表1所示的对比试验中，显示吐温-80在加入量为0.5％时，效果最好。

表1

(2)将前步所得茎段接种到外植体诱导培养基：MS+6-BA0.1mg/l+NAA0.1mg/l，彩叶丁香腋芽在第10天就开始萌动，15天伸长并长出嫩叶，30天茎段芽点诱导成高4-5cm，具有8余片叶子的芽苗。

在表2所示的对比试验中显示，综合考虑增殖率与褐化控制两方面因素，在培养基中加入Vc0.5g/l效果最佳。

表2  培养基附加物对彩叶丁香增殖率的影响

注：I-对照  Ac-活性碳  Vc-抗坏血酸

由表2的对比数据可以看出，加入Vc0.5g/l，Ac0.5g/l，Vc1.0g/l后的增殖率与对照无显著差异，Ac3.0g/l能有效控制褐化，但显著降低增值率。从平均增殖率上看，II＞I＞III＞IV，从苗生长势看，II＞III＞IV＞I。因此，Vc0.5g/l是最有效抑制褐化的附加成分。

(3)将前步所得小苗转入继代培养基培养20天，在组培的前10代，所述继代培养基为：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l；从第11代起所述继代培养基为：1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l；从第17代起所述继代培养基为：1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l+硫酸庆大霉素4万单位/l。

在彩叶丁香增殖前期，最佳培养基为MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l。

表3  细胞分裂素(6-BA)的用量对彩叶丁香玻璃化率的影响

表3的对比结果可显示出，本发明选择的培养基既可有效提高腋芽增殖速度，又兼顾芽苗质量，以免出现严重的玻璃化现象，也可避免因玻璃化而导致再生芽生根困难的问题出现。

表4  彩叶丁香增殖过程中玻璃化率的控制

表中各培养基分别为：

A：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l；

B：1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l；

C：1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+Vc0.5g/l+硫酸庆大霉素4万单位/l。

表4的对比结果显示出，在增殖过程中前10代，A培养基能够很好的快速得到所需数量的彩叶丁香芽苗。但随着增殖代数的增加，玻璃化率逐渐增大。从第11代开始用B培养基，可起到显著降低玻璃化的作用。但随着增殖代数的增加，玻璃化率有所增大。在第17代加入4万单位的硫酸庆大霉素，可使彩叶丁香玻璃化率持续降低，并且在20代后会玻璃化率稳定在4.2％左右，足以满足生产需要。

(4)取2-3cm长的无根幼苗转入生根培养基中：1/2MS+NAA0.1mg/l+0.3％的活性炭，大约12d左右开始生根，培养40天后，试管苗小苗长至5cm以上时，几乎占满整个接种瓶，这时即可进行移栽。

本实施例中，第(2)步到第(4)步的所有培养基均添加3％的白砂糖和0.5％琼脂粉，PH值调至6.0，高温高压灭菌，培养温度为25±2℃，光照强度为3000-4000lux，光照时间为16h/d。

(5)试管苗移栽前，将培养瓶置于温室中自然光炼苗2-3天，此时可适当加大光照，以提高小苗的木质化程度。然后用镊子将生根幼植株从培养基中取出，并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗，用此溶液不仅可以洗去组培苗上的培养基而且也对小苗进行了杀菌处理并且没有药害的产生。

(6)将生根幼株种植在穴盘孔为72的穴盘中，栽培基质为消毒灭菌后的草炭，放在大棚内培养，用塑料布照住，以防止水分散失，严格控制基质湿度，这是提高移栽成活率的关键环节。我们可以在生产温室中再专门搭建一个小拱棚，这个小拱棚可随装随用，上面覆盖塑料布和遮荫网，前期尽量保持90％的相对湿度，光照强度为2000-4000lux，一个星期后就可以撤掉拱棚和覆盖物转入正常管理，关照强度要逐渐加强，否则小苗易徒长，彩叶特性就会减弱。每周浇一次肥水，用通用肥N-P-K＝20-10-20，每天往小苗叶片上喷2次雾，以增加小苗的相对湿度。当小苗长至20-30cm时就可移栽至大田苗圃进行栽植。

Claims (1)

1.一种利用组织培养对彩叶丁香进行快速繁殖的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）外植体的采集与消毒：将除掉叶片的彩叶丁香的茎段依次进行清洗、紫外线照射、酒精消毒，再放入0．1 ％HgC1₂溶液消毒灭菌5min，所述消毒灭菌液中加入占灭菌液重量百分比0.5%的吐温-80，最后用无菌水冲洗，再切成带2—3个腋芽的1～1．5cm长的茎段；

（2）将前步所得茎段接种到外植体诱导培养基：MS+6-BA0.1mg/l+NAA0.01mg/l，彩叶丁香芽苗诱导30天至小芽长4-5cm长；

（3）将前步所得小苗转入继代培养基培养20天，在组培的前10代，所述继代培养基为：MS+6-BA1.0mg/l+NAA0.1mg/l+ Vc0.5g/l；从第11代起所述继代培养基为： 1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+ Vc0.5g/l；从第17代起所述继代培养基为： 1/2MS+6-BA0.5mg/l+NAA0.1mg/l+ Vc0.5g/l＋硫酸庆大霉素4万单位/ l；

（4）取2-3cm长的无根幼苗转入生根培养基中：1/2MS+NAA0.1mg/l，培养40天； 

（5）将培养瓶置于温室中自然光炼苗2-3天后，将生根幼植株取出并在0.1％的高锰酸钾溶液中进行漂洗； 

（6）漂洗后的生根幼株种植于栽培基质并放于大棚内培养，单株套透明塑料袋，保持90％的相对湿度，光照强度为2000-4000lux；一周后弃袋；所述栽培基质为消毒灭菌后的草炭；当小苗长至20－30cm时移栽至大田苗圃进行栽植。