CN104686329A - 一种杜仲组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种杜仲组织培养方法，涉及杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量杜仲优良品种苗木的方法。本发明以杜仲带芽茎段为外植体，经过芽诱导、芽增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等过程实现了杜仲的离体再生，为其大量选育、快速繁殖、新品种推广提供技术支持。
Description
技术领域
本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种杜仲组织培养方法。
背景技术
杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）是杜仲科杜仲属多生年落叶乔木，为我国特有植物，主要分布于滇、川、桂及长江中下游等省市。杜仲是一种具有多种药理功效的珍稀名贵药用植物，也是一种最为理想的人体抗衰老保健中药材。其干燥树皮可入药，具有补肾、健腰、强筋、壮骨、安胎、降压等功效，且久服轻身耐老、延年益寿，因此被称为中药之上品。除此之外，杜仲还是提取杜仲胶的原材料，杜仲胶是一种天然高分子胶，具有耐腐蚀性强、绝缘性能极佳、可塑性好、耐压强度高等特点。
杜仲野生资源已处于严重衰竭状态，已被列为国家二级保护植物。目前，杜仲种苗主要是采用种子播种法进行繁育，由于种子发芽率低下，远远不能满足大规模生产对杜仲种苗的需要。并且，种子繁殖后代之间在药效成分、杜仲胶含量等方面均存差异，不利于杜仲优良品种的推广。利用植物组织培养技术能有效解决濒危珍稀物种拯救和野生植物资源匮乏的问题。因此很有必要建立杜仲组织培养技术，为其大规模工厂化生产奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供出一种杜仲组织培养方法，本发明以杜仲带芽茎段为外植体，经过芽诱导、芽增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等过程实现了杜仲的离体再生，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种杜仲组织培养方法，包括以下的步骤：
（1）芽诱导培养：以华仲5号杜仲带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉溶液浸泡5～10min，再用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到芽诱导培养基进行芽诱导，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1500～2000lx条件下培养30天，统计其芽诱导率及生长情况。
（2）增殖培养：将步骤（1）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的芽体切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养30天后观察生长情况和芽增殖情况。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm、生长良好、无褐化、玻璃化和白化现象的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照11～12小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养1个月后统计生根情况。
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝3:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田。
上述步骤（1）所述的芽诱导培养基为：MS+1～5mg/L6-BA+0.5～2mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（2）所述的增殖培养基为：MS+0.1～1.0mg/LNAA+1～6mg/L 6-BA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
上述步骤（3）所述的生根培养基为：1/4MS+0.1～1mg/L NAA+0.1～1mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
与现有技术相比本发明的优点是：本发明通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量杜仲优良品种苗木的方法。以杜仲带芽茎段为外植体，经过芽诱导、芽增殖培养、生根培养、炼苗及移栽等过程实现了杜仲的离体再生，为其大量选育、快速繁殖、新品种推广提供技术支持。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
（1）芽诱导培养：以华仲5号杜仲带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉溶液浸泡5min，再用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒10min，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到芽诱导培养基进行芽诱导，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500lx条件下培养30天，统计其芽诱导率及生长情况，芽诱导率为87.0%。所述的芽诱导培养基为：MS+3mg/L6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.8。
（2）增殖培养：将步骤（1）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的芽体切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为28℃的条件下培养30天后观察生长情况和芽增殖情况。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽，新生芽体生长健壮，增殖系数为4.96。所述的增殖培养基为MS+0.5mg/LNAA+3mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm、生长良好、无褐化、玻璃化和白化现象的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照11小时，光照强度为2000lx，培养温度为28℃的条件下培养1个月后统计生根情况，生根率为91.5%。所述的生根培养基为：1/4MS+0.5mg/L NAA+0.2mg/L IBA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8。
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝3:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为88.6%。
实施例2：
（1）芽诱导培养：以华仲5号杜仲带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉溶液浸泡10min，再用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗2h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒15s后用无菌水洗5次，再用0.1%升汞溶液消毒15min，用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到芽诱导培养基进行芽诱导，接种后先在28℃条件下全暗培养3天，然后置于每天光照10小时，光照强度为1500lx条件下培养30天，统计其芽诱导率及生长情况，芽诱导率为83.7%。所述的芽诱导培养基为：MS+5mg/L6-BA+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.8。
（2）增殖培养：将步骤（1）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的芽体切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28℃条件下全暗培养1天，然后置于每天光照11小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为28℃的条件下培养30天后观察生长情况和芽增殖情况。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽，新生芽体生长健壮，增殖系数为5.19。所述的增殖培养基为MS+0.1mg/LNAA+4mg/L 6-BA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂，pH为5.8。
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm、生长良好、无褐化、玻璃化和白化现象的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28℃条件下全暗培养2天，然后置于每天光照11小时，光照强度为2500lx，培养温度为28℃的条件下培养1个月后统计生根情况，生根率为94.9%。所述的生根培养基为：1/4MS+0.8mg/L NAA+0.4mg/L IBA+15g/L蔗糖+3.0g/L琼脂，pH为5.8。
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝3:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田，移栽成活率为92.4%。
Claims (4)
1.一种杜仲组织培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）芽诱导培养：以华仲5号杜仲带芽茎段作为外植体，剪去叶片，切成3.0～5.0长的带有2～3个腋芽的节段先用洗衣粉溶液浸泡5～10min，再用毛刷刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗1～3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5～30s后用无菌水洗3～5次，再用0.1%升汞溶液消毒10～25min，用无菌水冲洗4～6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后接种到芽诱导培养基进行芽诱导，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1500～2000lx条件下培养30天，统计其芽诱导率及生长情况；
（2）增殖培养：将步骤（1）培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的芽体切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照10～12小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃的条件下培养30天后观察生长情况和芽增殖情况，多次反复切割芽体进行继代培养，得到丛生芽；
（3）生根培养：将步骤（1）或（2）过程获得的高度约为2.5～3.5cm、生长良好、无褐化、玻璃化和白化现象的不定芽分切接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25～28℃条件下全暗培养1～3天，然后置于每天光照11～12小时，光照强度为2000～3000lx，培养温度为25～28℃的条件下培养1个月后统计生根情况；
（4）炼苗移栽：将步骤（3）获得的高约6～8cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5～7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土：珍珠岩＝3:1混合成的基质,置于光照培养箱内培养，每天以1/2MS大量元素营养液给幼苗浇水，保持湿度，待幼苗成活后再移栽大田。
2.根据权利要求1所述的一种杜仲组织培养方法，其特征在于步骤（1）所述的芽诱导培养基为：MS+1～5mg/L6-BA+0.5～2mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种杜仲组织培养方法，其特征在于步骤（2）所述的增殖培养基为：MS+0.1～1.0mg/LNAA+1～6mg/L 6-BA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种杜仲组织培养方法，其特征在于步骤（3）所述的生根培养基为：1/4MS+0.1～1mg/L NAA+0.1～1mg/L IBA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
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