CN109258478A - 多花黄精的组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种多花黄精的组培繁殖方法，包括以下步骤：在无菌环境中，剥取成熟的多花黄精种子中的种胚，对所述种胚进行灭菌处理；将灭菌后的所述种胚接种于愈伤组织诱导培养基中，无光培养7～12天，种胚膨大形成愈伤组织；将所述愈伤组织分割成小块，接种到愈伤组织继代培养基上，于光照强度为800lux～1000lux、每日光照时间为10h～12h条件下，培养18～25天；将经过所述步骤S3继代培养的愈伤组织分割成小块，接种到出芽培养基上，于光照强度为1200lux～1800lux、每日光照时间为10h～12h条件下，培养28～35天，诱导形成丛生芽；取所述丛生芽中的键壮、单个芽接种到生根培养基上，进行生根培养。该方法可以大大减少组培操作过程中的污染率、提高繁殖效率和种苗质量。
Description
技术领域
本发明涉及药用植物育苗领域，特别是涉及一种多花黄精的组培繁殖方法。
背景技术
多花黄精(Polygonatum cyrtonema)是百合科黄精属多年生草本植物，其根状茎肥厚，为2015版《中国药典》中记载黄精药材的基源植物之一，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾等功效。多花黄精口感好，既可药用又可食用，近期研究发现多花黄精在恶性肿瘤治疗方面亦有成效，因此，该药材的市场需求日渐增长，栽种面积也逐年增加。
多花黄精的栽培管理粗放，常采用野生变家种的方式引种栽培，而多花黄精的生长地理区域有多种其他黄精属植物，这些植物与多花黄精在形态上极易混淆，引种栽培时常不区分物种基源，常导致多花黄精的品质参差不齐，许多地区种植的多花黄精多糖含量达不到药典的规定。随种植面积的扩大，多花黄精的优质种苗供不应求，种源的纯净及供应量已成为该药材种植应用的关键问题。
传统的多花黄精主要采用种子繁殖和根茎繁殖，但是由于种子成熟后具有较长的休眠期，自然发芽率低且种子萌芽生长缓慢，从播种到种苗出售至少3年时间，周期长、效率低，而根茎繁殖不但种根茎用量大，不经济，且多代繁殖后种质退化比较严重，易感染病毒，不便栽培推广。组培是植物进行快速、大量繁育的良好办法，该方法不受自然环境的约束，且组培苗经历了脱毒过程，种植的植物极少发生病毒病。目前，关于黄精组培快繁多为器官发生途径，采用如种子、叶片、芽头和块茎等作外植体，经愈伤诱导、出芽诱导和根诱导培养分化出完整的植株。然而采用叶片、芽头和块茎等做外植体极易污染，大大增加了组培的周期和成本；种子中由于含有大量淀粉等营养成分，其分生能力并不强，在传统组培愈伤组织诱导过程中仍比较困难，前人报道的种子组培仅通过种子在培养基上萌发，并不是真正意义上经历脱分化、再分化的组培方法。
发明内容
基于此，有必要提供一种多花黄精的组培繁殖方法，可以大大减少组培操作过程中的污染率、提高繁殖效率。
一种多花黄精的组培繁殖方法，包括以下步骤：
S1：在无菌环境中，剥取成熟的多花黄精种子中的种胚，对所述种胚进行灭菌处理；
S2：将灭菌后的所述种胚接种于愈伤组织诱导培养基中，无光培养7～12天，种胚膨大形成愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.5mg/L～2.2mg/L 6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA；
S3：将所述愈伤组织分割成小块，接种到愈伤组织继代培养基上，于光照强度800lux～1200lux下培养18～25天；所述愈伤组织继代培养基的配方为MS+1.8mg/L～2.5mg/L 6-BA+0.15mg/L～0.25mg/L NAA+3wt％～8wt％香蕉泥；
S4：将经过所述步骤S3继代培养的愈伤组织分割成小块，接种到出芽培养基上，于光照强度为1200lux～1800lux、每日光照时间为10h～12h条件下，培养28～35天，诱导形成丛生芽；所述出芽培养基的配方为MS+1.5mg/L～2.0mg/L6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA+3wt％～8wt％土豆泥；
S5：取所述丛生芽中的键壮、单个芽接种到生根培养基上，进行生根培养。
