CN102823497B

CN102823497B - 枫香无性系组培繁育方法

Info

Publication number: CN102823497B
Application number: CN201210346938.XA
Authority: CN
Inventors: 曾令海; 周丽华; 何波祥; 连辉明; 蔡燕灵; 张谦; 蔡静如
Original assignee: Guangdong Academy of Forestry
Current assignee: Guangdong Academy of Forestry
Priority date: 2012-09-19
Filing date: 2012-09-19
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2032-09-19
Also published as: CN102823497A

Abstract

本发明涉及一种枫香无性系组培繁育方法，属于林木组培繁育技术领域，该方法步骤为：外植体材料的消毒→芽的诱导→芽的增殖→生根诱导→生根苗的炼苗→组培苗的移栽与管理，具体方法是将当年生的嫩梢去掉叶片，切段成为每段带有1～2个腋芽的茎段，将茎段消毒，用诱导培养基进行诱导培养，新芽再进行增殖培养、生根培养、培育出的生根苗进行炼苗驯化，最后将经驯化的苗移栽到消毒的基质上，进行移栽苗的管理；采用该方法育苗不受季节限制，生产成本低，节约土地资源，同时采用该方法能有效防止褐化现象，有效增殖率高，生根苗生长整齐，培养周期短，组培苗移栽成活率高，苗期培育周期短，可以推动枫香无性系育种，对解决良种规模扩繁和推广起到重要作用。

Description

枫香无性系组培繁育方法

技术领域

本发明涉及一种组培繁育方法，具体涉及枫香无性系组培繁育方法，属于林木组培繁育技术领域。

背景技术

枫香（Liquidambar formosana Hance）是金缕梅科枫香树属的树种。落叶大乔木，高达40m，最大胸径达lm以上。树干通直；多分枝，树冠圆锥形。原产我国，以长江流域以南为中心，东至台湾、西至云南、南达海南、北到河南。在海南以五指山为最常见。枫香树在我国南方低山、丘陵地区营造风景林很合适，在湿润肥沃土壤中大树参天十分壮丽。亦可在园林中栽作庭荫树，秋季日夜温差变大后叶变红、紫、橙红等，增添园中秋色。可于草地孤植、丛植，或于山坡、池畔与其他树木混植。倘与常绿树丛配合种植，秋季红绿相衬，会显得格外美丽。又因枫香具有较强的耐火性和对有毒气体的抗性，可用于厂矿区绿化。园林中为良好庇荫树种，尤其南方的秋景主要为枫香树的红叶，也有充作行道树的

随着人们环保意识和商品林建设能力的提高，大规模造林绿化广泛开展，近些年来枫香人工林开始大量发展，枫香良种苗木用量逐年递增，苗木市场前景广阔。

以往枫香苗木培育技术主要有二种，一是种子培育，即在种子成熟期，从枫香上采摘果实，把果实经地过去皮处理，得到种子，然后通过对种子适当的处理进步播种催芽培育苗木；其二是扦插繁育，即从枫香上采摘半木质化的穗条，用激素处理穗条后，把穗条插入适当的基质中培育苗木。

枫香苗木的培育主要依靠种子繁育实生苗。但种子繁育苗木存在如下缺点，一是种子育苗季节性强，一年一茬，种子长期保存困难，1年之后发芽率大幅下降；二是经科学选育的良种一般种子都很少，难以满足生产应用的需求，而营建种子园投资大，周期长；三是种子培育苗木不能培育无性系，生产上林份分化大，林相参差不齐，对经过选择表现优良的单株，无法实现规模利用。

枫香扦插繁育的缺点是，一是老树穗条成活率低，因此需要营建扦插用的采穗圃，经过修剪矮化，培育合适的冠形，多产穗条。采穗圃需要精细化管理，必须投入大量的人工，在劳动力成本日渐高涨的今日，采穗圃管理成本难以承受；二是采穗母株容易老化，使用周期不长，3-5年后即要淘汰；三是扦插成活率受天气、管理、基质、生根素等诸多因素的影响，往往成活率难以保证；四是苗木价格偏高，市场难以接受。

