CN108004196A - 一种合欢细胞的悬浮培养方法 - Google Patents

一种合欢细胞的悬浮培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种合欢细胞的悬浮培养方法，是取合欢腋芽作为外植体，进行表面消毒；然后将消毒后的外植体置于愈伤组织诱导培养基上，进行培养获得愈伤组织；再进行细胞预培养、细胞悬浮培养和细胞继代培养，获得大量的悬浮培养细胞。本发明通过对合欢进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的合欢细胞培养物，为合欢细胞悬浮培养生产次生代谢产物奠定了良好的基础。

Description

一种合欢细胞的悬浮培养方法
(一)技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种合欢细胞的悬浮培养方法。
(二)背景技术
合欢(Albizia julibrissin Durazz.)是豆科合欢属多年生落叶乔木。在我国南北都有栽培，分布于华东、华南、西南以及辽宁、河北、河南、陕西等省。合欢既是重要的园林观赏植物，同时更是一种重要的药用植物，合欢的叶、花、皮均可入药，具有重要医药价值,其细胞组织内含有含木脂体糖甙、合欢皂甙等多种成分。研究表明，合欢组织细胞次生代谢物合欢皂甙等具有抗生育，抗过敏作用，合欢皮所含多糖具有抗肿瘤作用，《本草纲目》有记载用于治郁结胸闷、失眠、健忘作用，能安五脏，和心志，有较好的镇静安神作用，也有治疗神经衰弱的作用。
目前合欢主要采用播种繁殖,播种繁殖育苗周期很长，而扦插繁殖过程中，合欢容易遭受病毒的侵染而在扦插繁殖中传播病毒，从而使优良性状的遗传资源得不到保护，最重要的是受季节变化和耕地逐渐减少的影响，导致无法满足合欢的市场需求，因此迫切需要找到一种能安全、快速而大量生产合欢细胞培养物的途径和方法，而采用组织培养技术不仅能解决合欢品种的繁殖变异问题，还可以通过细胞培养大量生产合欢次生代谢产物。合欢的悬浮细胞系的建立目前还未见报道，在工业生产中，通过合欢细胞培养是获得合欢细胞次生代谢药物和提取药理活性因子的有效途径之一，而且可研究合欢生长发育及分化的机制、遗传变异规律，对合欢的遗传育种具有特殊意义。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种合欢细胞的悬浮培养方法。
本发明采用的技术方案是：
一种合欢细胞的悬浮培养方法，所述方法按如下步骤进行：
(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；
(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.1～1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5～2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA0.5～1.5mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.5～1.0mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)20～80mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；
(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；
(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，即为鲜重；
细胞增殖倍数＝(收获量鲜重—接种量鲜重)/接种量鲜重；
细胞的生长速率(即每升培养液中每天生长量)＝(收获鲜重—接种量鲜重)/培养天数。
上述(3)、(4)、(5)步骤中合欢细胞的培养条件均为温度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。
进一步，步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为添加6-BA0.5mg/L、2，4-D 1.0mg/L的MS固体基本培养基。
进一步，步骤(3)所述合欢细胞的预培养液体培养基为添加6-BA1.0mg/L、2、4-D2.0mg/L的MS液体基本培养基，预培养时间为7天。
进一步，步骤(4)所述合欢细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.8mg/L、2，4-D 2.0mg/L、PVP 50mg/L的MS液体基本培养基,pH值为5.8、蔗糖30g/L。
进一步，步骤(4)所述合欢细胞悬浮培养基的细胞团接种量是30g/L。
本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵NH4NO3 1.65克、硝酸钾(KNO3)1.9克、氯化钙(CaCl2·2H2O)0.44克、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.37克、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.17克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(KI)0.83毫克、硼酸(H3BO3)6.2毫克、硫酸锰(MnSO4·4H2O)22.3毫克、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)8.6毫克、钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)0.25毫克、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.025毫克、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA)37.3毫克，硫酸亚铁(FeSO4·7H2O)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸2毫克、盐酸硫胺素(VB1)0.1毫克，盐酸吡哆醇(VB6)0.5毫克，烟酸(VB5)0.5毫克。蔗糖浓度是20～40克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。其中MS固体培养基包含琼脂，MS液体培养基内不含有琼脂。
本发明所述合欢腋芽选自浙江杭州园艺场的长势良好、无病虫害的合欢植株。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明能够快速获得大量的合欢悬浮培养细胞。
(2)本发明通过在细胞悬浮培养前对其进行预培养、以及在悬浮培养基中加入PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)，有效提高了细胞生长速度，增加了细胞鲜重，实现了工厂化大规模生产合欢细胞。
(3)本发明获得的合欢愈伤组织具有较高诱导率、生长旺盛、不褐化等优点，可长期继代保持，通过合欢愈伤组织进行细胞的悬浮培养，可实现大规模快速生产出有效成分含量高的合欢细胞培养物，从而可有效解决当前合欢植物资源和药材资源短缺的问题。
(四)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1
(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗30min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8min，再用无菌水冲洗3遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；
(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23℃下，暗培养10天，然后每天光照8小时、光照强度为1000lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.1mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA0.5mg/L、2，4-D1.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.5mg/L、2，4-D 1.0mg/L、PVP 20mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；
(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15天进行第一次继代培养，以后每隔15天继代一次；
(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，计算出合欢细胞的生物量增殖倍数为1.38倍，细胞的生长速率为1.56g/g/(d·L)；
上述(3)、(4)、(5)步骤中合欢细胞的培养条件均为温度23℃，pH值5.8，每天光照6小时，光照强度为1000lx，摇床转速为120r/min。
实施例2PVP对合欢细胞悬浮培养的影响
选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体转接到添加不同激素的细胞悬浮培养基中，其它操作同实施例1，合欢细胞悬浮培养结果见表1所示。结果表明，不同激素组合的培养基可以不同程度地诱导合欢细胞增殖，但是当培养基中添加PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)之后，细胞褐化率减少，细胞生长倍数增加，细胞生长速率也增加，其中添加50mg/L的PVP细胞生长速率最快，细胞增殖倍数达到2.97倍，细胞生长速率达到3.36g/(d·L)。
表1PVP对合欢细胞悬浮培养的影响
实施例3细胞的预培养对合欢细胞悬浮培养的影响
将实施例1步骤(2)中获得的合欢无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行不同天数的预培养，其它步骤同实施例1，合欢细胞悬浮培养结果见表2所示。结果表明，预培养7天后，继代培养3代的合欢细胞生物量增殖最大，细胞增殖倍数为2.86倍,细胞的生长速率为3.25g/(d·L)。
表2预培养对合欢细胞悬浮培养的影响
预培养时间(天) 细胞增殖倍数(倍) 细胞生长速率g/(d·L)
0 0.74 0.95
5 1.69 1.36
7 2.86 3.25
9 2.35 2.06
实施例4接种量对合欢细胞悬浮培养的影响
选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以不同的接种量转接到细胞悬浮培养基中，其它步骤同实施例1，合欢细胞悬浮培养结果见表3所示。结果表明，接种量为30g/L时，继代培养3代的合欢细胞生长数率最大，细胞增殖倍数为3.02倍,细胞的生长速率为3.35g/(d·L)。
表3接种量对合欢细胞悬浮培养的影响
接种量(g/L) 细胞增殖倍数(倍) 细胞生长速率(g/((d·L)
20 1.56 1.79
30 3.02 3.35
50 1.79 1.43
实施例5
(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗50min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇3min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡50s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡10min，再用无菌水冲洗4遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；
(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在25℃下，暗培养12天，然后每天光照10小时、光照强度为1200lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)1.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D2.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以30g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.8mg/L、2，4-D 2.0mg/L、PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)50mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；
(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了20天进行第一次继代培养，以后每隔20天继代一次；
(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，计算出合欢细胞的生物量增殖倍数为3.08倍，细胞的生长速率为3.46g/g/(d·L)；
上述(3)、(4)、(5)步骤中合欢细胞的培养条件均为温度25℃，pH值5.8，每天光照10小时，光照强度为1200lx，摇床转速为120r/min。
实施例6
(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡12min，再用无菌水冲洗5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；
(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在28℃下，暗培养15天，然后每天光照12小时、光照强度为1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA1.5mg/L、2，4-D4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D4.0mg/L、PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)80mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；
(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了25天进行第一次继代培养，以后每隔25天继代一次；
(6)细胞增殖生长计算：取继代培养的细胞在4000r/min的离心机上离心10min后，倒掉上清液进行称重，计算出合欢细胞的生物量增殖倍数为2.87倍，细胞的生长速率为3.18g/g/(d·L)；
上述(3)、(4)、(5)步骤中合欢细胞的培养条件均为温度28℃，pH值5.8，每天光照12小时，光照强度为1500lx，摇床转速为120r/min。

