CN108243951A

CN108243951A - 一种白花蛇舌草的组织培养方法

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Publication number: CN108243951A
Application number: CN201711084223.0A
Authority: CN
Inventors: 邹克琴; 李素芳; 林丽
Original assignee: China Jiliang University
Current assignee: China Jiliang University
Priority date: 2017-11-07
Filing date: 2017-11-07
Publication date: 2018-07-06
Anticipated expiration: 2037-11-07
Also published as: CN108243951B

Abstract

本发明公开了一种白花蛇舌草的组织培养方法，使得在短期内可以获得大量的优质白花蛇舌草种苗，满足市场的需要；所述方法包括无菌材料的获得及芽诱导培养、芽的增殖、生根和生根苗移栽等步骤；本发明以腋芽为外植体，对培养基进行了改良，添加了酸水解酪蛋白，大大提高了分化率，克服了白花蛇舌草繁殖周期长、繁殖系数低、易感染和传播病毒等缺点；用该方法生产出来的组培苗具有病毒少、遗传性稳定等优点。

Description

一种白花蛇舌草的组织培养方法

(一)技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，尤其涉及一种白花蛇舌草的组织培养和快速繁苗方法。通过这种方法，可以进行优良种苗规模生产。

(二)背景技术

白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)是茜草科一年生草本植物，高 15-50cm。茎细长，白花。茎光滑无毛。其广泛分布于福建、广东、广西、云南、浙江、江苏、安徽等省区。白花蛇舌草中含有蒽醌类化合物和环烯醚苷萜类化合物，同时还含有具有免疫活性的多糖类化合物。其主要功效是清热解毒、消痛散结、利尿除湿。民间常用此草药内服治疗扁桃体炎、咽喉炎、阑尾炎、肝炎、痢疾、尿路感染、小儿疳积等。它也有增强非特异性免疫的作用，是重要的抗癌植物，临床上用于治疗多种恶性肿瘤。

由于市场对白花蛇舌草的需求用量不断增大，而野生资源却在逐渐减少，虽然可以种子繁殖，但是种子繁殖颗粒太小，难以大量繁殖，另外种子繁殖周期长，容易受季节和地区限制，严重影响的白花蛇舌草的开发利用。白花蛇舌草在种子繁殖过程中也容易引起变异，种植过程中易感染病毒，并且世代相传，逐年加重。病毒病易导致病毒的感染和传播,致使其品种退化严重。目前白花蛇舌草的繁殖主要采用播种繁殖，繁殖时间长，繁殖系数低，无法满足生产和市场需求。许多白花蛇舌草的优良品种资源得不到利用，直接影响了其药用的产量和质量，使白花蛇舌草的经济效益受到一定影响。

生物技术的快速发展，特别是植物组织和细胞培养技术，为白花蛇舌草的快速繁殖育种研究提供了重要基础。因此，发明一种快速高效的白花蛇舌草繁殖方法是非常必要的。

目前国内外对白花蛇舌草的组织培养也有研究报道(白花蛇舌草组织培养研究，巢建国等，南京中医药大学学报，2005年，21卷第6期369-370 页；一种白花蛇舌草茎段成苗的快速繁殖方法，中国，公开号 201510757407.3)。但是这些文献均采用了对环境具有极大危害的升汞作为消毒剂，培养过程经过了愈伤组织诱导的过程，增加了愈伤组织分化过程中继代增殖造成种苗变异的风险，无法保证其性状的稳定性，降低了种苗的品质和质量。本发明是以白花蛇舌草的腋芽为外植体，以繁芽的方式直接诱导分化不定芽。通过这种途径获得的不定芽无愈伤组织的产生，能有效避免继代增殖过程中出现的变异，更好地保持母株原有的优良性状。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种白花蛇舌草的组织培养和离体快速繁殖的方法，使得在短期内可以获得大量的优质白花蛇舌草种苗，满足市场的需要。

