CN102084812A

CN102084812A - 牡丹组织培养诱导成芽的方法

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Publication number: CN102084812A
Application number: CN2009102001243A
Authority: CN
Inventors: 殷丽青; 胡永红; 王新其; 黄卫昌
Original assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Shanghai Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2009-12-08
Filing date: 2009-12-08
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2029-12-08
Also published as: CN102084812B

Abstract

本发明涉及一种牡丹组织培养诱导成芽的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：a、用杀菌剂将牡丹植株处理后用基质填充，用塑料膜保湿并冷藏；b、待牡丹即将解除休眠时，取其鳞芽剥去外层包叶后灭菌，并用无菌水冲洗；c、在无菌环境下，剥开鳞芽，切掉其基部2-4张芽内小叶片和芽内上部叶的叶尖部分，将其余部分接种于固体培养基中培养；d、将接种后的外植体置于培养温度为25±2℃、并具有一定光照条件的环境下培养形成无菌芽。本发明具有灭菌容易，杂菌污染少，可快速获得牡丹无菌芽的特点。

Description

牡丹组织培养诱导成芽的方法

技术领域：

本发明涉及植物组织培养的技术领域，具体地说是一种牡丹组织培养诱导成芽的方法。

背景技术：

牡丹(Paeonia Suffruticosa)系芍药科、芍药属多年生灌木，是我国传统名花，雍容华贵、富丽堂皇，深受我国广大人民的喜爱。由于牡丹传统的繁殖方法存在结实率低、种子变异性强、无性繁殖系数低等问题，目前，我国的牡丹生产还很难满足日益增长的社会需求，繁殖方法的滞后也限制了牡丹种质资源保存及新品种选育工作的进展。

利用植物组织培养技术，可在一定时间内，从一个外植体离体培养繁殖出比常规传统繁殖多几百倍甚至千万倍与母体性状相似的小植株。有关牡丹组织培养的研究也有过一些报道，陈怡平等以紫斑牡丹不同外植体为材料进行组织培养，包括胚、上胚轴、腋芽、顶芽、土芽、叶片、叶柄、心皮、花药等，结果认为土芽的愈伤组织诱导率最高。Margherita Beruto等的研究表明，带有展开叶片的芽比仅具有幼叶原基的芽更容易启动组培过程。张子学等进行了凤丹组织培养研究，采用种子、种胚以及由此产生的子叶、叶柄、叶片和愈伤组织等作为外植体进行芽的诱导，发现采用胚培养可以打破上胚轴休眠，大大缩短初代培养周期。孟军等分析认为，土芽的组织分化程度最低，最容易脱分化产生愈伤组织，是最理想的外植体材料。

目前，牡丹组织培养中，经常要用氯化汞对外植体进行灭菌处理，对人和环境存在很大安全隐患，还存在外植体容易污染灭菌困难、培养物容易发生褐化而死亡、愈伤组织分化成芽难及培养周期长等问题(一般，从牡丹外植体诱导愈伤组织，再由愈伤组织分化芽需要60天以上)，影响了牡丹组织培养的研究进展。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种改进的牡丹组织培养诱导成芽的方法，它可克服现有技术中外植体容易污染灭菌困难、培养物容易发生褐化而死亡、愈伤组织分化成芽难及培养周期长的一些不足。

为了实现上述目的，本发明的技术方案是：

使用时本发明先行进行植株处理，再取鳞芽作外植体进行组织培养，灭菌容易，杂菌污染少，可快速获得牡丹无菌芽。本发明对牡丹离体快速繁殖进程具有促进作用。

具体实施方式：

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

本发明所述的方法包括如下步骤：a、用杀菌剂将牡丹植株处理后用基质填充，用塑料膜保湿并冷藏；b、待牡丹即将解除休眠时，取其鳞芽剥去外层包叶后灭菌，并用无菌水冲洗；c、在无菌环境下，剥开鳞芽，切掉其基部2-4张芽内小叶片和芽内上部叶的叶尖部分，将其余部分接种于固体培养基中培养；d、将接种后的外植体置于培养温度为25±2℃、并具有一定光照条件的环境下培养形成无菌芽。

a步骤中，用木屑和苔藓作填充基质，用杀菌剂对基质进行消毒处理，并保持55％-65％的湿度，用百菌清杀菌剂溶液将待处理植株整株浸泡后捞出凉干，将牡丹植株2～3株为一组捆绑后置于塑料袋中，植株四周用消毒好的基质填充，将牡丹植株移至冷库或冰箱内冷藏，冷藏温度为0～-2℃，冷藏时间为15-30天。

