CN109863998B

CN109863998B - 一种蒙椴种苗的组织培养方法

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Publication number: CN109863998B
Application number: CN201910236138.4A
Authority: CN
Inventors: 赵泉胜; 铁英; 白玉娥; 彭鹏; 周晓炜; 冯建芳
Original assignee: Inner Mongolia Hesheng Ecological Technology Research Institute Co ltd; Mengshu Ecological Construction Group Co ltd
Current assignee: Inner Mongolia Hesheng Ecological Technology Research Institute Co ltd; Mengshu Ecological Construction Group Co ltd
Priority date: 2019-03-27
Filing date: 2019-03-27
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2039-03-27
Also published as: CN109863998A

Abstract

本发明提供了一种蒙椴种苗的组织培养方法，包括以下步骤：(1)取蒙椴种子进行灭菌处理；(2)将灭菌后的蒙椴种子去除种皮，接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；(3)将所述不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；(4)将所述继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。在本发明的实施例中，增殖期以3.8倍速率增殖，生根率为86％。该方法可一次性培养大量的蒙椴再生苗，解决种子休眠和实生苗生长缓慢的问题，避免了扦插方式而产生的病虫害传播。该方法可明显提高蒙椴繁育系数，缩短了繁育周期。

Description

一种蒙椴种苗的组织培养方法

技术领域

本发明涉及林木繁育技术领域，具体涉及一种蒙椴种苗的组织培养方法。

背景技术

蒙椴(Tilia mongolica)，为山地中生阳性树，在夏绿阔叶林的桦杨林或山地杂木林中为主要伴生树种，局部地段可成为优势种，形成小片椴树林。草原带的山地也有散生。该树种广泛分布于蒙古以及中国大陆的山西、河北、辽宁、内蒙古、河南等地，已由人工引种栽培。蒙椴木材轻软，可作家具、炊具用材；花可入药，种子榨油供工业用，树皮纤维可制绳。蒙椴是理想的生态经济型树种，对北方地区的水土保持及生态修复可以起到十分积极的作用。

蒙椴休眠性特别强，种子发芽率极低，且常规播种繁殖的苗木在幼年期生长缓慢，株高1米的幼苗通常需生长5～10年，导致育苗周期长、繁殖系数低。扦插繁殖也不易生根，易积累病虫害，而且对母树的数量要求以及树型的破坏性大，极大地制约了蒙椴的优良种苗的推广种植。

植物组织培养可以短时间内大量生产苗木，且其生产不受时间、季节、环境等因素的影响。随着技术的发展，组织培养的成本降低，繁殖数不断增加，对蒙椴在市场上的推广应用及新品种的选育有很大的推动作用。然而，目前没有针对蒙椴种苗的相应组织培养方法。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蒙椴种苗的组织培养方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：

本发明涉及一种蒙椴种苗的组织培养方法，包括以下步骤：

(1)取蒙椴种子进行灭菌处理；

(2)将灭菌后的蒙椴种子去除种皮，接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；

(3)将所述不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；

(4)将所述继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。

优选地，步骤(1)中，灭菌前对所述蒙椴种子进行以下操作：

[1]将蒙椴种子与细砂按1:3的重量比混合，揉搓至种子表面粗糙，将种子洗净后浸泡2～4d；

[2]将浸泡后的种子滤干，加入浓硫酸浸泡2～4min后取出洗净，并用水浸泡过夜，该步骤进行两次。

优选地，步骤(1)中，所述灭菌处理为将所述种子依次使用酒精溶液和次氯酸钠溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。

优选地，步骤(1)中，所述酒精溶液的体积分数为75％，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为2％。

优选地，步骤(2)中，所述诱导培养基是以WPM培养基为基础，并添加2,4-D、GA₃、蔗糖和琼脂得到，所述诱导培养基中2,4-D的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为1.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述诱导培养基的pH值为5.8～6.0。

优选地，步骤(2)中，所述诱导培养为将灭菌后的蒙椴种子剥除种皮后接种于诱导培养基中，在温度为25±2℃下暗培养15～25天，直至种子萌发；待幼苗高度为3～5cm时改为弱光培养，待高度为7～10cm时得到不定芽。

优选地，步骤(2)中，弱光培养的条件为光照强度1000～1500lx，光照时间为14h/d。

优选地，步骤(3)中，所述继代培养基是以WPM培养基为基础，并添加6-BA、IBA、GA₃、蔗糖和琼脂得到，所述继代培养基中6-BA的浓度为3.0mg/L，IBA的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为3.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述继代培养基的pH值为5.8～6.0。