本发明采用的技术方案是：

一种白花蛇舌草组织培养方法，所述方法按如下步骤进行：

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的白花蛇舌草幼嫩的腋芽，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精(体积比w/w)的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用混合消毒液浸泡10～20min，再用无菌水冲洗3～5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养 15～25天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA(即6-苄氨基腺嘌呤)0.5～ 2.0mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5～1.5mg/L、NAA(即萘乙酸)0.05～0.5mg/L和酸水解酪蛋白0.2～0.6g/L的MS基本培养基；

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述24～26℃，光照1500～2500lx 条件下培养15～25天后的腋芽切口出现绿色突起，20～40天后出现丛生芽，再培养10～20天，当丛生芽长到2～4cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA 0.5～2.0mg/L、2，4-D 0.5～1.5mg/L、NAA 0.05～0.2mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.6g/L和脯氨酸200～ 600mg/L的MS基本培养基；

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根，所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入0.05mg/L～ 0.15mg/L的NAA,0.2～0.5g/L的酸水解酪蛋白；

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高3-5cm左右打开瓶盖炼苗2-4d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在24～26℃、光照1500～2500lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：3：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再曝晒基质1～3天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

进一步，步骤(1)所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2， 4-D 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS基本培养基。

进一步，步骤(2)所述的芽增殖培养基为添加6-BA1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L和脯氨酸400mg/L的MS基本培养基。

进一步，步骤(3)所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入 0.1mg/L的NAA,0.3g/L的的酸水解酪蛋白。

进一步，所述的MS基本培养基终浓度组成为：NH₄NO₃ 1.65克/升、 KNO₃ 1.9克/升、CaCl₂·2H₂O 0.44克/升、MgSO₄·7H₂O 0.37克/升、KH₂PO₄ 0.17克/升、KI 0.83毫克/升、H₃BO₃ 6.2毫克/升、MnSO₄·4H₂O 22.3毫克/ 升、ZnSO₄·7H₂O 8.6毫克/升、Na₂MoO₄·2H₂O0.25毫克/升、CuSO₄·5H₂O 0.025毫克/升、CoCl₂·6H₂O 0.025毫克/升、Na₂EDTA 37.3毫克/升、 FeSO₄·7H2O 27.8毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、盐酸硫胺素0.1毫克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸0.5毫克/升、蔗糖20～40克/ 升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。

本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵NH₄NO₃ 1.65克、硝酸钾(KNO₃)1.9克、氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 0.44克、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.37克、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.17 克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(KI)0.83毫克、硼酸(H₃BO₃)6.2毫克、硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)22.3毫克、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6毫克、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25毫克、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025毫克、氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)37.3毫克，硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸 2毫克、盐酸硫胺素(VB₁)0.1毫克，盐酸吡哆醇(VB₆)0.5毫克，烟酸 (VB₅)0.5毫克。蔗糖浓度是20～40克/升，琼脂粉浓度是7～11克/升,溶剂为水，pH为5.6～6.0。

更进一步，本发明所述一种白花蛇舌草组织培养方法推荐按照以下步骤进行：

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的白花蛇舌草的腋芽，用自来水冲洗45min，然后在体积浓度为1％洗洁精(体积比w/w)的水溶液中振摇3min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡45s，然后用混合消毒液浸泡15min，再用无菌水冲洗4遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在 25℃，光照2000lx条件下培养20天；所述混合消毒液为体积比1：200 的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS 基本培养基，MS基本培养基中蔗糖30g/L、琼脂粉9g/L、溶剂为水，pH5.8。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述25℃，光照2000lx条件下培养 20天后，切口部位出现绿色突起，30天后出现丛生芽，再培养15天，当丛生芽长到3cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在25℃，光照2000lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加 6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L和脯氨酸400mg/L的MS基本培养基。

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入0.1mg/L 的NAA和0.3g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高4cm左右打开瓶盖炼苗3d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在25℃、光照2000lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：3：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再曝晒基质2天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