b步骤中，牡丹解除休眠的时间为15-30天，其中重瓣花牡丹需冷藏时间长，单瓣花牡丹需冷藏时间短，取健壮鳞芽，剥去外面2层鳞片，用75％酒精处理40秒，再用饱和漂白粉液或10％-15％的活性氯浓度为5.2％的次氯酸钠液灭菌15-25分钟，用无菌水冲洗4-5次。

c步骤中，固体培养基中各成分的重量百分比为：0.0825～0.1650％的硝酸铵、0.10～0.2％的硝酸钾、0.04～0.05％的氯化钙、0.03～0.04％的硫酸镁、0.010～0.02％的磷酸二氢钾、0.0278～0.0556％的硝酸钙；0.003～0.004％的乙二氨四乙酸二钠、0.002～0.003％的硫酸亚铁、0.002～0.003％的硫酸锰、0.0008～0.0010％的硫酸锌、0.0006～0.0007％的硼酸、0.00008～0.00010％的碘化钾、0.000025～0.00003％的钼酸钠、0.0000025～0.000003％的硫酸铜、0.0000025～0.000003％的氯化钴、0.01～0.02％的肌醇、0.00005～0.00006％的维生素B1、0.00005～0.00006％的烟酸、0.00005～0.00006％的维生素B6、0.0002～0.0003％的甘氨酸、0.05～0.1％的水解乳蛋白、3～4％的蔗糖、0.65～0.7％的琼脂、0.00015～0.00030％的6-苄氨基嘌呤、0.00002～0.00004％的萘乙酸、0.00003～0.00006％的赤霉素、0.08～0.2％的聚乙烯聚吡咯烷酮或0.05-1.0％的聚乙烯聚吡咯烷酮和0.05～0.1％的活性碳，余量为水，各成分的重量百分比之和为100％，固体培养基的pH值为5.8-6.0。

d步骤中，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间12小时/天。

本发明的牡丹组织培养诱导成芽的方法有如下优点：

1、先行进行植株处理，再取鳞芽作外植体组织培养，灭菌容易，杂菌污染少。

2、用75％酒精处理外植体后，再用饱和漂白粉液或10％～15％的活性氯浓度为5.2％的次氯酸钠液灭菌，对人体健康和环境安全危害小。

3、用本发明进行牡丹组织培养，外植体很少发生污染，无菌芽分化率高、分化速度快，有利于对牡丹进行下一步的继代培养操作。

4、利用低温处理与赤霉素联合作用，打破牡丹鳞芽休眠，可快速诱导牡丹无菌芽。

实施例

在牡丹萌芽前，将其从田间挖出，去尽泥土，剪去植株的病、残根、病、残枝和无芽枝，用百菌清杀菌剂溶液将待处理植株整株浸泡后捞出凉干，以苔藓和木屑作冷藏基质，用浇灌方式消毒，一边浇灌一边搅拌，将百菌清杀菌剂溶液与基质彻底拌匀，并保持基质湿度为60％。先在塑料袋底部放少量基质，再将牡丹植株2～3株为一组捆绑后置于其中，以免牡丹芽受伤，植株四周用消毒好的基质填充，以免植株失水干枯，然后扎紧袋口，在塑料袋四周均匀扎4个0.5～1.0cm的通气孔；最后将牡丹植株移至冷库或冰箱内冷藏。冷藏温度为0℃，冷藏时间为15天。

然后取健壮鳞芽，剥去外面2层鳞片，用75％酒精处理40秒，再用饱和漂白粉液或10％的活性氯浓度为5.2％的次氯酸钠液灭菌15分钟，用无菌水冲洗4次，然后，在无菌环境下，剥开鳞芽，切掉其基部2张芽内小叶片和芽上部叶的叶尖组织(若有芽内小花蕾形成的也要将其切除)，最后将其余部分(0.5~0.7cm)接种于无菌芽诱导培养基。基本培养基为MS培养基(Murashige & Skoog于1962年研制)，进行部分成分改良，具体如下：

无机盐大量元素：

硝酸铵(NH4NO3)0.0825％、硝酸钾(KNO3)0.19％、氯化钙(CaCl2·2H2O)0.044％、硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.037％、磷酸二氢钾(KH2PO4)0.017％、硝酸钙(Ca(NO3)2·4H2O)0.0556％、乙二氨四乙酸二钠Na2一EDTA 0.00373％、硫酸亚铁FeSO4·7H2O0.00278％；