随着组培技术的发展，研究人员都试图用组培技术对枫香进行繁育研究，研究人员以常规组培技术作参照，发现枫香在组织培养中存在以下几方面的问题：一是组培芽增殖时，褐化现象严重，芽尖坏死，甚至枯褐而死；二枫香组培苗移栽成活率低，苗期培育周期长，所以研究开发新的组培技术对枫香的繁育有重要的意义。

发明内容

本发明的目的是克服现有种子繁育和扦插繁育技术的不足，提供一种枫香无性系组培繁育方法，该方法克服了枫香种子繁育受季节影响、种子发芽率低，繁殖速率慢的缺点，同时克服了扦插苗繁育的缺点，实现了枫香良种大规模繁育。

为实现上述发明的目的，本发明采取的技术方案如下：

枫香无性系组培繁育方法，包括如下步骤：

　　外植体→芽有诱导→芽的增殖→生根诱导→生根苗的炼苗→组培苗的移栽，具体方法如下：

（1）外植体材料的消毒：取当年生嫩梢去掉叶片，切段，使每段为带有1~2个腋芽的茎段，茎段先用0.2%灭菌净在超声波清洗仪中处理20～30min，无菌水清洗6次，再用0.1%升汞，2～5滴吐温80，处理3～5min，无菌水清洗6次后备用；消毒成功率在60%以上(见表1)。

表1　外植体材料的消毒试验

试验序号	接种芽数	无菌活体数	成功率（%）
				1	120	76	63.33
2	95	57	60.0
				3	63	44	69.84

（2）芽的诱导：把步骤（1）经消毒的茎段，接种到芽的诱导培养基上，经过6～15d的培养，在腋芽处开始萌动，并长出新芽，所述的诱导培养基为DCR_改＋6-BA 0.5mg+NAA 0.05～0.5 mg；芽的诱导率最高达70%(见表2)。

表2　芽的诱导率的消毒试验

试验序号	无菌活体数	萌芽数	诱导率（%）
				1	76	53	69.74
2	57	38	66.67
				3	44	31	70.45

（3）芽的增殖：将步骤（2）长出的新芽培养30d后，切割下来，接到继代增殖培养基上培养，在增殖培养基上培养6～15d，形成丛生芽，所述的增殖培养基为DCR_改＋6-BA 0.1～0.8 mg＋ KT 0.1～0.8 mg +IBA 0.5～0.3 mg +IAA 0.05～0.3 mg；芽的增殖系数最高达5.2(见表3)。

表3　不同激素不同水平组合正交L₉（3⁴）试验芽增殖结果分析

（4）生根诱导：步骤（3）的丛生芽的单芽长到1.5～2cm左右长时，选取叶片展开的单芽，分割下来接到生根培养基中诱导生根，在生根培养基中培养7～10d，茎基部诱导出根，所述的生根培养基为1/2MS _改+IBA 1.5～2.5 mg +IAA 1.5～2.5 mg +＋6-BA 0～0.5mg＋ NAA 0.05～0.5mg；生根率最高为98%(见表4)。