值得说明的是，所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.5mg/L～2.2mg/L 6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA，是指1升MS基本培养基中添加有1.5mg/L～2.2mg/L的6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)和0.1mg/L～0.2mg/L的NAA(萘乙酸)；所述愈伤组织继代培养基的配方为MS+1.8mg/L～2.5mg/L 6-BA+0.15mg/L～0.25mg/L NAA+3wt％～8wt％香蕉泥，是指是指1升MS基本培养基中添加有1.8mg/L～2.5mg/L的6-BA、0.15mg/L～0.25mg/L的NAA和3g～8g香蕉泥；所述出芽培养基的配方为MS+1.5mg/L～2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA+3wt％～8wt％土豆泥，是指1升MS基本培养基中添加有1.5mg/L～2.0mg/L的6-BA、0.1mg/L～0.2mg/L的NAA和3g～8g土豆泥。
上述多花黄精的组培繁殖方法，以成熟种子的种胚为外植体，易于灭菌、污染率低，且分生能力强，易于愈伤组织和丛生芽的诱导；种胚经过脱分化诱导愈伤组织、扩大愈伤组织培养、诱导分化丛生芽和生根成苗，并在组培各步骤中的通过光照条件和培养基的配合，可以促进种胚脱分化形成愈伤组织、愈伤组织的增殖、以及丛生芽的分化培养和生根，提高了多花黄精的繁殖效率和种苗质量。
在其中一个实施例中，所述生根培养的光照强度为8000lux～12000lux，每日光照时间10h～12h。在该光照强度和光照时间下进行生根培养，可以促进组培苗生根的同时，可以保证组培苗能有足够光照进行光合作用，培养28～35天，幼苗根系发达，所得种苗更加键状，易于后续移栽成活。
进一步地，所述生根培养的光照强度为10000lux，每日光照时间12h。
在其中一个实施例中，所述愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。
在其中一个实施例中，所述继代培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+5wt％香蕉泥。
在其中一个实施例中，所述出芽培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+5wt％土豆泥。
在其中一个实施例中，所述生根培养基为1/2MS+0.6mg/L IBA(吲哚丁酸)。
在其中一个实施例中，所述灭菌处理的方法为：将所述种胚置于0.1wt％升汞溶液中浸泡灭菌5min～9min，再用无菌水冲洗6～10次。
如此，可以充分灭菌，又不至于因灭菌过渡导致种胚损伤，避免在外植体诱导愈伤组织的过程中出现白化现象，无法形成愈伤组织。
在其中一个实施例中，在所述剥取成熟的多花黄精种子中的种胚的步骤之前，还包括对所述成熟的多花黄精种子的预处理：将所述种子置于清水中浸泡20～28小时后，按照组培外植体常规灭菌方法进行灭菌处理。
如此通过对种子进行灭菌处理，可以避免剥取种胚时对种胚造成污染，且经过外植体的两次灭菌处理，可以进一步降低污染率。
在其中一个实施例中，所述成熟的多花黄精种子为于多花黄精种子成熟期采集的新鲜成熟果实，采集后渥堆1周左右，待果皮轻微腐烂后洗净果肉，收集成熟饱满的种子，于清水中浸泡24小时左右，期间换水4次，然后冲洗干净。
在其中一个实施例中，在所述组培繁殖过程中，温度为23℃～25℃，空气相对湿度为40％～50％。
在其中一个实施例中，将所述经过所述步骤S3继代培养的愈伤组织重复步骤S3的培养，形成大量愈伤组织。
由于外植体来源不同，存在内源激素含量差异大、细胞分化程度不同、外植体带菌情况相差迥异等情况，因此，采用不同外植体进行组织培养的过程中，所需要控制的条件往往相差很大，而且上一步骤对下一步骤影响巨大，稍有不慎，可能满盘皆输。
与传统多花黄精的育苗方法相比，本发明具有以下有益效果：
(1)采用成熟种子的种胚做外植体具有分生能力强、愈伤组织分化率高，易于灭菌处理，接种后不易污染，较幼胚、芽头、叶片等外植体能够明显降低污染率。
(2)种胚愈伤组织诱导和继代增殖过程中分别采用暗培养和弱光培养，利于愈伤组织的诱导和扩大增殖，同时在愈伤组织继代培养基中添加适量的香蕉泥，能够明显的促进愈伤组织增殖，且增殖后的愈伤组织极易分化出芽点；丛生芽诱导过程中提高光照强度至1500lux和光照时间12小时左右，同时在出芽培养基中添加适量的土豆泥能够明显促进丛生芽的分化生成，丛生芽的分化率高，进而在适宜的光照条件下进行生根培养，促进生根的同时保证光合作用所需的光照，生根培养30天左右的种苗根系生长旺盛、植株健壮，且已有0.5cm左右的块茎，移栽大田后易于成活、并且成活后生长速度快。
