CN106106083A - 一种白芨微球茎的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效生产白芨微球茎的方法，包括如下操作步骤：（1）材料的选取；（2）果荚的储存；（3）培养基的配制；（4）灭菌处理；（5）种子的接入；（6）微球茎的诱导；（7）练苗；（8）大棚培养基质的配制；（9）培养盘的准备；（10）微球茎的培养；（11）水肥管理；（12）微球茎的包衣、贮藏。该方法繁殖速度快，成活率可达90%以上，生产效率高，生产成本低，能周年工厂化生产；生产出来的白芨微球茎具有无病毒、体积小、贮藏运输方便特点，是一项具有产业前景，能从根本上解决白芨资源匮乏等问题。

Description

一种白芨微球茎的制备方法

技术领域

本发明涉及种植方法，尤其是一种白芨微球茎的制备方法。

背景技术

白芨（Bletilla striata (Thunb.ex A.Murray)Rchb.f）为一味常用中药材，白芨具有较好的收敛止血，消肿生肌功效。野生白芨日趋枯竭，主要靠人工种植来满足市场；虽然白芨有大量种子，但种子寿命短没有营养贮备，萌发条件苛刻，幼苗期较长，对环境敏感，白芨的种子非常细小且无胚乳，因此在自然状况下很难萌发和生长，实生苗的栽培较为困难，传统栽培主要靠分株繁殖。

发明内容

针对现有技术的不足之处，本发明旨在提供一种高效生产白芨微球茎的方法，

包括如下操作步骤：

1）选取发育饱满成熟的白芨果荚，将采摘的白芨果荚进行真空包装后放入冰箱中2-4℃保存代用；

2）播种前先用75％的酒精将果荚浸泡2分钟，再用自来水清洗果荚5次后，时间5-10分钟，再把果荚放入0.1 %的HgCl2溶液中灭菌5 min，然后用无菌水冲洗6～8 min，至少冲洗5次，然后放入已经消毒的吸水纸中吸干果荚表皮水分，置于无菌容器内；

3）播种时，用消毒过的镊子剖开果荚轻蘸种子使其疏松，然后将白芨种子均匀铺洒在种子萌发培养基中，培养基为MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3%蔗糖+0.7 %琼脂，培养40-50日后得到具有两片叶子的白芨种苗，培养条件为光照时间12h/d，光照强度1000-3000lx，温度为23—26℃；

4）将已具有两片叶子的白芨种苗从种子萌发培养基中去出，再移栽到微球茎诱导培养基中，培养基成分为的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.8 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.8 mg/L、糖浓度为3 %，诱导培养基的肌醇浓度提高到500 mg/L，培养45天后得到基部带有微球茎的白芨种苗，培养条件为光照时间为12 h/d，光照强度1000-3000lx，温度为23—26℃；

5）将基部带有微球茎的白芨种苗培养瓶移至大棚中，打开封口膜，在常温下练苗4-5日后移栽到大棚培养基质进一步培养，培养时间2-3个月；

6）白芨种苗在大棚中培养直至倒苗后，将白芨种茎去除洗净，去除须根，保留球茎部分，并将获取的微球茎放入到0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5—8min，然后放入到活性炭: 滑石粉: 多菌灵比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.1 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.1mg/L、赤霉素GA3浓度为 0.1mg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤3次操作，放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5—7min取出置于空气中固化10-15min，再将已固化的微球茎放入0.4g/L氯化钙溶液中侵泡1-2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装贮藏。

本发明中白芨微球茎是指在组织培养条件下，以种子为原材料直接接入到培养基中进行萌发培养，45日后得到具有两片叶子的白芨种苗，在将种苗取出接入到微球茎培养基中进一步培养，45天后得到基部带有微球茎的白芨种苗，再将白芨种苗移栽到大棚培养基质中培养直至倒苗后取出，去除根部洗净即可得到白芨微球茎。

该方法繁殖速度快，生产效率高，生产成本低，能周年工厂化生产；生产出来的白芨微球茎具有无病毒、体积小、贮藏运输方便特点，是一项具有产业前景，能从根本上解决白芨资源匮乏等问题，成活率可达90%以上。