表4　不同激素不同水平组合正交L₉（3⁴）试验生根结果分析

注：T是各因素各水平之和，各因素各水平的平均数，R是各因素各水平平均数的极差。

（5）生根苗的炼苗：经过生根诱导，当苗诱导生根后，将瓶苗置于有70%遮荫的大棚中炼苗30～40d后，苗高3cm以上，可进行移栽；

（6）组培苗的移栽与管理：将步骤（5）进行炼苗的枫香苗移栽，移栽分二步，第一步采用穴盘容器育苗，将生根苗移栽到消毒的基质上，移栽25d后，施叶面肥2次，2次需相隔1周，以后每周喷0.2%复合肥一次；第二步采用营养袋育苗；在第一步进行的35～50d后，枫香组培苗长至苗高4～6cm以上时，将小苗移栽到以黄心土为基质，并用0.1%高锰酸钾溶液消毒的营养袋上；各步骤移植时，把根放进预先打好的小孔中，使根系舒展，充分压实，使根土密接，要防止栽植过深、窝根或露根，移栽后浇透水；栽植后用塑料薄膜作小拱状盖好小苗保湿，遮荫60-80%；为防止病害，移苗后当天喷防病药剂800－1000倍菌毒清液或多菌灵一次，以后每周喷药剂一次，3d后逐渐打开的塑料薄膜，15天后全部打开，待小苗长出新叶时方可开始薄施肥，1个月后，可进行正常的水肥管理。采用这种移栽管理办法的移栽成活率最高可达90%以上(见表5)。

表5　移栽试验

试验序号	种植株数	成活株数	成活率（%）
				1	500	362	72.40
2	2000	1898	94.90
				3	10000	9016	90.16

步骤（6）第一步所述基质为珍珠岩和泥炭土按1:3的比例配制而成的混合基质。

步骤（6）第一步所述的消毒是采用0.1%高锰酸钾溶液消毒。

所述的诱导培养和增殖培养的培养基均添加蔗糖40g/L，生根阶段的培养基添加蔗糖20g/L，全部培养基均添加卡拉胶0.6～0.7%，pH值为5.8。

培养室的培养条件：培养条件25～30℃，每天光照12～16h，光照度为1500～3000lx。

本发明所采用的基本培养基DCR_改和MS _改的配方如表6：

　表6 基本培养基配方表

本发明的有益效果是：

1.本方法具有种苗繁殖快，种苗繁殖不受季节的影响，一年四季都可培育苗木；同时解决了科学研究选育的良种应用的问题，以往良种生产单纯依赖建设种子园的方法，采用该方法节约了土地、经费以及解决了种子园投产周期长的问题。

2. 本方法不需要营建扦插用的采穗圃，节约了土地，同时不必投入大量的人工，节省了成本，而且繁育种苗不受天气等自然因素的影响，成活率比较搞，苗木的价格合适，推广应用前景好。

3.采用该方法，良种大规模通过组培扩繁，并推广造林，其木材的经济收入相应也大幅度提高，同时发挥更好的生态和社会效益。

4. 采用该方法能有效防止褐化现象，有效增殖率高，生根苗生长整齐，培养周期短，组培苗移栽成活率高，苗期培育周期短，该项技术有着非常重要的意义。

具体实施方式

下面通过实例对本发明做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本发明，并不限制本发明的范围。

实施例1

枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）外植体材料的消毒：取当年生嫩梢去掉叶片，切段，使每段为带有1~2个腋芽的茎段，茎段先用0.2%灭菌净在超声波清洗仪中处理20min，无菌水清洗6次，再用0.1%升汞，2～5滴吐温80，处理3min，无菌水清洗6次后备用；

（2）芽的诱导：把步骤（1）经消毒的茎段，接种到芽的诱导培养基上，经过6d的培养，在腋芽处开始萌动，并长出新芽，所述的诱导培养基为DCR_改＋6-BA 0.5mg+NAA 0.05 mg；

（3）芽的增殖：将步骤（2）长出的新芽培养30d后，切割下来，接到继代增殖培养基上培养，在增殖培养基上培养6d，形成丛生芽，所述的增殖培养基为DCR_改＋6-BA 0.1 mg ＋KT 0.1 mg +IBA 0.5mg +IAA 0.05 mg；

（4）生根诱导：步骤（3）的丛生芽的单芽长到1.5～2cm左右长时，选取叶片展开的单芽，分割下来接到生根培养基中诱导生根，在生根培养基中培养7d，茎基部诱导出根，所述的生根培养基为1/2MS _改+IBA 1.5 mg +IAA 1.5 mg + NAA 0.05mg；

