CN100512629C - 黄藤无性系组培繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及黄藤无性系组培繁殖方法，其特点是：1)萌蘖芽外植体的采集，在采集萌蘖芽外植体的过程中防止芽体外伤和芽心的震裂，并使萌蘖芽外植体的高度为15-40cm；2)外植体的消毒，采用两次消毒法，首先，用洗衣粉将外植体清洗干净，第二步：用0.1%升汞消毒1-2分钟，无菌水漂洗3次；3)防止褐变，采用半光氨酸或抗坏血酸溶液泡洗前述萌蘖芽外植体；4)丛芽诱导与继代增殖；5)生根培养，高度大于2cm的芽苗最为适合生根培养。本方法以萌蘖芽做外植体，可以繁殖经过选育和测定的优良无性系，生产的是良种的苗木，具有强大的市场竞争力，因而本技术具有广阔的应用前景，可产生巨大的经济效益。

Description

黄藤无性系组培繁殖方法

所属技术领域

本发明涉及黄藤培育方法，特别是黄藤无性系组培繁殖方法。属于热带林木特别是黄藤的栽培及移植技术领域。

背景技术

黄藤(Daemonorops margaritae Beccari.)是棕榈科(Palmae)省藤亚科(Calamoideae)省藤族(Calameae)黄藤属(Daemonorops)的具刺、攀缘、丛生藤本植物，是华南热带、南亚热带地区森林特有的伴生植物。藤茎具有良好的工艺特性，是制作家具和工艺品的优良原料。藤嫩梢富含人体所需的多种营养成分，可做蔬菜食用。果实可萃取“麒麟血竭”。种子质地坚硬，是制作“佛珠”的传统材料。因此，黄藤是具有较高经济价值和开发前景的多用途珍贵森林植物，也是华南地区广泛栽培的主要商品藤种。目前，海南、广东、广西、云南、福建等省区已大面积栽培黄藤。

现有技术中，黄藤主要采用种子繁殖，育苗技术已成功用于造林苗木的培育。但种子繁殖存在如下方面缺点：(1)受到季节的影响，一年只能培育1-2季苗木。黄藤种子在常规室温条件下不耐贮藏，给种子繁殖增加了新的难度。(2)黄藤的最适采种季节为11～12月，由于该季节产地的湿度小，室温条件下种子容易失水，从而迅速失去发芽能力。即使在恒温(15度)、恒湿(介质含水率保持在50％～65％)的最佳贮藏条件下贮藏六个月，发芽率也降低至65％左右。(3)种子繁殖只能繁殖常规苗木，不能繁殖无性系苗木。由于黄藤为异花授粉植物，且驯化程度不高，所以天然林和现有人工林中的黄藤的杂合程度高，种子繁殖的苗木造林后在生长、萌蘖、材性等方面分化大，既不利于平均产量的提高，也不利于藤林的集约化经营和藤条采收与销售。

上世纪九十年代开始，中国林业科学研究院热带林业研究所开始研究黄藤的组培快繁技术。但棕榈科植物组培技术研究难度大，经过两个五年计划的研究，也只能以种胚作外植体才能组培快繁成功，而用顶芽、萌蘖芽、根、叶等无性器官做外植体，则不能组培快繁成功。因而，原有的藤组培技术仅局限于种苗繁殖，即通过组织培养工厂化快繁苗木，但仍然不能繁殖无性系苗木。与种子繁育苗木相比，组培快繁的成本高，市场竞争能力低下，因而现有以种胚做外植体的黄藤组培技术尚无应用前景，不可能产生经济效益。由于林木基因组杂合程度高，实生苗造林分化大，林木育种通常是走无性系育种的道路，即从育种群体中选出优树，然后通过无性繁殖的方法繁殖良种。现有只能以种胚为外植体的组培技术尚无法满足无性系育种和无性系推广的要求。如果不解决黄藤无性系组培快繁的技术问题，将严重制约黄藤无性系育种、良种的中试和良种的推广。

发明内容

本发明需要解决的技术问题，即本发明的目的，是为了克服现有技术种子繁殖法存在的受季节影响大、种子发芽率低、繁殖速度慢的缺点，提供黄藤无性系组培繁殖方法。

本发明的技术问题可以通过采取如下措施解决：黄藤无性系组培繁殖方法，其特点是：

1)萌蘖芽外植体的采集，在采集萌蘖芽外植体的过程中防止芽体外伤和芽心的震裂，并使萌蘖芽外植体的高度为15—40cm；

2)外植体的消毒，采用两次消毒法，首先，用洗衣粉将外植体清洗干净，剥去1-2层叶鞘，用75％酒精消毒15—20秒，0.1％升汞消毒8-10分钟，无菌水漂洗1次5分钟，第二步：剥去多余叶鞘并修剪至适合于培养的大小，即萌蘖芽外植体3-4cm长、顶芽外植体5-6cm长，再用0.1％升汞消毒1-2分钟，无菌水漂洗3次，分别为5分钟、5分钟、10分钟；

