CN102805032B - 防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，通过对新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段进行接种前冷藏保存处理、酒精和升汞消毒灭菌，利用组织培养中后期组合培养并不断进行转瓶处理从而有效防止甚至消除黄藤褐化，降低了褐化率并在一定程度上提高其诱导率，促进植物的生长，保证了黄藤种苗的快速繁育，从而有效地保障黄藤种苗的供应，为黄藤产业化发展提供支持。

Description

防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法
技术领域
本发明涉及植物组织培养方法，尤其是一种防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法。 
背景技术
黄藤为防己科天仙藤属植物天仙藤（Fibraurea recisa Pierre）的藤茎，别名藤黄连、土黄连，收载于2005年版的《中华人民共和国药典》中。黄藤主要分布在我国的广西和云南等地，此外在越南、缅甸等国也有分布。黄藤不但具有清热解毒、利尿的功效，而且还有预防流脑和降血压等作用，主治妇科炎症、外科感染、菌痢、肠炎、呼吸道感染及眼结膜炎等症，是黄藤素栓、黄藤素注射剂、黄藤素和黄藤素片等中成药的主要原料。随着新药黄藤素栓等的开发，黄藤资源需求量日益增加，导致野生资源遭到毁灭性破坏。由于资源短缺，黄藤收购量逐年下降，部分制药企业被迫停止生产。因此，开展黄藤人工栽培已成当务之急，首先必须先解决种苗供应问题。 
目前，国内外研究黄藤主要集中在化学成分和药理方面，而对其种苗繁育技术报道甚少。由于黄藤种子具有二次结实的特性，采集时间性要求很强，因而收集种子困难，用种子繁殖难以满足生产需要。虽然也有扦插繁殖的研究报道，但效果不很理想，生根时间较长，且生根成活率较低，这在一定程度上限制了该树种在我国的发展。组织培养是唯一不受季节等外在因素限制可快速繁殖种苗的方法，然而，褐化污染等原因会严重影响黄藤组培苗的生长发育，亟待解决。 
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，以解决黄藤种苗繁育难的现状，实现黄藤的快速繁育，为生产提供大量优质种苗。 
为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，包括以下步骤： 
<1>将5～6月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存2～3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上； 
<3>步骤<2>接种的茎段先进行暗培养，暗培养3d后转为光培养，一周后转入液体培养基；液体培养基培养1～3d后再转入固体培养基，固体培养基培养1～3d后再转入液体培养基，依法每1～3d进行液、固体培养基转瓶一次，持续时间27～30d。 
初代培养基或固体培养基以MS培养基为基础，含有下列浓度的物质：BA 2.0mg.L-1、NAA 0.1mg.L-1、100mg/L Vc、0.7％琼脂、3％蔗糖； 
液体培养基以MS培养基为基础，含有下列浓度的物质：BA 2.0mg.L-1、NAA 0.1mg.L-1、100mg/L Vc、3％蔗糖。 
酒精为体积浓度70％的乙醇水溶液，升汞为质量浓度0.1％的氯化汞水溶液。 
在黄藤组织培养中防褐化研究中，发明人建立了本发明的防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，通过对新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段进行接种前冷藏保存处理，保证了黄藤茎段的诱导率且降低其污染率及褐化率；通过酒精和升汞消毒灭菌，降低了初代培养的污染率及褐化率并保证其诱导率；利用组织培养中后期组合培养并不断进行转瓶处理（即先暗培养再转入光培养的方式并采用固液交替培养方式，转瓶周期不超过3d）从而有效防止甚至消除黄藤褐化，降低了褐化率并在一定程度上提高其诱导率，促进植物的生长，保证了黄藤种苗的快速繁育，从而有效地保障黄藤种苗的供应。 
具体实施方式
以下实施例和对照例所用试剂材料如下： 
初代培养基或固体培养基：MS+BA（6-苄氨基腺嘌呤）2.0mg.L-1+NAA（奈乙酸）0.1mg.L-1+100mg/L Vc（抗坏血酸）+0.7％琼脂+3％蔗糖。 
液体培养基：MS+BA 2.0mg.L-1+NAA 0.1mg.L-1+100mg/L Vc+3％蔗糖。 
酒精：体积浓度70％的乙醇水溶液。 
升汞：质量浓度0.1％的氯化汞水溶液。 
实施例1（3天转瓶） 
<1>将5月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上； 
<3>步骤<2>接种的茎段先进行暗培养，暗培养3d后转为光培养，一周后转入液体培养基；液体培养基培养3d后再转入固体培养基，固体培养基培养3d后再转入液体培养基，依法每3d进行液、固体培养基转瓶一次，持续时间为27d。 
实施例2（2天转瓶） 
<1>将6月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存2d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上； 
<3>步骤<2>接种的茎段先进行暗培养，暗培养3d后转为光培养，一周后转入液体培养基；液体培养基培养2d后再转入固体培养基，固体培养基培养2d后再转入液体培养基，依法每2d进行液、固体培养基转瓶一次，持续时间为28d。 
实施例3（7天转瓶） 
<1>将5月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上； 
<3>步骤<2>接种的茎段先进行暗培养，暗培养3d后转为光培养，一周后转入液体培养基；液体培养基培养7d后再转入固体培养基，固体培养基培养7d后再转入液体培养基，依法每7d进行液、固体培养基转瓶一次，持续时间为28d。 
对照例1（多次转移法） 
<1>将5月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上； 
<3>步骤<2>接种的茎段先进行暗培养，暗培养3d后转为光培养，一周后转入同样的固体培养基内；新的固体培养基培养3d后再转入相同的固体培养基，依法每3d进行固体培养基转瓶一次，持续27d。 
对照例2（光暗培养法） 
<1>将5月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上； 
<3>步骤<2>接种的茎段先进行光培养，光培养3d后转为暗培养，培养基不改变，不进行转瓶，3d后再转入光培养环境，依法每3d进行光、暗培养转换一次，持续27d。 
对照例3（纸桥培养法） 
<1>将5月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后用酒杯状的滤纸代替琼脂，使杯底朝上塞入试管中，将外植体置于滤纸上方接种到液体培养基上进行培养，不再进行更换培养基。 
对照例4（单独培养法） 
<1>将5月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存3d； 
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上，不再进行转瓶，一个月后观察结果。 
以上实施例及对照例每组处理30株，经过约1个月培养，观察记录黄藤植株诱导率及褐化率，结果如表1。 
表1  不同后培养方式对黄藤褐化率及生长的影响。 
Figure BDA00002031402200041