（5）生根苗的炼苗：经过生根诱导，当苗诱导生根后，将瓶苗置于有70%遮荫的大棚中炼苗30d后，苗高3cm以上，可进行移栽；

（6）组培苗的移栽与管理：将步骤（5）进行炼苗的枫香苗移栽，移栽分二步，第一步采用穴盘容器育苗，将生根苗移栽到消毒的基质上，移栽25d后，施叶面肥2次，2次需相隔1周，以后每周喷0.2%复合肥一次；第二步采用营养袋育苗；在第一步进行的35d后，枫香组培苗长至苗高4～6cm以上时，将小苗移栽到以黄心土为基质，并用0.1%高锰酸钾溶液消毒的营养袋上；各步骤移植时，把根放进预先打好的小孔中，使根系舒展，充分压实，使根土密接，要防止栽植过深、窝根或露根，移栽后浇透水；栽植后用塑料薄膜作小拱状盖好小苗保湿，遮荫60-80%；为防止病害，移苗后当天喷防病药剂800倍菌毒清液或多菌灵一次，以后每周喷药剂一次，3d后逐渐打开的塑料薄膜，15天后全部打开，待小苗长出新叶时方可开始薄施肥，1个月后，可进行正常的水肥管理。

实施例2

枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）外植体材料的消毒：取当年生嫩梢去掉叶片，切段，使每段为带有1~2个腋芽的茎段，茎段先用0.2%灭菌净在超声波清洗仪中处理30min，无菌水清洗6次，再用0.1%升汞，2～5滴吐温80，处理5min，无菌水清洗6次后备用；

（2）芽的诱导：把步骤（1）经消毒的茎段，接种到芽的诱导培养基上，经过15d的培养，在腋芽处开始萌动，并长出新芽，所述的诱导培养基为DCR_改＋6-BA 0.5mg+NAA 0.5 mg；

（3）芽的增殖：将步骤（2）长出的新芽培养30d后，切割下来，接到继代增殖培养基上培养，在增殖培养基上培养15d，形成丛生芽，所述的增殖培养基为DCR_改＋6-BA0.8 mg ＋KT0.8 mg +IBA0.3 mg +IAA 0.3 mg；

（4）生根诱导：步骤（3）的丛生芽的单芽长到1.5～2cm左右长时，选取叶片展开的单芽，分割下来接到生根培养基中诱导生根，在生根培养基中培养10d，茎基部诱导出根，所述的生根培养基为1/2MS _改+IBA 2.5 mg +IAA 2.5 mg ＋6-BA0.5mg＋ NAA 0.5mg；

（5）生根苗的炼苗：经过生根诱导，当苗诱导生根后，将瓶苗置于有70%遮荫的大棚中炼苗40d后，苗高3cm以上，可进行移栽；

（6）组培苗的移栽与管理：将步骤（5）进行炼苗的枫香苗移栽，移栽分二步，第一步采用穴盘容器育苗，将生根苗移栽到消毒的基质上，移栽25d后，施叶面肥2次，2次需相隔1周，以后每周喷施0.2%复合肥一次；第二步采用营养袋育苗；在第一步进行的50d后，枫香组培苗长至苗高4～6cm以上时，将小苗移栽到以黄心土为基质，并用0.1%高锰酸钾溶液消毒的营养袋上；各步骤移植时，把根放进预先打好的小孔中，使根系舒展，充分压实，使根土密接，要防止栽植过深、窝根或露根，移栽后浇透水；栽植后用塑料薄膜作小拱状盖好小苗保湿，遮荫60-80%；为防止病害，移苗后当天喷防病药剂1000倍菌毒清液或多菌灵一次，以后每周喷药剂一次，3d后逐渐打开的塑料薄膜，15天后全部打开，待小苗长出新叶时方可开始薄施肥，1个月后，可进行正常的水肥管理。