优选地，步骤(3)中，所述继代培养为将所述不定芽接种于继代培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为16h/d的条件下进行培养，每隔30天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。

优选地，步骤(4)中，所述生根培养基是以WPM培养基为基础，并添加IBA、NAA、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述生根培养基的pH值为5.6～5.8。

优选地，步骤(4)中，所述生根培养为将所述继代苗接种于生根培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为16h/d的条件下，培养25～30天，得到生根苗。

优选地，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)：将所述生根苗洗净后，在基质中培养15～20天得到移栽苗。

优选地，所述基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为5：3：1。

本发明的有益效果：

本发明提供了一种蒙椴种苗的组织培养方法，该方法以蒙椴种子为外植体材料，将其接种到诱导培养基上培养，产生不定芽，经继代培养达到扩繁目的，再由生根培养阶段获得完整植株。在本发明的实施例中，增殖期以3.8倍速率增殖，生根率为86％。该方法可一次性培养大量的蒙椴再生苗，解决种子休眠和实生苗生长缓慢的问题，避免了扦插方式而产生的病虫害传播。该方法可明显提高蒙椴繁育系数，缩短了繁育周期。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

本发明实施例涉及一种蒙椴种苗的组织培养方法，该方法包括以下步骤：

(1)取蒙椴种子进行灭菌处理。

由于蒙椴种子属于强休眠的硬实种子，表现为种皮致密，不透水透气。如不去除种皮，无法使种子发芽，因此需要在灭菌前对种皮进行处理。在本发明的一个实施例中，灭菌前对蒙椴种子进行以下操作：

[1]将蒙椴种子与细砂按1:3的重量比混合，揉搓至种子表面粗糙，将种子洗净后浸泡2～4d。

其中，步骤[1]的作用是去除蒙椴种子表面的疏水层，增加种子的吸水能力，使得步骤[2]的浓硫酸腐蚀种皮过程易于进行，且保证种胚不受伤害。步骤[2]的作用是腐蚀种皮，使后续的剥除种皮过程易于进行。分两次使用质量浓度为98％以上的浓硫酸对种皮进行处理，可实现短时间分层腐蚀，不会伤害种胚。如省略这两个步骤，会使种皮剥离的难度大大增加。或者由于种皮坚硬，在剥除过程中会伤害种胚而不发芽。

在本发明的一个实施例中，灭菌处理为将种子依次使用酒精溶液和次氯酸钠溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。其中，次氯酸钠为更高级的灭菌剂，水解能够产生次氯酸，次氯酸再进一步分解形成新生态氧[O]，新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒的蛋白质变性，从而使病原微生物致死。酒精溶液的体积分数可以为75％，次氯酸钠溶液的质量浓度可以为2％。

在本发明的一个具体实施例中，步骤(1)包括：将细砂和浓硫酸处理后的种子，先用体积分数为75％酒精浸泡40～50s后，用无菌水清洗3～5次，再用质量浓度为2％次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水冲洗3次完成灭菌。

(2)灭菌完成后，将蒙椴种子去除种皮，接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽。

在本发明的一个实施例中，诱导培养基是以WPM培养基为基础，并添加2,4-D、GA₃、蔗糖和琼脂得到。诱导培养基中2,4-D的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为1.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且诱导培养基的pH值为5.8～6.0。

其中，WPM培养基为木本植物用培养基(Woody Plant medium)，主要含有K₂SO₄、NH₄NO₃、钙盐、铁盐、肌醇等物质，其配方和制备方法为现有技术。2,4-D为2,4-二氯苯氧乙酸，是一种植物生长剂。可用作植物生长调节，是用于诱导愈伤组织形成的常用的生长素类似物的一种。GA₃为赤霉素，为植物生长调节剂，主要用于促进作物的生长发育，提早成熟。

在本发明的一个实施例中，诱导培养的具体条件为：将灭菌后的蒙椴种子剥除种皮后接种于诱导培养基中，在温度为25±2℃下暗培养15～25天，直至种子萌发；待幼苗高度为3～5cm时改为弱光培养，待高度为7～10cm时得到不定芽。

在本发明的一个实施例中，弱光培养的具体条件为：光照强度1000～1500lx，光照时间为14h/d。

其中，将种子置于黑暗环境中进行培养，是为了促进种子的萌发。申请人发现，23～27℃的黑暗环境能够显著促进蒙椴种子进行生根，进而促进不定芽的生长发育，进而减少了培育的时间。但是，如果一直处于暗培养条件下，会导致幼苗生长不良。如暗培养完成后，先转入弱光培养，可以促进幼苗快速发芽并生长。然后增加光照强度，在自然光照下进行继代培养，可以使幼苗更加健壮。

