CN104604690A - 一种油用牡丹组织培养方法及改良的基本培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种油用牡丹组织培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：S1、建立无菌培养环境；选条：选取生长健壮的当年生油用牡丹枝条，用饱满而未萌发的侧芽作为外植体；配置培养基：包括分化培养基和生根培养基；清洗外植体；消毒与接种；培养无菌芽；S2、继代增殖S21、将上述无菌芽从原茎段上切下，转接到分化培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽，将原茎段去除；继代增殖培养基每升用蔗糖25-27克；S22、每28-49天重复做一次继代增殖，继代前先制备好生根培养基，然后在无菌操作条件下，将月季嫩茎切成1～2节一段，投入新鲜的增殖培养基上；S23、生根与移栽。
Description
技术领域
本发明涉及一种油用牡丹培育的技术领域，特别涉及一种油用牡丹组织培养方法及改良的基本培养基。
背景技术
油用牡丹是一种灌木植物。分布于中国山东省菏泽、河南省洛阳、陕西省太白山一带、安徽省亳州市、铜陵市凤凰山、甘肃省以及湖南湘西等。现在用于商业生产中的油用牡丹仅有凤丹和紫斑两个品种。
现在市面上没有一种专门针对油用牡丹组织培养方法及改良的基本培养基。
发明内容
本发明实施例提供一种专门针对油用牡丹使用的油用牡丹组织培养方法及改良的基本培养基。
一种油用牡丹组织培养方法，其包括如下步骤：
S1、建立无菌培养环境；
选条：选取生长健壮的当年生油用牡丹枝条，用饱满而未萌发的侧芽作为外植体；以枝条中段芽最好，因为接种后，中段芽第5天左右就能萌发，而基部和梢部的芽往往迟至15天才萌发。
配置培养基：包括分化培养基和生根培养基，上述两种培养基都以MS为基本培养基，分化培养基是由BA即苄氨基腺嘌呤、NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，BA为1mg，NAA为0.05mg，L-脯氨酸为500mg、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为5500mg；生根培养基是由NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，NAA为0.2mg，L-脯氨酸为500MG、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为550mg；分化培养基和生根培养基还包括一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、钠盐37.3mg、七水硫酸亚铁27.8mg、碘化钾0.83mg；植物生长调节剂：苄基腺嘌呤0.35mg、萘乙酸0.25mg；
清洗外植体：采回的油用牡丹枝条切去叶，再剥去附在茎上的叶柄及皮刺，先整段用洗手刷沾浓洗衣粉水仔细刷洗，再用自来水冲洗，毛巾擦干，放置在小木板上，用利刀切成2-3cm一段，每段至少一个侧芽，装入消毒过的培养皿，放在超净工作台上，打开紫外灯，做表面灭菌25-30分钟；
消毒与接种：在超净工作台上，用饱和漂白粉上清液作表面灭菌25-30分钟，灭菌时间快到时，即倾去灭菌溶液，用无菌水涮洗3-5次，并通过无菌纱布吸干茎段外表水分，按无菌操作要求，接种到直径为5-7cm的试管里，从芽萌发到芽长到1厘米左右需要2～3周。
培养无菌芽：在20-25℃的条件下，光照14-21天，每天光照时间为11-14小时，光照强度为1300-1500LX；培养温度21℃最好，最高不超过25℃，有昼夜温差。
S2、继代增殖
S21、将上述无菌芽从原茎段上切下，转接到分化培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽，将原茎段去除；继代增殖培养基每升用蔗糖25-27克；投入新鲜的分化培养基上，游泳牡丹小苗就会按几何级数增殖起来，也可以将大苗转入到生根培养基上。
S22、每28-49天重复做一次继代增殖，继代前先制备好生根培养基，然后在无菌操作条件下，将月季嫩茎切成1～2节一段，投入新鲜的增殖培养基上；
S23、生根与移栽
游泳牡丹嫩芽生长到4-7cm时，就应切割下来，转入生根培养基；切下的嫩芽长度为2-3厘米，让幼苗基部伤口愈合，已长出根原基，幼根尚未长出，即出瓶种植。这种方法不会损伤根系，移栽速度快，成活率高。
在本发明所述的油用牡丹组织培养方法，所述步骤S22包括：
S221、插植2厘米以上无根嫩茎，经2周左右出现根原基，幼根尚未长出即出瓶种植；
S222、移栽：幼苗出瓶后，先洗去沾附的琼脂培养基，再种植到粗沙的园田土比例为体积比1：3的介质中，介质疏松透气，具有一定的保水、保肥能力；种植密度2～3厘米×4～6厘米/株，移栽完毕浇透水，并用0.1％的百菌清、多菌灵或甲基托布津等喷雾保苗。
在本发明所述的油用牡丹组织培养方法中，
S223、在所述步骤S222之后，移栽后管理：移栽后需保持相对湿度85％以上，在温室、拱棚中移栽，覆好遮荫网，并注意通风和温度管理；在4-6周后，须做好第二次移植，通常植入5厘米×9厘米的塑料杯中，每杯种1苗，再经4～6周，地上、地下部分都充分生长；
S224、移栽后植保工作：首次移栽1周后，根据幼苗的大小，施用浓度为0.1-0.3％的复合肥，每7～10天喷一次杀菌剂；试管苗第二次移栽后，及时掐去顶芽以促进侧芽的生长。