实施例3

枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）外植体材料的准备：取当年生嫩梢去掉叶片，切段，使每段为带有1~2个腋芽的茎段，茎段先用0.2%灭菌净在超声波清洗仪中处理25min，无菌水清洗6次，再用0.1%升汞，2～5滴吐温80，处理4min，无菌水清洗6次后备用；

（2）芽的诱导：把步骤（1）经消毒的茎段，接种到芽的诱导培养基上，经过10d的培养，在腋芽处开始萌动，并长出新芽，所述的诱导培养基为DCR_改＋6-BA 0.5mg+NAA 0.25mg；

（3）芽的增殖：将步骤（2）长出的新芽培养30d后，切割下来，接到继代增殖培养基上培养，在增殖培养基上培养10d，形成丛生芽，所述的增殖培养基为DCR_改＋6-BA 0.4mg ＋KT 0.4 mg +IBA0.4 mg +IAA 0.15 mg；

（4）生根诱导：步骤（3）的丛生芽的单芽长到1.5～2cm左右长时，选取叶片展开的单芽，分割下来接到生根培养基中诱导生根，在生根培养基中培养8d，茎基部诱导出根，所述的生根培养基为1/2MS _改+IBA 2.0mg +IAA 2.0 mg +＋6-BA0.25mg＋ NAA 0.25mg；

（5）生根苗的炼苗：经过生根诱导，当苗诱导生根后，将瓶苗置于有70%遮荫的大棚中炼苗35d后，苗高3cm以上，可进行移栽；

（6）组培苗的移栽与管理：将步骤（5）进行炼苗的枫香苗移栽，移栽分二步，第一步采用穴盘容器育苗，将生根苗移栽到消毒的基质上，移栽25d后，施叶面肥2次，2次需相隔1周，以后每周喷施0.2%复合肥一次；第二步采用营养袋育苗；在第一步进行的40d后，枫香组培苗长至苗高4～6cm以上时，将小苗移栽到以黄心土为基质，并用0.1%高锰酸钾溶液消毒的营养袋上；各步骤移植时，把根放进预先打好的小孔中，使根系舒展，充分压实，使根土密接，要防止栽植过深、窝根或露根，移栽后浇透水；栽植后用塑料薄膜作小拱状盖好小苗保湿，遮荫60-80%；为防止病害，移苗后当天喷防病药剂900倍菌毒清液或多菌灵一次，以后每周喷药剂一次，3d后逐渐打开的塑料薄膜，15天后全部打开，待小苗长出新叶时方可开始薄施肥，1个月后，可进行正常的水肥管理。

Claims

1.枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）外植体材料的消毒：取当年生嫩梢去掉叶片，切段，使每段为带有1~2个腋芽的茎段，茎段先用0.2%灭菌净在超声波清洗仪中处理20～30min，无菌水清洗6次，再用0.1%升汞，2～5滴吐温80，处理3～5min，无菌水清洗6次后备用；（2）芽的诱导：把步骤（1）经消毒的茎段，接种到芽的诱导培养基上，经过6～15d的培养，在腋芽处开始萌动，并长出新芽，所述的诱导培养基为DCR_改＋6-BA 0.5mg+NAA 0.05～0.5 mg；（3）芽的增殖：将步骤（2）长出的新芽培养30d后，切割下来，接到继代增殖培养基上培养，在继代增殖培养基上培养6～15d，形成丛生芽，所述的继代增殖培养基为DCR_改＋6-BA 0.1～0.8 mg＋ KT 0.1～0.8 mg +IBA 0.5～0.3 mg +IAA 0.05～0.3 mg；（4）生根诱导：步骤（3）的丛生芽的单芽长到1.5～2cm长时，选取叶片展开的单芽，分割下来接到生根培养基中诱导生根，在生根培养基中培养7～10d，茎基部诱导出根，所述的生根培养基为1/2MS _改+IBA 1.5～2.5 mg +IAA 1.5～2.5 mg +6-BA 0～0.5mg＋ NAA 0.05～0.5mg；

