CN105766636B - 一种牡丹组织培养再生的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种牡丹组织培养再生的方法，包括以下步骤：1)将牡丹种子用浓硫酸浸泡处理、冲洗并消毒；2)培养所述牡丹种子产生胚根，然后诱导愈伤组织及体细胞胚；3)所述体细胞胚再生形成次生体细胞胚团；4)将所述次生体细胞胚团分化形成子叶胚；5)所述子叶胚进一步分化形成不定根；6)将分化形成不定根的外植体炼苗并形成完整植株。使用本发明的方法，在炼苗1个月后，植株成活率可达到95％，叶8‑10片，高6‑10cm，可获得大批组培苗满足种植需要。此外，该方法育苗速度快、效率高、受季节和环境影响小，便于随时进行大规模育苗种植，在牡丹新品种改良中有重要应用。

Description

一种牡丹组织培养再生的方法
技术领域
本发明涉及一种花卉组织培养的方法，属于植物组织培养领域，尤其涉及一种牡丹组织培养再生的方法。
背景技术
牡丹(Paeonia suffruticosa)属毛茛科芍药属的多年生落叶小灌木。牡丹花色泽艳丽，素有“花中之王”的美誉。在栽培类型中，主要根据花的颜色，可分成上百个品种。牡丹是中国特有的木本名贵花卉，有数千年的自然生长和1500多年的人工栽培历史。在中国栽培甚广，并早已引种世界各地。
牡丹繁殖方法有分株、嫁接、播种等，但以分株及嫁接居多，播种方法多用于培育新品种。目前我国对于牡丹品种的培育主要是利用品种间杂交的模式进行，从而导致牡丹性状很难有突破性的改良。利用组织培养技术不仅能够快速繁育牡丹植株，更是牡丹新品种改良的新途径，但目前国内对于牡丹组织培养的研究尚处于起步阶段。
因此，本领域的技术人员致力于开发一种速度快、效率高、受环境和季节影响小且利于大规模育苗种植的牡丹组织培养新方法
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种速度快、效率高、受环境和季节影响小且利于大规模育苗种植的牡丹组织培养方法。
在本发明的较佳实施方式中，提供了一种牡丹组织培养再生的方法，包括以下步骤：
1)将牡丹种子用浓硫酸浸泡处理、冲洗并消毒；
2)培养所述牡丹种子产生胚根，然后诱导愈伤组织及体细胞胚；
3)所述体细胞胚再生形成次生体细胞胚团；
4)将所述次生体细胞胚团分化形成子叶胚；
5)所述子叶胚进一步分化形成不定根；
6)将分化形成不定根的外植体炼苗并形成完整植株。
进一步地，步骤1)具体为：选用椭圆形或卵状球形牡丹种子，3-5℃低温处理80-100天后，于20-28℃条件下用浓硫酸浸泡2-3分钟，用流水冲洗3-4遍后用次氯酸钠溶液消毒15-25分钟，之后在无菌条件下用无菌水清洗3-4遍，用无菌滤纸吸干水分。
优选地，从当年采收的种子中进行挑选。
优选地，相关条件为在4℃低温处理90天后，于25℃条件下用浓硫酸浸泡2-3分钟，用20％的次氯酸钠溶液消毒20分钟。
进一步地，步骤4)具体为：选择生长良好、表面光滑、黄绿色的、直径约为2.5-3.5mm的所述次生体细胞胚团转入分化培养基中进行培养，直到可观察到带有两片子叶的子叶胚。
优选地，选择直径约为3mm的次生体细胞胚团。
进一步地，上述次生体细胞胚团在所述分化培养基中培养的时间为2周。
进一步地，步骤6)具体为：当分化生根外植体长到高度约5-7cm的植物体时，将幼苗暴露于空气中炼苗5-7天，然后转入湿润的蛭石中，一周后，将植株移入温室大田中培养。
优选地，当分化生根外植体长到高度约6cm的植物体时，进行炼苗。转入湿润的蛭石中，需要浇氮肥一次，然后每天补充清水保湿。
进一步地，在温室大田中培养的条件为：温度20-25℃，空气湿度85％，每隔7天喷洒一次广谱杀菌剂。
进一步地，步骤2)中，牡丹种子在MSB培养基中培养13-15天，培养温度20-25℃，光照强度20000lux，每天光照15-17小时，诱导胚根生长；切取胚根置于诱导培养基中培养28-32天，诱导愈伤组织及体细胞胚生长。
优选地，所述牡丹种子在MSB培养基中培养14天，培养温度20-25℃，光照强度20000lux，每天光照16h，诱导胚根生长。切取胚根置于诱导培养基中培养30天，诱导愈伤组织及体细胞胚生长。