3)防止褐变，采用半光氨酸或抗坏血酸溶液泡洗前述萌蘖芽外植体，或采用半光氨酸和抗坏血酸混合溶液泡洗前述萌蘖芽外植体，可以有效地抑制芽外植体的褐变，所述的半光氨酸和抗坏血酸的浓度分别为2mg/L和10mg/L；

4)丛芽诱导与继代增殖，丛芽诱导和继代增殖的培养基配方为：KNO₃、NH₄NO₃、CaCl₂、MgSO₄和KH₂PO₄，其配比分别为：1.5MS、0.5MS、1.0MS、1.0MS、2.5MS；丛芽诱导周期35～40天，继代培养的周期为45～50天；

5)生根培养，选择高度大于2cm的芽苗进行生根培养，生根培养基为：1.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA+0.33MS大量元素+20.g/L蔗糖溶液+1.0MS微量元素+1.0MS维生素和氨基酸，生根培养的时间需要50～60天，对未生根的芽苗除去外层叶鞘后，进行第二次生根培养。

为了更好地解决本发明的技术问题，还可采用如下方案

经过生根培养后再进行田间移植，将高度大于4cm、根长度大于4cm，具有2片以上叶子的苗木移植至田间，适合黄藤组培苗移植的介质有细沙、泥炭土和黄心土，也可以将三者按1∶1∶2的比例混合，作为黄藤组培苗的移植介质。

移植介质以1/1000的高锰酸钾溶液消毒，移植后每个星期用1/800的百菌清和多菌灵轮流喷施。

施肥方法为1/1000的复合肥溶液每周喷施一次，移植后1～7天，95％的遮荫网遮荫，8～30天，85％的遮荫网遮荫，31～60天，70％的遮荫网遮荫，随后采用50％遮荫网遮荫，一直管理到苗木出圃造林。

在前述第4)步丛芽诱导和继代增殖的培养基配方增加激素，激素成份为：BA4.0mg/L+IBA 0.25mg/L+2，4-D 0.75mg/L。

在前述第5)生根培养中将芽苗高度和大小接近的2～4个芽切分在同一小芽丛，转接到生根培养基上进行生根培养，移植后即可培育成丛芽苗。

本发明具有如下突出效果：

与原有种子育苗相比，本方法具有种苗繁殖速度快、种苗生产不受季节限制的优点，与已发表的以种胚为外植体的组培技术相比，本组培方法具有能够繁殖优良无性系的优点。原有组培技术以种胚做外植体，繁殖材料的遗传基础无法完全控制，繁殖的苗木与种子繁殖的苗木相比没有品质差别，但组培繁育苗木的成本比种子繁育苗木高出许多，难以与种子繁育的苗木在市场上竞争，因而原有以种胚外植体的组培技术的应用前景不大。本方法以萌蘖芽做外植体，可以繁殖经过选育和测定的优良无性系，生产的是良种的苗木，具有强大的市场竞争力，因而本技术具有广阔的应用前景，可产生巨大的经济效益。

具体实施方式

实施例1：

热带林业研究所组培室从广州龙洞所内和高要金鸡坑林场多次采集萌蘖芽外植体，应用本发明办法，用锯将萌蘖芽从母株上锯下来，萌蘖芽外植体的大小为15—40cm高，采用本发明的两次消毒法步骤，消毒成功率最高可达59.1％，平均成功率为34.9％--38.4％。具体方法、步骤如下；

1)萌蘖芽外植体的采集，采集萌蘖芽外植体的关键在于防止芽体外伤和芽心的震裂。如果芽体有伤口，泥土容易进入芽体内部，无法消毒成功。芽心震裂后，伤口处即迅速褐变，易导致芽心的死亡。因而，不能用锄头将萌蘖芽挖离母株，也不能用刀砍，必须用锯将萌蘖芽从母株上锯下来。萌蘖芽处于土壤之中，必须尽量避免在雨天及雨后1-3天内采集。否则，污染率明显上升。