具体实施方式

施秉县中药材种苗繁育组培室。

1）材料的选取

以兰科植物白芨Bletilla striata（ Thunb.） Reichb.f.的果荚为原材料，胚龄不低与18周，选取健状无病菌果荚为培养诱导萌发出白芨组培种苗；

2）果荚的储存

白芨果荚摘取后，放在阴凉处放置7-8天，使果荚表面阴干变脆，按每10个一袋规格放入真空包装袋中进行真空包装，放入冰箱中储存，温度2-4℃；

3）培养基的配制

在配制MS培养基时，MS培养基为现有技术，含有MS培养基0.7 %琼脂，MS培养基pH 5.8～6.0，由于MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，所以将培养基中的各种成分配成浓缩母液，包括大量元素母液，微量元素，有机物母液，铁盐母液，除了大量元素母液为20倍浓缩液之外，其他均为100倍的浓度，冷藏待用，本次所用植物生长调节剂为萘乙酸NAA、6-苄氨基腺嘌呤6-BA、6-糖基氨基嘌呤6-糖基氨基嘌呤KT，均配制为1 mg/mL的溶液，冷藏留待量取；

在配制培养基时，用移液管量取每种母液适宜的量，称取相应的蔗糖，琼脂，蔗糖和琼脂，根据不同培养基的要求称取不同的量，用移液管量取设计培养基所需的植物生长调节剂量，搅拌均匀，定容至所需培养基容积，用电磁炉加热煮沸10 min左右以溶解琼脂，加热完毕后，加入蒸馏水定容，再用HCl和NaOH溶液调节pH值在5.8～6.0之间，分装进培养瓶，由于本次培养时间较长，因此每瓶倒置培养基溶液高度不低与30mm，用封口膜和胶圈密封培养瓶瓶口；

培养基倒好后，将培养瓶放入高压灭菌锅内灭菌，注意要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底完成；

当锅内温度达121 ℃，开始计时20 min，到时间后关闭电源，等灭菌锅压力降到常压后将培养瓶取出，放到指定位置冷却凝固后，即可放入培养基储存架上留待使用；

所述种子萌发培养基为MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %琼脂；

所述微球茎诱导培养基成分为的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.8 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.8 mg/L、糖浓度为3 %，诱导培养基的肌醇浓度提高到500 mg/L，

4）灭菌处理

在无菌操作台上，播种前先用75％的酒精将果荚浸泡2分钟，再用自来水清洗果荚5次后，时间不低与5分钟，再把果荚放入0.1 %的HgCl2溶液中灭菌5 min，然后用无菌水冲洗6～8 min，冲洗5次，每一步都要不停的摇动，使材料、消毒液与无菌水充分接触，目的是提高消毒效果以及让无菌水更好的去除残留的消毒剂，降低消毒剂对材料的毒害作用，对果荚进行消毒之后，将其放入已经消毒的吸水纸中吸干果荚表皮水分，置于无菌容器内备用，放置时间不宜过长，应立即使用，避免外界病菌再次侵入；

5）种子的接入

播种时，用消毒过的镊子剖开果荚轻蘸种子使其疏松，然后将白芨种子均匀铺洒在种子萌发培养基中，培养基为MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3 %蔗糖+0.7 %琼脂，培养45日后得到具有两片叶子的白芨种苗，培养条件为光照时间12 h/d，光照强度1000-3000lx，温度为23—26℃；

6）微球茎的诱导

将已具有两片叶子的白芨种苗从种子萌发培养基中去出，再移栽到微球茎诱导培养基中，培养基成分为的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.8 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.8 mg/L、糖浓度为3 %，诱导培养基的肌醇浓度提高到500 mg/L，培养45天后得到基部带有微球茎的白芨种苗，培养条件为光照时间为12 h/d，光照强度1000-3000lx，温度为23—26℃左右；

7）练苗

将基部已带有微球茎类型物的白芨种苗培养瓶移至大棚中，打开封口膜，在常温下练苗4-5日，练苗期间应注意观察，出现缺水时，应及时喷施无菌水，避免种苗出现脱水死亡；

8）大棚培养基质的配制

将椰糠、腐殖土、有机基质按体积2：1：1比例混合，加入上述混合物总重量10%的充分腐熟牛粪，反复翻动使其充分混合，用1000 倍50%多菌灵溶液浇透培养基质，放于阳光下爆晒10-15天，至培养基质变干，水份低于5%；