(3)诱导培养完成后，将得到的不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗。

在本发明的一个实施例中，继代培养基是以WPM培养基为基础，并添加6-BA、IBA、GA₃、蔗糖和琼脂得到，继代培养基中6-BA的浓度为3.0mg/L，IBA的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为3.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。

其中，6-BA为苄氨基腺嘌呤，为人工合成的细胞分裂素，具有高效、稳定、廉价和易于使用等特点。6-BA的主要作用是促进芽的形成，也可以诱导愈伤组织发生。IBA为吲哚丁酸，对植物抽枝或芽、苗等的顶部芽端形成有促进作用，也可以将其替换为吲哚乙酸。

在本发明的一个实施例中，继代培养的具体条件为：将不定芽接种于继代培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为16h/d的条件下进行培养，每隔30天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗。

(4)继代培养完成后，将得到的继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗。

在本发明的一个实施例中，生根培养基是以WPM培养基为基础，并添加IBA、NAA、蔗糖和琼脂得到，生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且生根培养基的pH值为5.6～5.8。

其中，NAA为萘乙酸，是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。可用于植物组培过程中。

在本发明的一个实施例中，生根培养的具体条件为：将继代苗接种于生根培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500～3000Lx、光照时间为16h/d的条件下，培养25～30天，得到生根苗。

进一步地，步骤(4)结束后，还包括步骤(5)：将生根苗洗净残留培养基后，转移到基质中进行培养，在基质中培养15～20天得到移栽苗。期间使环境湿度保持在80％～90％，昼夜温度在15～20℃之间。移栽1周后逐渐降低湿度，共需要15～20天炼苗完成，得到移栽苗。

在本发明的一个实施例中，基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为5：3：1。蛭石是一种天然、无机，无毒的矿物质，透水性较好，能够有效地促进植物根系的生长和幼苗的稳定发育。长时间提供植物生长所必需的水分及营养，并能保持根阳光温度的稳定。蛭石可使作物从生长初期就能获得充足的水分及矿物质，促进植物较快生长，增加产量。由于移栽后的生根苗会高速生长，所以需要基质中含有较多的养分，因此基质中还要加入草炭。珍珠岩是珍珠岩矿砂经预热，瞬时高温焙烧膨胀后制成的一种内部为蜂窝状结构的白色颗粒状的材料,具有多孔结构。产品的多孔性极大促进了植物的须根系生长和发育，对树木有着极好的固定作用。

本发明提供的方法有效解决了蒙椴种子在组织培养过程中休眠的问题，能够实现增殖期以3.8倍速率增殖，生根阶段的生根率为86％。

实施例1-1

(1)将蒙椴种子与细砂按1:3的重量比混合，并轻轻揉搓至种子表面粗糙。分离种子与细砂，将种子以清水洗净，置于杯中，用蒸馏水浸泡3d。

(2)将经步骤(1)浸泡后的种子滤干，按种子与浓硫酸体积比为1:1的比例加入浓硫酸浸泡3min，期间不断搅拌。倒掉硫酸后，小心用清水冲洗直至无残渣，再用无菌水浸泡过夜。重复以上步骤1次。

(3)在超净工作台中，将经步骤(2)处理过的种子，先用体积分数为75％的酒精溶液浸泡40s后，用无菌水清洗3～5次,再用质量浓度为2％的次氯酸钠溶液消毒10min，然后用无菌水冲洗3次。

(4)将经步骤(3)灭菌后的种子以手术刀剥除种皮，接种于诱导培养基中。诱导培养基是以WPM培养基为基础，并添加2,4-D、GA₃、蔗糖和琼脂得到，其中2,4-D的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为1.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且诱导培养基的pH值为5.8～6.0。培养温度为25±2℃，暗培养20天后种子萌发，待幼苗长至3～5cm左右改为弱光培养。弱光培养的光照强度为1000～1500lx，光照时间为14h/d，待幼苗长至7～10cm时进行继代培养。

(5)将步骤(4)得到的幼苗切除根部，接种于继代培养基中：继代培养基是以WPM培养基为基础，并添加6-BA、IBA、GA₃、蔗糖和琼脂得到，其中6-BA的浓度为3.0mg/L，IBA的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为3.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且继代培养基的pH值为5.8～6.0。培养温度为25±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为16h/d，每30d更换一次培养基，丛生芽可不断增殖，增殖倍数为3.8。

(6)将步骤(5)得到的丛生芽切成单个植株，接种于生根培养基中：所述生根培养基是以WPM培养基为基础，并添加IBA、NAA、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且生根培养基的pH值为5.6～5.8。培养温度在25±2℃，光照强度为2500～3000lx，光照时间为16h/d，培养30天后幼苗生根，形成完整植株，幼苗生根率为86％；