本发明所述白花蛇舌草的腋芽选自浙江临安天目山的长势良好、无病虫害的白花蛇舌草植株。

本发明所述改良的1/2MS培养基是指将传统1/2MS基本培养基进行改良，传统1/2MS是仅仅将大量元素减半，微量元素、有机物和铁盐的含量均不变，而本发明中改良的1/2MS不但其中大量元素减半，而且微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，不添加有机物，取消的有机物包含有肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素(VB₁)、盐酸吡哆醇(VB₆)、烟酸(VB₅) 等。即终浓度组成为：硝酸铵NH₄NO₃ 0.83克、硝酸钾(KNO₃)0.95克、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)0.22克、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.19克、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.09克、碘化钾(KI)0.42毫克、硼酸(H₃BO₃)3.1 毫克、硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)11.2毫克、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)4.3 毫克、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.13毫克、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.013 毫克、氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.013毫克、乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA) 18.7毫克、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)13.9毫克、蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。

本发明所述洗洁精为浙江传化洗洁精，作为清洗剂使用时通常以体积比1：100添加水。本发明所述封口膜购自山东青岛普朗特生物有限公司。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)以腋芽为外植体，应用组织培养的方法进行快速繁殖，克服了白花蛇舌草利用传统种子繁殖而繁殖周期长、繁殖系数低、易感染和传播病毒等缺点；用该方法生产出来的组培苗具有病毒少、遗传性稳定等优点。

(2)改进外植体消毒方法：用毒性小并且易降解的84消毒液代替传统的不可降解的氯化汞消毒剂；氯化汞属于重金属有极大的腐蚀性，并含有剧毒；长期接触更可能引起皮肤过敏或肾病综合症，进入环境对人类食物链也有相当大的破坏性，采用84消毒液对生态环境更安全环保；质量浓度0.1％HgCl₂消毒对芽的诱导率低而且外植体有发褐现象，芽的生长也比较慢，而混合消毒液虽然污染率与0.1％HgCl₂污染率均为10％，但是对细胞毒害最小，芽生长也快。。

(3)对培养基进行了改良，添加了酸水解酪蛋白营养因子。酸水解酪蛋白不但在白花蛇舌草的组织培养中有抗褐化作用，还具有增加营养促进分化，避免愈伤组织产生的作用。当在培养基中同时添加脯氨酸，其活性因子与酸水解酪蛋白协同作用大大提高了白花蛇舌草的芽分化和增殖率，增殖率可以达到730％，增殖倍数达到8.3。

(4)对生根的传统1/2MS进行了改良，传统1/2MS是仅仅将大量元素减半，微量元素和铁盐的含量均不变，而本发明中改良的1/2MS不但其中大量元素减半，而且微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，取消了传统1/2MS中的有机物，取消的有机物包括肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素(VB₁)、盐酸吡哆醇(VB₆)、烟酸(VB₅)等，大大节约了组织培养工厂化育苗生根成本；而在生根培养基中添加酸水解酪蛋白后，不但抑制了褐化，而且促进了生根，生根率100％，根系粗壮。

(5)改进了组培程序，本方法获得的白花蛇舌草不定芽分化和诱导过程，不经愈伤组织脱分化，直接以腋芽诱导无菌芽，比通过叶片和茎段为外植体先获得愈伤组织，再从愈伤组织获得的无菌芽材料更快，更容易，而且能有效避免继代增殖过程中造成的种苗变异，提高了其性状的稳定性，保证了种苗的品质和质量，有利于种质资源保存和生产利用，可有效解决白花蛇舌草的优质种苗的供应问题。