9）培养盘的准备

将培养基质放入盘体长54cm宽28cm穴深40mm口径25mmX25mm的穴盘中，轻轻压实后将培养基扒平，再用清水将基质充分浇透，盖上塑料薄膜保湿并防止异物进入；

10）微球茎的培养

将基部带有微球茎的白芨种苗移栽培养穴盘中，每穴1株，移栽过程中要轻拿轻放，避免损伤种苗，同时覆土厚度不宜过深，以刚好覆盖微球茎为准；

11）水肥管理

移栽后要第一时间喷施无菌水，注意保持土壤湿度，做到少施多次，以保持基质体积不萎缩、用力捻不出水为标准，每隔7-10日喷施一次叶面肥；

12）微球茎的包衣、贮藏

白芨种苗在大棚中培养直至倒苗后，将白芨种茎去除洗净，去除须根，保留球茎部分，选取直径为0.5-1.5cm的白芨种茎到0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5—8min，然后放入到活性炭: 滑石粉: 多菌灵比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.1 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.1mg/L、赤霉素GA3浓度为 0.1mg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤3次操作，放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5—7min取出置于空气中固化10-15min，再将已固化的微球茎放入0.4%氯化钙溶液中侵泡1-2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装贮藏，亦可直接用于大田生产。

Claims (1)

1.一种高效生产白芨微球茎的方法， 其特征在于包括如下操作步骤：

1）选取发育饱满成熟的白芨果荚，将采摘的白芨果荚进行真空包装后放入冰箱中2-4℃保存代用；

2）播种前先用75％的酒精将果荚浸泡2分钟，再用自来水清洗果荚5次后，时间5-10分钟，再把果荚放入0.1 %的HgCl2溶液中灭菌5 min，然后用无菌水冲洗6～8 min，至少冲洗5次，然后放入已经消毒的吸水纸中吸干果荚表皮水分，置于无菌容器内；

3）播种时，用消毒过的镊子剖开果荚轻蘸种子使其疏松，然后将白芨种子均匀铺洒在种子萌发培养基中，培养基为MS+萘乙酸NAA 1.0 mg/L+6-苄氨基腺嘌呤6-BA 1.0 mg/L+3%蔗糖+0.7 %琼脂，培养40-50日后得到具有两片叶子的白芨种苗，培养条件为光照时间12h/d，光照强度1000-3000lx，温度为23—26℃；

4）将已具有两片叶子的白芨种苗从种子萌发培养基中去出，再移栽到微球茎诱导培养基中，培养基成分为的6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.8 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.8 mg/L、糖浓度为3 %，诱导培养基的肌醇浓度提高到500 mg/L，培养45天后得到基部带有微球茎的白芨种苗，培养条件为光照时间为12 h/d，光照强度1000-3000lx，温度为23—26℃；

5）将基部带有微球茎的白芨种苗培养瓶移至大棚中，打开封口膜，在常温下练苗4-5日后移栽到大棚培养基质进一步培养，培养时间2-3个月；

6）白芨种苗在大棚中培养直至倒苗后，将白芨种茎去除洗净，去除须根，保留球茎部分，并将获取的微球茎放入到0.5%的高锰酸钾溶液中进行消毒5—8min，然后放入到活性炭: 滑石粉: 多菌灵比例为3:1:0.02的粉末中滚动3-5min，再喷洒6-糖基氨基嘌呤KT浓度为 0.1 mg/L、萘乙酸NAA浓度为 0.1mg/L、赤霉素GA3浓度为 0.1mg/L的1/2MS培养溶液，之后重复上述步骤3次操作，放入5%的褐藻酸钠溶液中侵泡5—7min取出置于空气中固化10-15min，再将已固化的微球茎放入0.4g/L氯化钙溶液中侵泡1-2min取出置于空气中固化后，即可用透气性良好的聚乙烯塑料袋包装贮藏。