（5）生根苗的炼苗：经过生根诱导，当苗诱导生根后，将瓶苗置于有70%遮荫的大棚中炼苗30～40d后，苗高3cm以上，进行移栽；

（6）组培苗的移栽与管理：将步骤（5）进行炼苗的枫香苗移栽，移栽分二步，第一步采用穴盘容器育苗，将生根苗移栽到消毒的基质上，移栽25d后，施叶面肥2次，2次需相隔1周，以后每周喷0.2%复合肥一次；第二步采用营养袋育苗；在第一步进行的35～50d后，枫香组培苗长至苗高4～6cm时，将小苗移栽到以黄心土为基质，并用0.1%高锰酸钾溶液消毒的营养袋上；各步骤移植时，把根放进预先打好的小孔中，使根系舒展，充分压实，使根土密接，要防止栽植过深、窝根或露根，移栽后浇透水；栽植后用塑料薄膜作小拱状盖好小苗保湿，遮荫60-80%；为防止病害，移苗后当天喷防病药剂800－1000倍菌毒清液或多菌灵一次，以后每周喷药剂一次，3d后逐渐打开塑料薄膜，15天后全部打开，待小苗长出新叶时方开始薄施肥，1个月后，进行正常的水肥管理；

所述的DCR_改培养基的组成及其含量为：NH₄NO₃ 600 mg/L、KNO₃ 510 mg/L、KH₂PO₄ 285 mg/L、CaCl₂·2H₂O 787 mg/L、MgSO₄·7H₂O 555 mg/L 、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L 、Na₂-EDTA 37.3 mg/L 、MnSO₄·4H₂O 22.3 mg/L 、ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L 、H₃BO₄ 6.2 mg/L 、KI 0.83 mg/L 、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L 、CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L 、CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L 、肌醇 200 mg/L 、甘氨酸 2 mg/L 、VB₁ 0.1 mg/L 、VB₆ 0.5 mg/L 、VC 2 mg/L 、VB₃ 0.5 mg/L 、L-半胱氨酸5mg/L 、PVPK30 500 mg/L 、糖 40000 mg/L ；

所述的MS _改培养基的组成及其含量为：NH₄NO₃ 1650 mg/L、KNO₃ 1900mg/L、KH₂PO₄ 179 mg/L、CaCl₂·2H₂O 440mg/L、MgSO₄·7H₂O 370 mg/L 、FeSO₄·7H₂O 27.8 mg/L 、Na₂-EDTA 37.3 mg/L 、MnSO₄·4H₂O 22.3 mg/L 、ZnSO₄·7H₂O 8.6 mg/L 、H₃BO₄ 6.2 mg/L 、KI 0.83 mg/L 、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25 mg/L 、CuSO₄·5H₂O 0.025 mg/L 、CoCl₂·6H₂O 0.025 mg/L 、肌醇 100 mg/L 、甘氨酸 2 mg/L 、VB₁ 0.1 mg/L 、VB₆ 0.5 mg/L 、VC 2 mg/L 、VB₃ 0.5 mg/L 、L-半胱氨酸5mg/L 、PVPK30 100 mg/L 、糖 20000 mg/L 。

2.根据权利要求1所述的枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：步骤（6）第一步所述基质为珍珠岩和泥炭土按1:3配比混合而成的基质。

3.根据权利要求1所述的枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：步骤（6）第一步所述的消毒是采用0.1%高锰酸钾溶液消毒。

4.根据权利要求1所述的枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：诱导培养基和继代增殖培养基均添加蔗糖40g/L，生根培养基添加蔗糖20g/L，全部培养基均添加卡拉胶0.6～0.7%，pH值为5.8。

5.根据权利要求1所述的枫香无性系组培繁育方法，其特征在于：培养室的培养条件：培养温度25～30℃，每天光照12～16h，光照度为1500～3000lx。