(四)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明所述MS基本培养基包含大量元素、微量元素、铁盐、有机物、蔗糖和琼脂粉。所述大量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加硝酸铵NH₄NO₃ 1.65克、硝酸钾(KNO₃)1.9克、氯化钙(CaCl₂·2H₂O) 0.44克、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.37克、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.17 克。所述微量元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加碘化钾(KI)0.83毫克、硼酸(H₃BO₃)6.2毫克、硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)22.3毫克、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O)8.6毫克、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.25毫克、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O)0.025毫克、氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.025毫克。所述铁盐元素组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加乙二胺四乙酸二钠(Na₂EDTA)37.3毫克，硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)27.8毫克。所述有机物组成是在配置1升(1000毫升)培养基时，加肌醇100毫克、甘氨酸 2毫克、盐酸硫胺素(VB₁)0.1毫克，盐酸吡哆醇(VB₆)0.5毫克，烟酸 (VB₅)0.5毫克；蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。

本发明所述改良的1/2MS培养基是指将传统1/2MS培养基进行改良，传统1/2MS是仅仅将大量元素减半，微量元素、有机物和铁盐的含量均不变，而本发明中改良的1/2MS不但其中大量元素减半，而且微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，不添加有机物，取消的有机物包含肌醇、甘氨酸、盐酸硫胺素(VB₁)、盐酸吡哆醇(VB₆)、烟酸(VB₅) 等。即终浓度组成为：硝酸铵NH₄NO₃ 0.83克、硝酸钾(KNO₃)0.95克、氯化钙(CaCl₂·2H₂O)0.22克、硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.19克、磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.09克、碘化钾(KI)0.42毫克、硼酸(H₃BO₃)3.1毫克、硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)11.2毫克、硫酸锌(ZnSO₄·7H₂O) 4.3毫克、钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)0.13毫克、硫酸铜(CuSO₄·5H₂O) 0.013毫克、氯化钴(CoCl₂·6H₂O)0.013毫克、乙二胺四乙酸二钠 (Na₂EDTA)18.7毫克、硫酸亚铁(FeSO₄·7H₂O)13.9毫克、蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。

本发明所述洗洁精为浙江传化洗洁精。

本发明所述封口膜购自山东青岛普朗特生物有限公司。

实施例1

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的白花蛇舌草的腋芽，用自来水冲洗30min，然后在体积浓度为1％洗洁精(体积比w/w)的水溶液中振摇2min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡30s，然后用混合消毒液浸泡10min，再用无菌水冲洗3遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在 24℃，光照1500lx条件下培养15天；所述混合消毒液为体积比1：200 的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA(即 6-苄氨基腺嘌呤)0.5mg/L、2，4-D(即2,4-二氯苯氧基乙酸)0.5mg/L、 NAA(即萘乙酸)0.05mg/L和酸水解酪蛋白0.2g/L的MS基本培养基； MS基本培养基中蔗糖20g/L、琼脂粉7g/L、溶剂为水，pH5.6。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述24℃，光照1500lx条件下培养15天后的腋芽材料切口出现绿色突起，20天后出现丛生芽，再培养10 天，当丛生芽长到2cm时，将不定芽切下转接到芽增殖培养基中，在24℃，光照1500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA 0.5mg/L、2，4-D 0.5mg/L、NAA0.05mg/L、酸水解酪蛋白0.2g/L 和脯氨酸200mg/L的MS基本培养基。

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入0.05mg/L 的NAA,0.2g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高3cm左右打开瓶盖炼苗2d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在24℃、光照1500lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：3：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3天后揭开薄膜再曝晒基质1天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

实施例2不同的消毒剂对白花蛇舌草外植体生长的影响

分别用质量浓度10％的过氧化氢(H₂O₂)水溶液、质量浓度0.1％的氯化汞(HgCl₂)水溶液以及实施例1中的混合消毒液(即体积比1：200 的吐温20和84消毒液)对白花蛇舌草的外植体材料(即腋芽)进行消毒，其它操作同实施例1。分别将腋芽接种到装有丛生芽诱导培养基的培养瓶中，封口膜封住瓶口后，置于培养箱中。在24℃，光照1500lx条件下进行培养10天后，观察统计不同消毒剂对白花蛇舌草芽诱导和生长的影响，结果见表1所示。结果表明，混合消毒液和质量浓度0.1％HgCl₂的消毒效果基本相同，质量浓度10％的过氧化氢消毒效果稍差，污染率达到30％，生长缓慢。但是质量浓度0.1％HgCl₂消毒对芽的诱导有影响，芽诱导率低而且外植体有发褐现象，芽的生长也比较慢，可能是HgCl₂毒害细胞对芽的诱导有一定的影响，而混合消毒液虽然污染率与0.1％HgCl₂污染率均为 10％，对细胞毒害最小，生长也快。