无机盐微量元素：

硫酸锰(MnSO4·4H2O)0.00223％、硫酸锌(ZnSO4·7H2O)0.00086％、硼酸(H3BO3)0.00062％、碘化钾(KI)0.000083％、钼酸钠(Na2MoO·2H2O)0.000025％、硫酸铜(CuSO4·5H2O)0.0000025％、氯化钴(CoCl2·6H2O)0.0000025％；

有机物：

肌醇0.01％、维生素B1 0.00005％、烟酸0.00005％、维生素B6 0.00005％、甘氨酸0.0002％、水解乳蛋白0.05~0.1％；

植物生长调节剂：

6-苄氨基嘌呤(6-BA)0.00030％、萘乙酸(NAA)0.00004％、赤霉素(GA3)0.00006％；

其他：

蔗糖4％、琼脂0.65％、聚乙烯聚吡咯烷酮1.0％和活性碳0.1％合用，最后加水至100％。培养基的pH值为5.8~6.0。

最后，将接种后的外植体置于培养温度为25℃、光照强度2500Lx，光照时间12小时/天的环境下培养诱导无菌芽。

采用本方法接种了洛阳红、太平红等25多个牡丹品种，外植体培养5~8天即可直接分化出芽，外植体很少发生污染，无菌芽分化率高；培养物长势壮、生长快。(参见附表)

Claims

1.一种牡丹组织培养诱导成芽的方法，其特征在于：所述的方法包括如下步骤：a、用杀菌剂将牡丹植株处理后用基质填充，用塑料膜保湿并冷藏；b、待牡丹即将解除休眠时，取其鳞芽剥去外层包叶后灭菌，并用无菌水冲洗；c、在无菌环境下，剥开鳞芽，切掉其基部2-4张芽内小叶片和芽内上部叶的叶尖部分，将其余部分接种于固体培养基中培养；d、将接种后的外植体置于培养温度为25±2℃、并具有一定光照条件的环境下培养形成无菌芽。

2.根据权利要求1所述的一种牡丹组织培养诱导成芽的方法，其特征在于：a步骤中，用木屑和苔藓作填充基质，用杀菌剂对基质进行消毒处理，并保持55％-65％的湿度，用百菌清杀菌剂溶液将待处理植株整株浸泡后捞出凉干，将牡丹植株2～3株为一组捆绑后置于塑料袋中，植株四周用消毒好的基质填充，将牡丹植株移至冷库或冰箱内冷藏，冷藏温度为0～-2℃，冷藏时间为15-30天。

3.根据权利要求1所述的一种牡丹组织培养诱导成芽的方法，其特征在于：b步骤中，牡丹解除休眠的时间为15-30天，取健壮鳞芽，剥去外面2层鳞片，用75％酒精处理40秒，再用饱和漂白粉液或10％-15％的活性氯浓度为5.2％的次氯酸钠液灭菌15-25分钟，用无菌水冲洗4-5次。

4.根据权利要求1所述的一种牡丹组织培养诱导成芽的方法，其特征在于：c步骤中，固体培养基中各成分的重量百分比为：0.0825～0.1650％的硝酸铵、0.10～0.2％的硝酸钾、0.04～0.05％的氯化钙、0.03～0.04％的硫酸镁、0.010～0.02％的磷酸二氢钾、0.0278～0.0556％的硝酸钙；0.003～0.004％的乙二氨四乙酸二钠、0.002～0.003％的硫酸亚铁、0.002～0.003％的硫酸锰、0.0008～0.0010％的硫酸锌、0.0006～0.0007％的硼酸、0.00008～0.00010％的碘化钾、0.000025～0.00003％的钼酸钠、0.0000025～0.000003％的硫酸铜、0.0000025～0.000003％的氯化钴、0.01～0.02％的肌醇、0.00005～0.00006％的维生素B1、0.00005～0.00006％的烟酸、0.00005～0.00006％的维生素B6、0.0002～0.0003％的甘氨酸、0.05～0.1％的水解乳蛋白、3～4％的蔗糖、0.65～0.7％的琼脂、0.00015～0.00030％的6-苄氨基嘌呤、0.00002～0.00004％的萘乙酸、0.00003～0.00006％的赤霉素、0.08～0.2％的聚乙烯聚吡咯烷酮或0.05-1.0％的聚乙烯聚吡咯烷酮和0.05～0.1％的活性碳，余量为水，各成分的重量百分比之和为100％，固体培养基的pH值为5.8～6.0。

5.根据权利要求1所述的一种牡丹组织培养诱导成芽的方法，其特征在于：d步骤中，光照强度2000Lx～3000Lx，光照时间12小时/天。