CN102994444B - 一种金钱松细胞的悬浮培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种金钱松细胞的悬浮培养方法，该方法包括如下步骤：愈伤组织的诱导培养→细胞的预培养→细胞的悬浮培养→细胞的继代培养。本发明通过采用对金钱松的愈伤组织进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的金钱松细胞培养物。

Description

一种金钱松细胞的悬浮培养方法
技术领域
本发明涉及一种金钱松的组织培养方法，特别是涉及一种金钱松细胞的悬浮培养方法。
背景技术
金钱松是我国特有的古老孑遗松科树种。根据世界保护联盟(IUCN)新制定的物种受威胁的分类系统标准和中国植物红皮书的标准，金钱松被定为渐危种，并被列为国家二级保护植物。
金钱松既是重要的园林植物，同时更是一种重要的、应用前景广阔的药用植物。研究发现，金钱松最主要的药用成分是从其树皮和根皮中提取出来的二萜类化合物土槿酸，它具有抗肿瘤、抗真菌、抗早孕和使胆囊自截等功效，尤其是抗肿瘤的功效使得金钱松的药用价值更加凸显。现代药理研究发现，土槿酸及其衍生物能作用于多种癌细胞如胃癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞、乳腺癌细胞、卵巢癌细胞等，并具有明显的量效关系。
目前金钱松人工种植主要采用有性繁殖和无性繁殖两种方式。有性繁殖即种子繁殖，由于金钱松存在结实率低、结实间隔期较长（一般3～5年结实）、采种条件苛刻（采种母树年龄以100年左右为最好）、种子成活率低（仅为60%-70%）、以及种子需低温保存等因素的限制，因此目前还不可能通过有性繁殖大量种植金钱松。无性繁殖即扦插繁殖，金钱松为菌根性树种，宜在海拔500m左右的山地建立永久性育苗基地或在土内有菌的林间育苗，植物生长周期长，并易受金钱松小卷蛾的严重危害，这些因素限制了金钱松的大量无性繁殖。由于人工种植金钱松存在上述问题，因此目前迫切需要利用组织培养技术来大量生产有效成分含量高的金钱松培养物，以满足人们对金钱松的需要。
目前金钱松的研究主要集中在对金钱松有效成分的提取及其内生真菌的筛选方面，极少有金钱松在植物生物技术方面研究的报道。已有的金钱松在植物生物技术方面的研究，如：王跃华等人发明的“一种以金钱松叶原基为外植体的愈伤组织培养方法”（专利申请号：201210104866.8），也只对金钱松愈伤组织的培养进行了研究。目前还未见任何有关金钱松细胞在悬浮培养方面的研究报道。
发明内容
本发明的目的是针对目前金钱松资源紧缺以及现有传统栽培方法存在周期长、难度大的问题而提供一种金钱松细胞的悬浮培养方法，该方法可实现在短时间内快速生产出有效成分含量高的金钱松细胞培养物，以缓解当前金钱松植物资源紧缺的问题。
为达到上述目的，本发明采用的解决方案由如下步骤构成：
（1）愈伤组织的诱导培养：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽进行消毒处理，再将已消毒的芽接入固体培养基MS+6-BA1.0～2.0 mg·L-1+NAA0.5～4.0 mg·L-1 +蔗糖20～50 g·L-1 +琼脂5.0～7.0 g·L-1中进行培养，培养温度10～30 °C、pH值为5.6～6.5、每天光照4～16小时、光照强度为1000～2000 lx；
（2）细胞的预培养：将步骤（1）中获得的愈伤组织转接入液体培养基MS+6-BA0.5～1.5 mg·L-1+2、4-D 1.0～4.0 mg·L-1+KT 0～2.0mg·L-1+蔗糖20～50 g·L-1 中进行5～8天的预培养；
（3）细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的金钱松单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50 g·L-1的接种量转接到B5+6-BA0.1～1.0 mg·L-1+2、4-D 2.0～5.0 mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50 g·L-1的液体培养基中进行细胞的悬浮培养；
（4）细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了30天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；
（5）细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10 min后，倒掉上清液进行称重，即为鲜重；
细胞增殖倍数=（收获量鲜重—接种量鲜重）/接种量鲜重；
细胞的生长速率（即每升培养液中每天生长量）=（收获鲜重—接种量鲜重）/培养天数。
上述（2）、（3）、（4）步骤中金钱松细胞的液体培养条件均为温度15～28°C，pH值4.0~7.0，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500 lx，摇床转速为110～140r·min-1。
上述步骤（1）中所述消毒处理是指将芽鳞片先用浓度为70%的酒精消毒10~50s，再用浓度为0.1 %~0.15 %的升汞消毒3~5 min，最后用无菌水冲洗2~5次。
本发明通过采用对金钱松的愈伤组织进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的金钱松细胞培养物，从而可有效解决当前金钱松植物资源和药材资源短缺的问题。
具体实施方式
实施例1
（1）愈伤组织的诱导培养：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽放在超净工作台上，先用浓度为70%的酒精消毒40s，再用浓度为0.1 %的升汞消毒4 min，最后用无菌水冲洗4次，然后将已消毒的芽接入固体培养基MS+6-BA1.0mg·L-1+NAA2.0  mg·L-1 +蔗糖30 g·L-1 +琼脂6.0 g·L-1中进行培养，培养温度22 °C、pH值6、每天光照10小时、光照强度为1500 lx，培养25天后愈伤组织的诱导率为98.2%；
（2）细胞的预培养：将步骤（1）中获得的颜色为翠绿色的愈伤组织转接入液体培养基MS+6-BA1.0 mg·L-1+2、4-D 3.0 mg·L-1+KT 0.5mg·L-1+蔗糖25 g·L-1 中进行7天的预培养；
（3）细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部、颜色为翠绿色的金钱松单个细胞或疏松细胞小聚集体，以30 g·L-1的接种量转接到B5+6-BA0.5 mg·L-1+2、4-D 3.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+蔗糖25g·L-1的液体培养基中进行细胞的悬浮培养；
（4）细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了30天后进行第一次继代培养，以后每隔20天继代一次；
（5）细胞增殖生长计算：取继代培养3代的细胞在4000r/min的离心机上离心10 min后，倒掉上清液进行称重，计算出金钱松细胞的生物量增殖倍数为2.98倍，细胞的生长速率为3.97 g(d·L)-1；
上述（2）、（3）、（4）步骤中金钱松细胞的液体培养条件均为温度22°C，pH值6.0，每天光照8小时，光照强度为1200 lx，摇床转速为120r·min-1。
实施例2
将实施例1步骤（2）中的预培养基改为MS+6-BA 1.2 mg·L-1+2、4-D 2.0 mg·L-1+KT 1 mg·L-1+蔗糖30 g·L-1 ，其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为1.88倍，细胞的生长速率为2.14 g(d·L)-1。
实施例3
将实施例1步骤（2）中的预培养基改为MS+6-BA 1.0 mg·L-1+2、4-D 3.0 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1 ，其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为2.12倍，细胞的生长速率为2.61g(d·L)-1。
实施例4
将实施例1步骤（3）中的悬浮培养基改为B5+6-BA1. 0mg·L-1+2、4-D 2.0 mg·L-1+KT 0.1 mg·L-1+蔗糖35g·L-1其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为2.07倍，细胞的生长速率为1.87g(d·L)-1。
实施例5
将实施例1步骤（3）中金钱松细胞的接种量改为10 g·L-1，并将液体培养基改为B5+6-BA0.5mg·L-1+2、4-D 4.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1，其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为3.04倍,细胞的生长速率为1.29 g(d·L)-1。
实施例6
将实施例1步骤（3）中金钱松细胞的接种量改为50 g·L-1，并将液体培养基改为B5+6-BA0.5mg·L-1+2、4-D 4.0 mg·L-1+KT 0.5 mg·L-1+蔗糖25 g·L-1，其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为1.89倍，细胞的生长速率为3.91 g(d·L)-1。
比较实施例1
将实施例1步骤（2）（细胞的预培养）取消，其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为1.46倍,细胞的生长速率为1.03 g(d·L)-1。
比较实施例2
将实施例1步骤（3）改为选用处于悬浮培养液下部、颜色为绿黄色、质地较紧密的金钱松细胞团块进行细胞的悬浮培养，其它步骤同实施例1，继代培养3代的金钱松细胞生物量增殖倍数为1.56倍，细胞的生长速率为1.86 g(d·L)-1。