表1不同的消毒剂对白花蛇舌草外植体生长的影响

实施例3不同激素组合对白花蛇舌草芽的诱导影响

将白花蛇舌草腋芽分别接种在添加了不同浓度6-BA、2，4-D和NAA 的MS基本培养基中，其它操作同实施例1，白花蛇舌草不定芽生长结果见表2所示。结果表明，不同激素组合的培养基均可以不同程度地诱导芽的形成。其中以培养基MS+6-BA1.0mg/L+2,4-D1.0mg/L+NAA 0.2mg/L+0.4g/L酸水解酪蛋白为最佳，诱导出的再生芽最多，生长快，平均芽长2.55cm，芽诱导率达76％，苗大而健壮，无玻璃化苗现象,而且很少产生愈伤组织，而不添加酸水解酪蛋白的培养基切口部位均呈现不同程度的褐化。

其中芽诱导率＝总芽数/接种芽数×100％

表2不同激素组合对白花蛇舌草的芽诱导影响

实施例4酸水解酪蛋白和脯氨酸对白花蛇舌草芽增殖的影响

将白花蛇舌草的丛生芽分别接种到添加了不同浓度酸水解酪蛋白和脯氨酸的芽增殖培养基中，其它操作同实施例1，酸水解酪蛋白和脯氨酸对白花蛇舌草芽增殖的影响结果如表3所示。结果发现，白花蛇舌草不定芽在未添加酸水解酪蛋白和脯氨酸的培养基中，均呈现芽增殖分化率低，组织褐化，不定芽增殖少，生长慢的现象，即使在优化的增殖培养基 MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+NAA0.1mg/L中，未添加酸水解酪蛋白和脯氨酸时，白花蛇舌草不定芽虽然也有增殖，但是褐化严重。单独添加酸水解酪蛋白0.4～0.6g/L，能改善褐化的状态，而单独添加脯氨酸200～600mg/L均能促进芽生长分化。在优化的芽增殖培养基MS+6-BA 1.0mg/L+2,4-D 1.0mg/L+NAA0.1mg/L中添加0.4g/L的酸水解酪蛋白和 400mg/L脯氨酸，增殖率可以达到730％，增殖倍数达到8.3，苗较大，叶绿色，健壮而且增殖多。

其中增殖率＝(总芽数-接种芽数)/接种芽数×100％

增殖倍数＝总芽数/接种芽数

表3酸水解酪蛋白和脯氨酸对白花蛇舌草芽增殖的影响

实施例5酸水解酪蛋白对白花蛇舌草生根的影响

将白花蛇舌草的丛生芽分别接种到添加了不同浓度酸水解酪蛋白的生根培养基中，其它操作同实施例1，酸水解酪蛋白对白花蛇舌草芽生根的影响结果如表4所示。结果发现，白花蛇舌草不定芽在未添加酸水解酪蛋白的生根培养基中，生根少，有褐化现象，在添加酸水解酪蛋白的生根培养基中，促进生根，生根启动天数均缩短，无褐化现象，而且根系粗壮。其中酸水解酪蛋白的添加浓度为0.3g/L，对抑制褐化和生根效果较好，生根率可以达到100％，在第4天就启动生根。