(3)采用本发明方法进行多花黄精的种苗繁殖，污染率低、繁殖系数高，取一次种胚即可持续不断的大量繁殖幼苗，大大节约了经济成本。
(4)本发明方法均在室内进行，不受季节限制，且3个月左右即可成苗，大大缩短了繁育时间。
附图说明
图1为本发明实施例1经愈伤组织继代培养后带芽的愈伤组织的图；
图2为本发明实施例1愈伤组织经出芽培养分化出的丛生芽的图；
图3为本发明实施例1的芽进行生根培养后的图；
图4为对比例1的芽进行生根培养后的图；
图5为对比例2的愈伤组织继代培养20天时的图；
图6为对比例3丛生芽出芽培养30天时的图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述，并给出了本发明的较佳实施例。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明人分别采用了多花黄精的未成熟种子、成熟种子、未成熟种子的幼胚、成熟种子的种胚和叶片为外植体，按照植物组织培养的常规灭菌方法，对前述外植体进行灭菌处理后，接种于MS基本培养中进行大量的灭菌效果和外植体成活试验，结果显示，叶片和幼胚都极易白化，如果在保证叶片或者幼胚未白化的前提下，则5天之内污染率达到80％以上，而未成熟种子和成熟种子难以诱导出愈伤组织，且愈伤组织熟松，不易诱导出芽；而成熟种子的种胚外植体成活率高，污染率可以控制在20％以内，且未污染的种胚易于分化。
以下为具体实施例
实施例1
1、准备种胚：于9月中旬采集多花黄精成熟果实，渥堆1周，待果皮稍腐烂后用清水洗净果肉。种子于清水中浸泡24小时，期间换水4次。流水冲洗种子5min，再用0.1％HgCl2浸泡5～8min，无菌水冲洗干净后用无菌滤纸吸干种子表面水分，将处理好的种子用解剖剪剪开，取出种胚。
2、种胚的灭菌：用0.1％HgCl2浸泡种胚8min，最后用无菌水冲洗8次。
3、种胚接种与愈伤组织诱导：灭菌后的种胚接种于制备好的培养基上，培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L，每瓶接种4～5个。置于温度为23℃～25℃，空气相对湿度为40％～50％的无光照培养架上，培养10天，可见淡黄色愈伤组织。
4、愈伤组织继代培养：以步骤3诱导出的愈伤组织为材料，将其切成0.3cm～0.5cm的小块，接种到继代培养基上，继代培养基的配方为：MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.2mg/L+5wt％香蕉泥，每瓶接种2～3个。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，光照强度为800lux，培养20天左右，可见淡黄色愈伤组织明显增大，且有大量绿色芽点出现。
5、丛生芽的诱导：取愈伤组织切成0.3cm～0.5cm的小块，接种到培养基上，培养基的配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+5wt％土豆泥，每瓶接种1～2个。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，光照强度为1500lux，每日光照时间12h，培养至15天左右愈伤组织变绿，培养30天左右大量丛生芽长出，如图2所示，愈伤组织分化出大量丛生芽，每块愈伤组织上有5～8个芽。
6、生根培养：将丛生芽分开，取健壮单个根茎芽接种到生根培养基上，培养基配方为：1/2MS+0.6mg/L IBA。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，组培架采用LED灯管做光源，光照强度为10000lux，每日光照时间12h，培养30天左右根生长旺盛，如图3所示，多花黄精苗绿健壮，并有0.5cm左右的块茎生成。
7、移栽成活：将生根状苗移栽大田，生长成苗，成活率高达100％。
实施例2
1、准备种胚：于10月上旬采集多花黄精成熟果实，渥堆1周，待果皮稍腐烂后用清水洗净果肉。种子于清水中浸泡24小时，期间换水4次。流水冲洗种子5min，再用0.1％HgCl2浸泡8min，无菌水冲洗干净后用无菌滤纸吸干种子表面水分，将处理好的种子用解剖剪剪开，取出种胚。