适宜的萌蘖芽外植体的大小为15—40cm高。萌蘖芽过小，外植体消毒后易死亡，且没有形成足够的次级萌蘖芽原基，离体培养后容易出现持续的单芽高生长但不萌发次级萌蘖芽的现象。萌蘖芽过大，尤其是超50cm后，萌蘖芽已开始抽茎，茎尖不在基部。要保留茎尖，则外植体过大，养分吸收供应不上，茎尖无法生长，且露出在培养基外面的部分褐变严重，最终导致整个芽的死亡。不保留茎尖，外植体也会缺乏茎尖而死亡。外植体的采集季节对消毒成功率、芽的生长和丛芽的诱导均有显著的影响。从2月至8月的各个月采集的外植体表明：2月-3月初和9月份采集的外植体，因土壤干燥，容易消毒成功，4-8月份雨水较多，温度较高，雨后采集的外植体难以消毒成功。但2-3月份采集外植体在培养基长时间不生长，难以诱导丛芽。4-8月份采集的外植体容易萌发，其基部的次级蘖芽也易萌发，易增殖，其中，以6-8月份生长旺季采集的外植体最好，增殖率最高。

2)外植体的消毒，针对芽被多层叶鞘包裹的特点，采用两次消毒法。首先，用洗衣粉将外植体清洗干净(萌蘖芽外植体必须清洗干净)，剥去1-2层叶鞘，用75％酒精消毒15—20秒，0.1％升汞消毒8-10分钟，无菌水漂洗1次5分钟，第二步：剥去多余叶鞘并修剪至适合于培养的大小(萌蘖芽外植体3-4cm长，顶芽外植体5-6cm长)，再用0.1％升汞消毒1-2分钟，无菌水漂洗3次，分别为5分钟，5分钟，10分钟。消毒成功率大于40％。

3)防止褐变，棕榈藤萌蘖芽外植体消毒后褐变十分严重，不加处理会迅速死亡。经过系列研究发现，采用暗处理、附加活性碳等方法难以达到预期效果，使用聚乙烯吡咯烷酮则会导致外植体产生严重的白色分泌物，采用半光氨酸和抗坏血酸可以有效地抑制芽外植体的褐变，二者结合效果更好。适宜于防止藤类芽外植体抗褐变的半光氨酸和抗坏血酸的浓度分别为2mg/L和10mg/L。

4)丛芽诱导与继代增殖，丛芽诱导和继代增殖的培养基配方为：KNO₃、NH₄NO₃、CaCl₂、MgSO₄和KH₂PO₄分别为：1.5MS；0.5MS；1.0MS；1.0MS；2.5MS。激素为：BA4.0mg/L+IBA0.25mg/L+2，4-D0.75mg/L。继代培养的周期为45～50大，增殖倍数为3～4倍。另外，接种与培养方法对萌蘖芽外植体的丛芽诱导也有一定的影响。外植体消毒后，基部0.2-0.5cm因杀伤和褐变而死亡，死亡部分严重影响营养的吸收，必须将芽倾斜或平放，使之充分接触培养基，可显著促进芽的生长，促进二级蘖芽的萌发，从而促进增殖。

5)生根配方和生根培养，高度大于2cm的芽苗最为适合生根培养，生根培养基为1.0mg/L NAA+2.0mg/L IBA+0.33MS大量元素+20.g/L蔗糖溶液+1.0MS微量元素+1.0MS维生素和氨基酸。生根培养的时间需要50～60天，生根率可达85％以上。未生根的芽苗在除去外层叶鞘后，进行第二次生根培养，即可生根。

如果想培育丛芽苗，可以将芽苗高度和大小接近的2～4个芽切分在同一小芽丛，转接到生根培养基上进行生根培养，移植后即可培育成丛芽苗。

6)田间移植，高度大于4cm，根长度大于4cm，具有2片以上叶子的苗木最适合移植。适合黄藤组培苗移植的介质有细沙、泥炭土和黄心土，也可以将三者按1∶1∶2的比例混合，作为黄藤组培苗的移植介质。移植介质以1/1000的高锰酸钾溶液消毒，移植后每个星期用1/800的百菌清和多菌灵轮流喷施，防止杂菌滋生。施肥方法为1/1000的复合肥溶液每周喷施一次。移植后1～7天，95％的遮荫网遮荫，8～30天，85％的遮荫网遮荫，31～60天，70％的遮荫网遮荫，随后采用50％遮荫网遮荫，一直管理到苗木出圃造林。移植成活率大于90％。