一种油用牡丹组织培养改良的基本培养基，培养基包括分化培养基和生根培养基，上述两种培养基都以MS为基本培养基，分化培养基是由BA即苄氨基腺嘌呤、NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，BA为1mg，NAA为0.05mg，L-脯氨酸为500mg、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为5500mg；生根培养基是由NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，NAA为0.2mg，L-脯氨酸为500MG、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为550mg；分化培养基和生根培养基还包括一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、钠盐37.3mg、七水硫酸亚铁27.8mg、碘化钾0.83mg；植物生长调节剂：苄基腺嘌呤0.35mg、萘乙酸0.25mg。
本发明的油用牡丹组织培养方法及改良的基本培养基提高了油用牡丹组织培养的存活率。
具体实施方式
一种油用牡丹组织培养方法，其包括如下步骤：
S1、建立无菌培养环境；
选条：选取生长健壮的当年生油用牡丹枝条，用饱满而未萌发的侧芽作为外植体；
配置培养基：包括分化培养基和生根培养基，上述两种培养基都以MS为基本培养基，分化培养基是由BA即苄氨基腺嘌呤、NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，BA为1mg，NAA为0.05mg，L-脯氨酸为500mg、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为5500mg；生根培养基是由NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，NAA为0.2mg，L-脯氨酸为500MG、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为550mg；分化培养基和生根培养基还包括一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、钠盐37.3mg、七水硫酸亚铁27.8mg、碘化钾0.83mg；植物生长调节剂：苄基腺嘌呤0.35mg、萘乙酸0.25mg；
清洗外植体：采回的油用牡丹枝条切去叶，再剥去附在茎上的叶柄及皮刺，先整段用洗手刷沾浓洗衣粉水仔细刷洗，再用自来水冲洗，毛巾擦干，放置在小木板上，用利刀切成2-3cm一段，每段至少一个侧芽，装入消毒过的培养皿，放在超净工作台上，打开紫外灯，做表面灭菌25-30分钟；
消毒与接种：在超净工作台上，用饱和漂白粉上清液作表面灭菌25-30分钟，灭菌时间快到时，即倾去灭菌溶液，用无菌水涮洗3-5次，并通过无菌纱布吸干茎段外表水分，按无菌操作要求，接种到直径为5-7cm的试管里，从芽萌发到芽长到1厘米左右需要2～3周。
培养无菌芽：在20-25℃的条件下，光照14-21天，每天光照时间为11-14小时，光照强度为1300-1500LX；
S2、继代增殖
S21、将上述无菌芽从原茎段上切下，转接到分化培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽，将原茎段去除；继代增殖培养基每升用蔗糖25-27克；
S22、每28-49天重复做一次继代增殖，继代前先制备好生根培养基，然后在无菌操作条件下，将月季嫩茎切成1～2节一段，投入新鲜的增殖培养基上；
S23、生根与移栽
游泳牡丹嫩芽生长到4-7cm时，就应切割下来，转入生根培养基；切下的嫩芽长度为2-3厘米，让幼苗基部伤口愈合，已长出根原基，幼根尚未长出，即出瓶种植。
在本发明所述的油用牡丹组织培养方法，所述步骤S22包括：
S221、插植2厘米以上无根嫩茎，经2周左右出现根原基，幼根尚未长出即出瓶种植；
S222、移栽：幼苗出瓶后，先洗去沾附的琼脂培养基，再种植到粗沙的园田土比例为体积比1：3的介质中，介质疏松透气，具有一定的保水、保肥能力；种植密度2～3厘米×4～6厘米/株，移栽完毕浇透水，并用0.1％的百菌清、多菌灵或甲基托布津等喷雾保苗。
在本发明所述的油用牡丹组织培养方法中，
S223、在所述步骤S222之后，移栽后管理：移栽后需保持相对湿度85％以上，在温室、拱棚中移栽，覆好遮荫网，并注意通风和温度管理；在4-6周后，须做好第二次移植，通常植入5厘米×9厘米的塑料杯中，每杯种1苗，再经4～6周，地上、地下部分都充分生长；
S224、移栽后植保工作：首次移栽1周后，根据幼苗的大小，施用浓度为0.1-0.3％的复合肥，每7～10天喷一次杀菌剂；试管苗第二次移栽后，及时掐去顶芽以促进侧芽的生长。
一种油用牡丹组织培养改良的基本培养基，培养基包括分化培养基和生根培养基，上述两种培养基都以MS为基本培养基，分化培养基是由BA即苄氨基腺嘌呤、NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，BA为1mg，NAA为0.05mg，L-脯氨酸为500mg、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为5500mg；生根培养基是由NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，NAA为0.2mg，L-脯氨酸为500MG、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为550mg；分化培养基和生根培养基还包括一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、钠盐37.3mg、七水硫酸亚铁27.8mg、碘化钾0.83mg；植物生长调节剂：苄基腺嘌呤0.35mg、萘乙酸0.25mg。