2、种胚的灭菌：用0.1％HgCl2浸泡种胚8min，最后用无菌水冲洗8次。
3、种胚接种与愈伤组织诱导：灭菌后的种胚接种于制备好的培养基上，培养基的配方为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA0.15mg/L，每瓶接种4～5个。置于温度为23℃～25℃，空气相对湿度为40％～50％的无光照培养架上，培养12天，可见淡黄色愈伤组织。
4、愈伤组织继代培养：以步骤3诱导出的愈伤组织为材料，将其切成0.3cm～0.5cm的小块，接种到继代培养基上，继代培养基的配方为：MS+6-BA1.8mg/L+NAA 0.2mg/L+8wt％香蕉泥，每瓶接种2～3个。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，光照强度为1000lux，培养23天左右，可见淡黄色愈伤组织明显增大，且有大量绿色芽点出现。
5、丛生芽的诱导：取愈伤组织切成0.3cm～0.5cm的小块，接种到培养基上，培养基的配方为：MS+6-BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/L+8wt％土豆泥，每瓶接种1～2个。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，光照强度为1300lux，每日光照时间12h，培养至17天左右愈伤组织变绿，培养34天左右大量丛生芽长出，愈伤组织分化出大量丛生芽，每块愈伤组织上有4～6个芽。
6、生根培养：将丛生芽分开，取健壮单个根茎芽接种到生根培养基上，培养基配方为：1/2MS+0.6mg/L IBA。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，组培架采用LED灯管做光源，光照强度为8000lux，每日光照时间14h，培养30天左右根生长旺盛，多花黄精苗绿健壮，并有0.4cm左右的块茎生成。
实施例3
1、准备种胚：于9月下旬采集多花黄精成熟果实，渥堆1周，待果皮稍腐烂后用清水洗净果肉。种子于清水中浸泡24小时，期间换水4次。流水冲洗种子5min，再用0.1％HgCl2浸泡5～8min，无菌水冲洗干净后用无菌滤纸吸干种子表面水分，将处理好的种子用解剖剪剪开，取出种胚。
2、种胚的灭菌：用0.1％HgCl2浸泡种胚6～7min，最后用无菌水冲洗8次。
3、种胚接种与愈伤组织诱导：灭菌后的种胚接种于制备好的培养基上，培养基的配方为：MS+6-BA 2.2mg/L+NAA 0.2mg/L，每瓶接种4～5个。置于温度为23℃～25℃，空气相对湿度为40％～50％的无光照培养架上，培养10天，可见淡黄色愈伤组织。
4、愈伤组织继代培养：以步骤3诱导出的愈伤组织为材料，将其切成0.3cm～0.5cm的小块，接种到继代培养基上，继代培养基的配方为：MS+6-BA 2.5mg/L+NAA 0.25mg/L+5wt％香蕉泥，每瓶接种2～3个。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，光照强度为1200lux，培养18天左右，可见淡黄色愈伤组织明显增大，且有大量绿色芽点出现。
5、丛生芽的诱导：取愈伤组织切成0.3cm～0.5cm的小块，接种到培养基上，培养基的配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+3wt％土豆泥，每瓶接种1～2个。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，光照强度为1800lux，每日光照时间10h，培养至12天左右愈伤组织变绿，培养30天左右大量丛生芽长出，愈伤组织分化出大量丛生芽，每块愈伤组织上有4～6个芽。
6、生根培养：将丛生芽分开，取健壮单个根茎芽接种到生根培养基上，培养基配方为：1/2MS+0.6mg/L IBA。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，组培架采用LED灯管做光源，光照强度为12000lux，每日光照时间12h，培养30天左右根生长旺盛，多花黄精苗绿健壮，并有0.5cm左右的块茎生成。
对比例1
对比例1与实施例1基本相同，不同之处在于，生根培养的步骤与实施例1不同，具体为：将丛生芽分开，取健壮单个根茎芽接种到生根培养基上，培养基配方为：1/2MS+0.6mg/L IBA。组培室温度控制在23℃～25℃，空气相对湿度40％～50％，组培架采用LED灯管做光源，光照强度为6000lux，每日光照时间12h，培养30天左右，如图4所示，种苗根系发达，但无块茎生成，叶片白化非常严重，种苗不合格。