进一步地，步骤3)中，将步骤2)中获得的表面光滑、颜色黄绿的体细胞胚从愈伤组织团上取下，并置于继代培养基中增殖培养19-21天，形成所述次生体细胞胚团。
优选地，在继代培养基中培养20天。
进一步地，步骤5)具体为：将所述子叶胚放在表面铺有滤纸的分化培养基平皿中，黑暗培养3-7天后将干燥的所述子叶胚移入生根培养基中进行分化形成不定根。
进一步地，诱导愈伤组织使用的诱导培养基组分为：蔗糖30g/L，MSB 4.44g/L，2,4-D 40mg/L，凝胶2g/L，pH值7.0；
所述体细胞胚再生形成次生体细胞胚使用的继代培养基组分为：蔗糖30、60g/L，MSB 4.44g/L,凝胶2g/L，2,4-D 20mg/L，pH值7.0；
所述次生体细胞胚团分化形成子叶胚使用的分化培养基组分为：MSB 4.44g/L,麦芽糖60g/L，活性炭5g/L，2g/L凝胶，pH值5.7；
所述子叶胚进一步分化形成不定根使用的生根培养基组分为：MSB 4.44g/L,蔗糖30g/L，2g/L凝胶，pH值5.7。
在上述方法中，体细胞胚团在分化培养基中的培养时间对于其后来是否能够成长为完整植株起着重要作用，培养时间过短则子叶胚未能完全形成，培养时间过长则使之在子叶胚阶段停留时间过长造成子叶胚褐化。另外，将种子置于低温条件下90天，能有效地打破种子上胚轴休眠状态后，为后续培养产生胚根等提供良好的基础。并且，通过上述组织培养方法和具体参数的结合，在炼苗1个月后，植株成活率可达到95％，叶8-10片，高6-10cm。
利用本发明的方法，可获得大批组培苗满足种植需要，成活率达到95％。此外，本发明的组织培养的方法，育苗速度快、效率高。由于可以从种子出发，利用组织培养方法获得新植株，受季节和环境影响小，便于随时进行大规模育苗种植，在牡丹新品种改良中有重要应用。本发明的方法，还可以结合各种转基因的技术，进一步拓宽了在牡丹品种改良中的应用。
以下将对本发明的构思、具体步骤及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
具体实施方式中使用实际和材料，如无特殊说明，均可从市场上直接购买获得。
实施例1外植体材料的采集和处理
选择生长茂盛无病的植株，7月采集果皮呈蟹黄色的果实，置于室内自然阴干7天后收集种子，清除其中的瘪粒及杂质，留下饱满的种子。将种子置于4℃条件下90天，打破种子上胚轴休眠状态后，于25℃条件下用浓硫酸浸泡2-3分钟，用流水冲洗3-4遍后用20％的次氯酸钠溶液消毒20分钟，之后在无菌条件下用无菌水清洗3-4遍，用无菌滤纸吸干水分备用。
实施例2愈伤组织的诱导及分化、体细胞胚再生、子叶胚分化和不定根诱导
1)愈伤组织的诱导及分化：
将实施例1获得的消毒的牡丹种子接种于MSB培养基中，培养温度20-25℃，光照强度20000lux，每天光照16h，10天时胚根出现。待14天时切取胚根置于诱导培养基(蔗糖30g/L，MSB 4.44g/L，2,4-D 40mg/L，凝胶2g/L，pH值7.0)中，培养15天时开始出现愈伤组织，培养30天后，出现大团愈伤组织及体细胞胚。
2)体细胞胚再生：
将表面光滑、颜色黄绿的体细胞胚从愈伤组织团上取下，确保每个体细胞胚的底端尽量连有较少的组织，最大限度的降低体细胞的分化，同时保证体细胞胚的完整性。将诱导产生的体细胞胚置于继代培养基(蔗糖30、60g/L，MSB 4.44g/L,凝胶2g/L，2,4-D 20mg/L，pH值7.0)中增殖培养20天，体细胞胚团直径达到3mm。取直径约为3mm的具有再生能力的次生体细胞胚团再进行后续子叶胚分化步骤。
3)子叶胚分化：
将继代培养基中生长良好、表面光滑、黄绿色的体细胞胚团(约3mm)转入分化培养基(MSB 4.44g/L,麦芽糖60g/L，活性炭5g/L，2g/L凝胶，pH值5.7)中进行培养，2周后，体细胞胚团生长至5mm，且可观察到带有两片子叶的子叶胚。
4)不定根诱导：
将子叶胚放在表面铺有滤纸的分化培养基平皿中，黑暗培养3-7天后将干燥的子叶胚移入生根培养基(MSB 4.44g/L,蔗糖30g/L，2g/L凝胶，pH值5.7)中进行分化生根，20天时开始生根，40天时根达到3条以上、叶6片、高6cm的试管苗可用于炼苗。
实施例3完整植株再生及炼苗