本发明的油用牡丹组织培养方法及改良的基本培养基提高了油用牡丹组织培养的存活率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (4)
1.一种油用牡丹组织培养方法，其特征在于，其包括如下步骤：
S1、建立无菌培养环境；
选条：选取生长健壮的当年生油用牡丹枝条，用饱满而未萌发的侧芽作为外植体；
配置培养基：包括分化培养基和生根培养基，上述两种培养基都以MS为基本培养基，分化培养基是由BA即苄氨基腺嘌呤、NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，BA为1mg，NAA为0.05mg，L-脯氨酸为500mg、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为5500mg；生根培养基是由NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，NAA为0.2mg，L-脯氨酸为500MG、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为550mg；分化培养基和生根培养基还包括一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、钠盐37.3mg、七水硫酸亚铁27.8mg、碘化钾0.83mg；植物生长调节剂：苄基腺嘌呤0.35mg、萘乙酸0.25mg；
清洗外植体：采回的油用牡丹枝条切去叶，再剥去附在茎上的叶柄及皮刺，先整段用洗手刷沾浓洗衣粉水仔细刷洗，再用自来水冲洗，毛巾擦干，放置在小木板上，用利刀切成2-3cm一段，每段至少一个侧芽，装入消毒过的培养皿，放在超净工作台上，打开紫外灯，做表面灭菌25-30分钟；
消毒与接种：在超净工作台上，用饱和漂白粉上清液作表面灭菌25-30分钟，灭菌时间快到时，即倾去灭菌溶液，用无菌水涮洗3-5次，并通过无菌纱布吸干茎段外表水分，按无菌操作要求，接种到直径为5-7cm的试管里，从芽萌发到芽长到1厘米左右需要2～3周；
培养无菌芽：在20-25℃的条件下，光照14-21天，每天光照时间为11-14小时，光照强度为1300-1500LX；
S2、继代增殖
S21、将上述无菌芽从原茎段上切下，转接到分化培养基上，促使嫩茎长出更多的侧芽，将原茎段去除；继代增殖培养基每升用蔗糖25-27克；
S22、每28-49天重复做一次继代增殖，继代前先制备好生根培养基，然后在无菌操作条件下，将月季嫩茎切成1～2节一段，投入新鲜的增殖培养基上；
S23、生根与移栽
游泳牡丹嫩芽生长到4-7cm时，就应切割下来，转入生根培养基；切下的嫩芽长度为2-3厘米，让幼苗基部伤口愈合，已长出根原基，幼根尚未长出，即出瓶种植。
2.如权利要求1所述的油用牡丹组织培养方法，其特征在于，
所述步骤S22包括；
S221、插植2厘米以上无根嫩茎，经2周左右出现根原基，幼根尚未长出即出瓶种植；
S222、移栽：幼苗出瓶后，先洗去沾附的琼脂培养基，再种植到粗沙的园田土比例为体积比1∶3的介质中，介质疏松透气，具有一定的保水、保肥能力；种植密度2～3厘米×4～6厘米/株，移栽完毕浇透水，并用0.1％的百菌清、多菌灵或甲基托布津等喷雾保苗。
3.如权利要求2所述的油用牡丹组织培养方法，其特征在于，
S223、在所述步骤S222之后，移栽后管理：移栽后需保持相对湿度85％以上，在温室、拱棚中移栽，覆好遮荫网，并注意通风和温度管理；在4-6周后，须做好第二次移植，通常植入5厘米×9厘米的塑料杯中，每杯种1苗，再经4～6周，地上、地下部分都充分生长；
S224、移栽后植保工作：首次移栽1周后，根据幼苗的大小，施用浓度为0.1-0.3％的复合肥，每7～10天喷一次杀菌剂；试管苗第二次移栽后，及时掐去顶芽以促进侧芽的生长。
4.一种油用牡丹组织培养改良的基本培养基，其特征在于，培养基包括分化培养基和生根培养基，上述两种培养基都以MS为基本培养基，分化培养基是由BA即苄氨基腺嘌呤、NM即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，BA为1mg，NAA为0.05mg，L-脯氨酸为500mg、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为5500mg；生根培养基是由NAA即a-萘乙酸、L-脯氨酸、L-谷氨酰胺、水解酪蛋白、蔗糖以及琼脂粉溶解于基本培养基MS中而成的，其各组分的用量：MS为1L，NM为0.2mg，L-脯氨酸为500MG、L-谷氨酰胺为500MG、水解酪蛋白为200MG、蔗糖为3000mg，琼脂粉为550mg；分化培养基和生根培养基还包括一水硫酸锰22.3mg、七水硫酸锌8.6mg、硼酸6.2mg、二水钼酸钠0.025mg、五水硫酸铜0.025mg、六水氯化钴0.025mg、钠盐37.3mg、七水硫酸亚铁27.8mg、碘化钾0.83mg；植物生长调节剂：苄基腺嘌呤0.35mg、萘乙酸0.25mg。
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