在3～11月均可移植黄藤组培苗，其中3月～6月份为黄藤组培苗的最佳移植季节，且温度、湿度均适合苗木的进一步培养，达到造林高度和要求。7-9月份，温度过高，移植成活率略低，通过强度施肥，苗木尚能达到造林高度。10～11月份能够移植成活，但苗木生长季节已过，次年春季苗木尚无法达到造林高度。

本实施例中：BA为6-苄基氨基嘌呤，IBA为吲哚丁酸，NAA为萘乙酸，2，4-D为2，4-二氯苯氧乙酸。

大量元素由KNO₃、NH₄NO₃、CaCl₂、MgSO₄和KH₂PO₄构成，微量元素由H₃BO₃、MnSO₄·4H₂O、ZnSO₄·4H₂O、KI、Na₂MoO₄·2H₂O、Na₂EDTA、Fe₂SO₄·7H₂O、CuSO₄·5H₂O、CoCl₂·6H₂O构成。

实施例2：

消毒成功的外植体采用本发明的防褐化诱导培养基和增殖培养基，2-3个月就可见丛芽产生，丛芽诱导率约10％，继代培养45-50天/代后，增殖倍数为3～4倍。

Claims (6)

1、黄藤无性系组培繁殖方法，其特征是：

1)萌蘖芽外植体的采集，在采集萌蘖芽外植体的过程中防止芽体外伤和芽心的震裂，并使萌蘖芽外植体的高度为15—40cm；

2)外植体的消毒，采用两次消毒法，首先，用洗衣粉将外植体清洗干净，剥去1-2层叶鞘，用75％酒精消毒15—20秒，0.1％升汞消毒8-10分钟，无菌水漂洗1次5分钟，第二步：剥去多余叶鞘并修剪至适合于培养的大小，即萌蘖芽外植体3-4cm长、顶芽外植体5-6cm长，再用0.1％升汞消毒1-2分钟，无菌水漂洗3次，分别为5分钟、5分钟、10分钟；

3)防止褐变，采用半光氨酸或抗坏血酸溶液泡洗前述萌蘖芽外植体，或采用半光氨酸和抗坏血酸混合溶液泡洗前述萌蘖芽外植体，以抑制芽外植体的褐变，所述的半光氨酸和抗坏血酸的浓度分别为2mg/L和10mg/L；

4)丛芽诱导与继代增殖，丛芽诱导和继代增殖的培养基配方为：KNO₃、NH₄NO₃、CaCl₂、MgS0₄和KH₂PO₄，其配比分别为：1.5MS、0.5MS、1.0MS、1.0MS、2.5MS；丛芽诱导周期35～40天，继代培养的周期为45～50天；

5)生根培养，选择高度大于2cm的芽苗进行生根培养，生根培养基为1.0mg/LNAA+2.0mg/LIBA+0.33MS大量元素+20.g/L蔗糖溶液+1.0MS微量元素+1.0MS维生素和氨基酸，生根培养的时间需要50～60天，对未生根的芽苗除去外层叶鞘后，进行第二次生根培养。

2、根据权利要求1所述的黄藤无性系组培繁殖方法，其特征是：经过生根培养后再进行田间移植，将高度大于4cm、根长度大于4cm，具有2片以上叶子的苗木移植至田间，适合黄藤组培苗移植的介质有细沙、泥炭土和黄心土，也可以将三者按1:1:2的比例混合，作为黄藤组培苗的移植介质。

3、根据权利要求2所述的黄藤无性系组培繁殖方法，其特征是：移植介质以1/1000的高锰酸钾溶液消毒，移植后每个星期用1/800的百菌清和多菌灵轮流喷施。

4、根据权利要求2所述的黄藤无性系组培繁殖方法，其特征是：施肥方法为1/1000的复合肥溶液每周喷施一次，移植后1～7天，95％的遮荫网遮荫，8～30天，85％的遮荫网遮荫，31～60天，70％的遮荫网遮荫，随后采用50％遮荫网遮荫，一直管理到苗木出圃造林。

5、根据权利要求1所述的黄藤无性系组培繁殖方法，其特征是：在第4)步丛芽诱导和继代增殖的培养基配方增加激素，激素成份为；BA4.0mg/L+IBA0.25mg/L+2，4-D0.75mg/L。

6、根据权利要求1所述的黄藤无性系组培繁殖方法，其特征是：在第5)生根培养中将芽苗高度和大小接近的2～4个芽切分在同一小芽丛，转接到生根培养基上进行生根培养，移植后即可培育成丛芽苗。