当分化生根外植体长到高度约6cm的植物体时，将幼苗暴露于空气中炼苗5-7天。然后取出，将根部的培养基冲洗干净，转入含有湿润的蛭石的花盆中，浇氮肥一次后，每天补充清水保湿。控制培养条件为温度20-25℃，光照强度20000lux，每天光照16h。一周后，将植株移入温室大田中培养，培养条件为：温度20-25℃，空气湿度85％，每隔7天喷洒一次广谱杀菌剂，炼苗1个月后成活率达到95％，叶10片，高10cm。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (9)

1.一种牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将牡丹种子用浓硫酸浸泡处理、冲洗并消毒；
2)培养所述牡丹种子产生胚根，然后诱导愈伤组织及体细胞胚；
3)所述体细胞胚再生形成次生体细胞胚团；
4)将所述次生体细胞胚团分化形成子叶胚；
5)所述子叶胚进一步分化形成不定根；
6)将分化形成不定根的外植体炼苗并形成完整植株；
诱导愈伤组织使用的诱导培养基组分为：蔗糖30g/L，MSB 4.44g/L，2,4-D 40mg/L，凝胶2g/L，pH值7.0；
所述体细胞胚再生形成次生体细胞胚团使用的继代培养基组分为：蔗糖30g/L或60g/L，MSB 4.44g/L,凝胶2g/L，2,4-D 20mg/L，pH值7.0；
所述次生体细胞胚团分化形成子叶胚使用的分化培养基组分为：MSB 4.44g/L,麦芽糖60g/L，活性炭5g/L，2g/L凝胶，pH值5.7；
所述子叶胚进一步分化形成不定根使用的生根培养基组分为：MSB 4.44g/L,蔗糖30g/L，2g/L凝胶，pH值5.7。
2.如权利要求1所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，步骤1)具体为：选用椭圆形或卵状球形牡丹种子，3-5℃低温处理80-100天后，于20-28℃条件下用浓硫酸浸泡2-3分钟，用流水冲洗3-4遍后用次氯酸钠溶液消毒15-25分钟，之后在无菌条件下用无菌水清洗3-4遍，用无菌滤纸吸干水分。
3.如权利要求1所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，步骤4)具体为：选择生长良好、表面光滑、黄绿色的、直径为2.5-3.5mm的所述次生体细胞胚团转入分化培养基中进行培养，直到可观察到带有两片子叶的子叶胚。
4.如权利要求3所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，所述次生体细胞胚团在所述分化培养基中培养的时间为2周。
5.如权利要求1所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，步骤6)具体为：当分化生根外植体长到高度5-7cm的植物体时，将幼苗暴露于空气中炼苗5-7天，然后转入湿润的蛭石中，一周后，将植株移入温室大田中培养。
6.如权利要求5所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，在所述温室大田中培养的条件为：温度20-25℃，空气湿度85％，每隔7天喷洒一次广谱杀菌剂。
7.如权利要求1所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，步骤2)中，所述牡丹种子在MSB培养基中培养13-15天，培养温度20-25℃，光照强度20000lux，每天光照15-17小时，诱导胚根生长；切取胚根置于诱导培养基中培养28-32天，诱导愈伤组织及体细胞胚生长。
8.如权利要求1所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，步骤3)中，将步骤2)中获得的表面光滑、颜色黄绿的体细胞胚从愈伤组织团上取下，并置于继代培养基中增殖培养19-21天，形成所述次生体细胞胚团。
9.如权利要求1所述的牡丹组织培养再生的方法，其特征在于，步骤5)具体为：将所述子叶胚放在表面铺有滤纸的分化培养基平皿中，黑暗培养3-7天后将干燥的所述子叶胚移入生根培养基中进行分化形成不定根。
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