对比例2
对比例2与实施例1基本相同，不同之处在于，在步骤4中，愈伤组织的继代培养基中没有添加香蕉泥，对比例2所使用的继代培养基的配方为：MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L，培养20天左右，如图5所示，愈伤组织增长缓慢，增大不明显，且呈疏松状，后期愈伤组织仅表面有少许变绿。
对比例3
对比例3与实施例1基本相同，不同之处在于，在步骤5中，丛生芽的出芽培养基中没有添加土豆泥，对比例3所使用的芽培养基的配方为MS+1.5mg/L～2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA，培养30天左右，如图6所示，愈伤组织的出芽率低，出芽幼芽生长缓慢且细弱，后期原愈伤有些许发黑。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：在无菌环境中，剥取成熟的多花黄精种子中的种胚，对所述种胚进行灭菌处理；
S2：将灭菌后的所述种胚接种于愈伤组织诱导培养基中，无光培养7～12天，种胚膨大形成愈伤组织；所述愈伤组织诱导培养基为MS+1.5mg/L～2.2mg/L 6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA；
S3：将所述愈伤组织分割成小块，接种到愈伤组织继代培养基上，于光照强度800lux～1200lux下培养18～25天；所述愈伤组织继代培养基的配方为MS+1.8mg/L～2.5mg/L 6-BA+0.15mg/L～0.25mg/L NAA+3wt％～8wt％香蕉泥；
S4：将经过所述步骤S3继代培养的愈伤组织分割成小块，接种到出芽培养基上，于光照强度为1200lux～1800lux、每日光照时间为10h～12h条件下，培养28～35天，诱导形成丛生芽；所述出芽培养基的配方为MS+1.5mg/L～2.0mg/L 6-BA+0.1mg/L～0.2mg/L NAA+3wt％～8wt％土豆泥；
S5：取所述丛生芽中的键壮、单个芽接种到生根培养基上，进行生根培养。
2.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，所述生根培养的光照强度为8000lux～12000lux，每日光照时间10h～12h。
3.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L。
4.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，所述继代培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+5wt％香蕉泥。
5.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，所述出芽培养基为MS+6-BA 2.0mg/L+NAA 0.2mg/L+5wt％土豆泥。
6.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，所述生根培养基为1/2MS+0.6mg/L IBA。
7.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，所述灭菌处理的方法为：将所述种胚置于0.1wt％升汞溶液中浸泡灭菌5min～9min，再用无菌水冲洗6～10次。
8.根据权利要求1所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，在所述剥取成熟的多花黄精种子中的种胚的步骤之前，还包括对所述成熟的多花黄精种子的预处理：将所述种子置于清水中浸泡20～28小时后，按照组培外植体常规灭菌方法进行灭菌处理。
9.根据权利要求1～8任一项所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，在所述组培繁殖过程中，温度为23℃～25℃，空气相对湿度为40％～50％。
10.根据权利要求9所述的多花黄精的组培繁殖方法，其特征在于，将所述经过所述步骤S3继代培养的愈伤组织重复步骤S3的培养。
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