Claims (4)

1.一种合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)无菌外植体的获取：选取生长健康、无病虫害的合欢腋芽作为外植体，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净，在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用质量浓度0.1％HgCl2消毒液浸泡8～12min，再用无菌水冲洗3～5遍，在灭菌的滤纸上吸干水分；
(2)合欢愈伤组织的诱导培养：将消毒后的腋芽接入愈伤组织诱导培养基中，先在23～28℃下，暗培养10～15天，然后每天光照8～12小时、光照强度为1000～1500lx的条件下进行培养，所述的愈伤组织诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.1～1.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5～2.0mg/L、蔗糖30g/L、琼脂6.0g/L的MS固体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(3)细胞的预培养：将步骤(2)中获得的无褐化的黄白色愈伤组织转接入预培养液体培养基中进行5～9天的预培养，所述的预培养液体培养基为添加6-BA 0.5～1.5mg/L、2，4-D1.0～4.0mg/L、蔗糖30g/L的MS液体基本培养基,培养基的pH值为5.8；
(4)细胞的悬浮培养：选取预培养后处于悬浮培养液中部和上部的合欢单个细胞或疏松细胞小聚集体，以20～50g/L的接种量转接到细胞悬浮培养基中，所述细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.5～1.0mg/L、2，4-D 1.0～4.0mg/L、PVP(即聚乙烯吡咯烷酮)20～80mg/L、蔗糖30g/L的MS液体培养基,培养基的pH值为5.8；
(5)细胞的继代培养：在细胞悬浮培养了15～25天进行第一次继代培养，以后每隔15～25天继代一次；
上述(3)、(4)、(5)步骤中合欢细胞的培养条件均为温度23～28℃，pH值5.8，每天光照6～12小时，光照强度为1000～1500lx，摇床转速为120r/min。
2.根据权利要求1所述的合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于：步骤(2)所述愈伤组织诱导培养基为添加6-BA0.5mg/L、2，4-D 1.0mg/L的MS固体基本培养基。
3.根据权利要求1所述的合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于：步骤(3)所述合欢细胞的预培养液体培养基为添加6-BA1.0mg/L、2、4-D 2.0mg/L的MS液体基本培养基，预培养时间为7天。
4.根据权利要求1所述的合欢细胞的悬浮培养方法，其特征在于：步骤(4)所述合欢细胞悬浮培养基为添加6-BA 0.8mg/L、2，4-D 2.0mg/L、PVP 50mg/L的MS液体基本培养基,pH值为5.8、蔗糖30g/L，细胞团接种量是30g/L。
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