(7)将步骤(6)得到的完整植株用常温清水洗去残留培养基，采用体积比为草炭﹕蛭石﹕珍珠岩＝5﹕3﹕1的混合物作为基质种植。期间使环境湿度保持在80％～90％之间，昼夜温度在15～20℃之间。1周以后，逐渐降低湿度。15天后炼苗完成，即可定植。

实施例1-2至实施例1-5

改变步骤(3)继代培养基中的试剂种类与用量，观察不同激素组合对蒙椴不定芽繁殖系数的影响。蔗糖和琼脂用量，以及培养方法同实施例1-1，结果见表1。其中，增殖倍数＝外植体生长点增殖总数/分化外植体总数，采用求平均值的方法算出。

表1

从表1可看出，与实施例1-1相比，改变6-BA、IBA和GA₃的加入浓度，蒙椴继代苗的平均株高和增殖倍数均有所下降。因此对于继代培养步骤，最适宜的继代培养基配方是WPM+3.0mg/L的6-BA+1.0mg/L的IBA+3.0mg/L的GA₃。

实施例1-6至实施例1-8

改变步骤(2)诱导培养过程中的光照条件，其它培养方法同实施例1-1。观察对蒙椴萌发率、平均株高和生长情况的影响，结果见表2。

表2

从表2可看出，在诱导过程中依次进行暗培养和弱光培养，蒙椴种子的萌发率高，生长健壮；单纯暗培养易造成幼苗徒长和黄化，后期易死亡；仅使用弱光培养种子发芽率降低；而强光培养不利于幼苗生长，使幼苗矮小畸形。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种蒙椴种苗的组织培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）对蒙椴种子进行以下操作：

[1] 将蒙椴种子与细砂按1:3的重量比混合，揉搓至种子表面粗糙，将种子洗净后浸泡2~4d；

[2] 将浸泡后的种子滤干，加入浓硫酸浸泡2~4min后取出洗净，并用水浸泡过夜，该步骤进行两次，然后对蒙椴种子进行灭菌处理；

（2）将灭菌后的蒙椴种子去除种皮，接种于诱导培养基中进行诱导培养，得到不定芽；

所述诱导培养基是以WPM培养基为基础，并添加2,4-D、GA₃、蔗糖和琼脂得到，所述诱导培养基中2,4-D的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为1.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述诱导培养基的pH值为5.8~6.0；

所述诱导培养为将灭菌后的蒙椴种子剥除种皮后接种于诱导培养基中，在温度为25±2℃下暗培养15~25天，直至种子萌发；待幼苗高度为3~5cm时改为弱光培养，待高度为7~10cm时得到不定芽；

所述弱光培养的条件为光照强度1000~1500 lx，光照时间为14h/d；

（3）将所述不定芽接种于继代培养基中进行继代培养，得到继代苗；

所述继代培养基是以WPM培养基为基础，并添加6-BA、IBA、GA₃、蔗糖和琼脂得到，所述继代培养基中6-BA的浓度为3.0mg/L，IBA的浓度为1.0mg/L，GA₃的浓度为3.0mg/L，蔗糖的浓度为30g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述继代培养基的pH值为5.8~6.0；

所述继代培养为将所述不定芽接种于继代培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500~3000Lx、光照时间为16h/d的条件下进行培养，每隔30天进行一次继代培养，每次继代培养更换培养基，并对不定芽进行分化，直至得到继代苗；

（4）将所述继代苗接种于生根培养基中进行生根培养，得到生根苗；

所述生根培养基是以WPM培养基为基础，并添加IBA、NAA、蔗糖和琼脂得到，所述生根培养基中IBA的浓度为0.5mg/L，NAA的浓度为0.2mg/L，蔗糖的浓度为20g/L，琼脂的浓度为5.5g/L，且所述生根培养基的pH值为5.6~5.8。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述灭菌处理为将所述种子依次使用酒精溶液和次氯酸钠溶液浸泡后，然后用无菌水冲洗。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，所述酒精溶液的体积分数为75%，所述次氯酸钠溶液的质量浓度为2%。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述生根培养为将所述继代苗接种于生根培养基中，在温度为25±2℃、光照强度为2500~3000Lx、光照时间为16h/d的条件下，培养25~30天，得到生根苗。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（4）结束后，还包括步骤（5）：将所述生根苗洗净后，在基质中培养15~20天得到移栽苗。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述基质中草炭、蛭石、珍珠岩的体积比为5：3：1。