生根率＝生根苗数/接种数×100％

表4酸水解酪蛋白对白花蛇舌草芽生根的影响

实施例6

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的白花蛇舌草的腋芽，用自来水冲洗45min，然后在体积浓度为1％洗洁精(体积比w/w)的水溶液中振摇3min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡45s，然后用混合消毒液浸泡15min，再用无菌水冲洗4遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在 25℃，光照2000lx条件下培养20天；所述混合消毒液为体积比1：200 的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖30g/L、琼脂粉9g/L、溶剂为水，pH5.8。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述25℃，光照2000lx条件下培养 20天后，腋芽切口部位出现绿色突起，30天后出现丛生芽，再培养15 天，当丛生芽长到3cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在25℃，光照2000lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA 0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L 和脯氨酸400mg/L的MS基本培养基。

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高4cm左右打开瓶盖炼苗3d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在25℃、光照2000lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生；所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：3：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再曝晒基质2天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖4天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

实施例7

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的白花蛇舌草的腋芽，用自来水冲洗60min，然后在体积浓度为1％洗洁精(体积比w/w)的水溶液中振摇5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70％乙醇水溶液浸泡60s，然后用混合消毒液浸泡20min，再用无菌水冲洗5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，切取1.0cm的嫩芽，然后将嫩芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在26℃，光照2500lx条件下培养25天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 2.0mg/L、2，4-D 1.5mg/L、NAA 0.5mg/L和酸水解酪蛋白0.6g/L的MS基本培养基，MS基本培养基中蔗糖40g/L、琼脂粉11g/L、溶剂为水，pH6.0。

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述26℃，光照2500lx条件下培养 25天后，腋芽切口部位出现绿色突起，40天后出现丛生芽，再培养20 天，当丛生芽长到4cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在26℃，光照2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA 2.0mg/L、2，4-D 1.5mg/L、NAA 0.2mg/L、酸水解酪蛋白0.6g/L 和脯氨酸600mg/L的MS基本培养基。

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根；所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入0.15mg/L 的NAA和0.5g/L的酸水解酪蛋白。

(4)生根苗的移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高5cm左右打开瓶盖炼苗4d即可进行移栽。移栽前将植株上的琼脂和杂物洗净，移栽与经0.1％高锰酸钾消毒过的育苗基质上，浇透定根水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在26℃、光照2500lx条件下培养，并定期进行喷药预防病虫害的发生。所述移栽基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：3：2的比例配置而成，所述移栽基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖5天后揭开薄膜再曝晒基质3天，完成对移栽基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖5天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对移栽基质的消毒。

Claims

1.一种白花蛇舌草(Hedyotis diffusa)组织培养方法，其特征在于所述方法按如下步骤进行：

(1)无菌材料的获得及诱导培养：切取长势良好、无病虫害的白花蛇舌草的腋芽，用自来水冲洗30～60min，然后在体积浓度为1％洗洁精的水溶液中振摇2～5min，用无菌水冲净；在超净工作台上用体积浓度70～75％乙醇水溶液浸泡30～60s，然后用混合消毒液浸泡10～20min，再用无菌水冲洗3～5遍；在灭菌的滤纸上吸干水分，然后将腋芽接种到装丛生芽诱导培养基的培养瓶中，盖上瓶盖并用封口膜封住瓶口，置于培养箱中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养15～25天；所述混合消毒液为体积比1：200的吐温20和84消毒液的混合液；所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 0.5～2.0mg/L、2，4-D0.5～1.5mg/L、NAA0.05～0.5mg/L和酸水解酪蛋白0.2～0.6g/L的MS基本培养基；

(2)芽的增殖：观察步骤(1)所述24～26℃，光照1500～2500lx条件下培养5～15天后，腋芽切口部位出现绿色突起，20～40天后出现丛生芽，再培养10～20天，当丛生芽长到2～4cm时，将丛生芽切下转接到芽增殖培养基中，在24～26℃，光照1500～2500lx条件下进行增殖培养，获得丛生苗；所述芽增殖培养基为添加6-BA 0.5～2.0mg/L、2，4-D 0.5～1.5mg/L、NAA 0.05～0.2mg/L、酸水解酪蛋白0.2～0.6g/L和脯氨酸200～600mg/L的MS基本培养基；