Claims (3)

1.一种防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，其特征在于包括以下步骤：
<1>将5～6月收集的新鲜黄藤幼嫩带顶芽茎段在冰箱冷藏保存2～3d；
<2>步骤<1>处理后的带顶芽茎段先用酒精消毒，再用升汞处理10min，然后接种到初代培养基上；
<3>步骤<2>接种的茎段先进行暗培养，暗培养3d后转为光培养，一周后转入液体培养基；液体培养基培养1～3d后再转入固体培养基，固体培养基培养1～3d后再转入液体培养基，依法每1～3d进行液、固体培养基转瓶一次，持续时间27～30d。
2.根据权利要求1所述的防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，其特征在于：
所述初代培养基或固体培养基以MS培养基为基础，含有下列浓度的物质：BA 2.0mg.L-1、NAA 0.1mg.L-1、100mg/L Vc、0.7％琼脂、3％蔗糖；
所述液体培养基以MS培养基为基础，含有下列浓度的物质：BA 2.0mg.L-1、NAA 0.1mg.L-1、100mg/L Vc、3％蔗糖。
3.根据权利要求2所述的防止黄藤愈伤组织褐化现象产生的方法，其特征在于：所述酒精为体积浓度70％的乙醇水溶液，所述升汞为质量浓度0.1％的氯化汞水溶液。
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