Claims (1)

1.一种金钱松细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)愈伤组织的诱导培养：选取落叶后生长健康、无病虫害的金钱松植株上的芽，剥去芽上的芽鳞片后将芽先用浓度为70％的酒精消毒10～50s，再用浓度为0.1％～0.15％的升汞消毒3～5min后用无菌水冲洗2～5次，然后将已消毒的芽接入固体培养基MS+6-BA1.0～2.0mg·L-1+NAA0.5～4.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1+琼脂5.0～7.0g·L-1中进行培养，培养温度10～30℃、pH值为5.6～6.5、每天光照4～16小时、光照强度为1000～2000lx；
(2)细胞的预培养：将步骤(1)中获得的愈伤组织转接入液体培养基MS+6-BA0.5～1.5mg·L-1+2、4-D 1.0～4.0mg·L-1+KT 0～2.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1中进行5～8天的预培养；
(3)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的金钱松单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g·L-1的接种量转接到B5+6-BA0.1～1.0mg·L-1+2、4-D 2.0～5.0mg·L-1+KT 0.1～1.0mg·L-1+蔗糖20～50g·L-1的液体培养基中进行细胞的悬浮培养；
(4)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了28～32天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；
上述(2)、(3)、(4)步骤中金钱松细胞的液体培养条件均为温度15～28℃，pH值4.0～7.0，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为110～140r·min-1。
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