(3)生根培养：将分化的丛生苗从基部切下，插入生根培养基中培养至芽生根，所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入0.05mg/L～0.15mg/L的NAA,0.2～0.5g/L的酸水解酪蛋白；

(4)生根苗移栽：待小苗叶片舒展，叶色浓绿，苗高3-5cm时，打开瓶盖炼苗2～4天后，将小苗植株上的琼脂和杂物洗净，移栽至消毒后的育苗基质上，浇透水，盖上薄膜，保持湿度80％以上，置通风阴凉处，在24～26℃、光照1500～2500lx条件下培养8～12d；所述育苗基质为细沙、腐殖土与谷糠灰按照质量比5：3：2的比例配制而成，所述育苗基质的消毒方法为：采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再曝晒基质1～3天，完成对育苗基质的消毒，或者采用体积浓度0.5％福尔马林水溶液均匀喷洒基质，塑料薄膜覆盖3～5天后揭开薄膜再在60℃下干燥2天，完成对育苗基质的消毒。

2.如权利要求1所述白花蛇舌草组织培养方法，其特征在于步骤(1)所述丛生芽诱导培养基为添加6-BA 1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA 0.2mg/L和酸水解酪蛋白0.4g/L的MS基本培养基。

3.如权利要求1所述白花蛇舌草组织培养方法，其特征在于步骤(2)所述的芽增殖培养基为添加6-BA1.0mg/L、2，4-D 1.0mg/L、NAA0.1mg/L、酸水解酪蛋白0.4g/L和脯氨酸400mg/L的MS基本培养基。

4.如权利要求1所述白花蛇舌草组织培养方法，其特征在于步骤(3)所述的生根培养基为改良的1/2MS培养基中加入0.1mg/L的NAA,0.3g/L的的酸水解酪蛋白。

5.如权利要求1所述白花蛇舌草组织培养方法，其特征在于所述生根培养的改良的1/2MS培养基是指将大量元素、微量元素和铁盐的含量均降低为1/2的含量，不添加有机物，即终浓度组成为：NH₄NO₃ 0.83克、KNO₃0.95克、CaCl₂·2H₂O 0.22克、MgSO₄·7H₂O 0.19克、KH₂PO₄ 0.09克、KI 0.42毫克、H₃BO₃ 3.1毫克、MnSO₄·4H₂O 11.2毫克、ZnSO₄·7H₂O 4.3毫克、Na₂MoO₄·2H₂O 0.13毫克、CuSO₄·5H₂O 0.013毫克、CoCl₂·6H₂O 0.013毫克、Na₂EDTA18.7毫克、FeSO₄·7H₂O 13.9毫克、蔗糖30克/升、琼脂粉9克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。

6.如权利要求1所述白花蛇舌草组织培养方法，其特征在于所述的MS基本培养基终浓度组成为：NH₄NO₃ 1.65克/升、KNO₃ 1.9克/升、CaCl₂·2H₂O 0.44克/升、MgSO₄·7H₂O 0.37克/升、KH₂PO₄ 0.17克/升、KI 0.83毫克/升、H₃BO₃ 6.2毫克/升、MnSO₄·4H₂O 22.3毫克/升、ZnSO₄·7H₂O 8.6毫克/升、Na₂MoO₄·2H₂O 0.25毫克/升、CuSO₄·5H₂O 0.025毫克/升、CoCl₂·6H₂O 0.025毫克/升、Na₂EDTA 37.25毫克/升、FeSO₄·7H₂O 27.85毫克/升、肌醇100毫克/升、甘氨酸2毫克/升、盐酸硫胺素0.1毫克/升、盐酸吡哆醇0.5毫克/升、烟酸0.5毫克/升、蔗糖20～40克/升、琼脂粉7～11克/升，溶剂为水，pH为5.6～6.0。