CN105766654B - 一种南川木菠萝组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种南川木菠萝组织培养方法，建立起南川木菠萝的组织培养体系；南川木菠萝组织培养的外植体为带芽茎段，南川木菠萝愈伤培养的培养基为WPM+2.0mg/L 2，4–D+0.2或0.3mg/L 6‑BA+3g/L PVP，芽诱导培养基为WPM+3.0mg/L6‑BA+0.2mg/L NAA+3g/L PVP，生根培养基为WPM+1.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+3g/L PVP；组培苗炼苗时长为6－9天，使用灭菌营养土。本发明建立的南川木菠萝组织培养繁殖体系，幼叶愈伤率达100％，芽诱导率200％，生根率达75％以上，移栽成活率90％以上。

Description

一种南川木菠萝组织培养方法

技术领域

本发明属于植物培养技术领域，尤其涉及一种南川木菠萝组织培养方法。

背景技术

南川木菠萝(ArtocarpusnanchuanensisS.S.Chang)是多年生高大乔木植物，系桑科波罗蜜属分布在我国最北端的植物。别名南川面包树，水冬瓜，瓜瓢，大杨梅。1989年由中国科学院昆明植物研究所吴征镒院士和张秀实教授在《云南植物研究》11卷第1期上正式发表定为桑科的一个新种(吴征镒和张秀实，1989)。2004年，南川木菠萝被《中国物种红色名录》确定为“极危”物种，是我国最为珍稀的特有植物之一(孙容，2011)。目前报道，主要分布于重庆部分区县(罗宏果等，2012)，已发现并得到良好保护的野生南川木菠萝有6个居群，结果母树100株左右(罗宏果和王红娟，2012)。南川木菠萝喜光，耐贫瘠，散生于海拔900m以下的山地、丘陵(罗宏果等，2012)。南川木菠萝的树干直立、粗壮，树高可达25m以上，树干胸径可达60cm以上，低分枝，树叶繁茂。叶革质，长圆形、椭圆形或近圆形，表面光滑，叶绿色或浓绿色，四季常绿。因此，南川木菠萝表现出树形美观，抗逆性强，病虫害极少，具有较好的园林景观和生态效应，是难得的行道树、庭园绿化的优质树种。2008年重庆市将其确定为主城新城区9个基调树种之一(孙容，2011；罗宏果等，2012)。另外，南川木菠萝果实形似面包，具有较高的营养和医用保健价值，含有人体必须的多种糖、蛋白质、氨基酸和酯类，以及一些人体所必须的微量元素和多种维生素，可加工调制出风味独特、品质优良的果酒、果汁、果脯及果酱等；通便通气的效果明显，对便秘等肠道疾病具有较好的控制作用，民间使用表明，其树皮和树根对人体的皮肤病有较好的疗效。其木材红棕色，纹理细密、质地坚硬，用来可制作家具。因此，南川木菠萝可以从园林、饮料食品、医药保健、经济木材等方面进行开发利用(罗宏果等，2012)。南川木菠萝的价值逐渐引起了相关单位的关注并初步展开了引种工作。例如，贵州亚热带作物生物质能源研究所周正邦等研究表明，南川木菠萝可以成功引种到贵州望谟和兴义等地，这对贵州热区生态建设、特色农业开发等具有重要意义。为增加贵州特色优新物种，同时引种的太平洋面包树则不能安全越冬(周正邦等，2012)。但是，南川木菠萝种子具有休眠特性，少数休眠期可长达1年，发芽出苗不一致。因此，南川木菠萝的自然更新和繁衍能力极差。人工繁殖多为播种繁殖，秋播采用随采随播，春播需要进行沙藏处理。可扦插繁殖，但成活率低(罗宏果等，2012)。相关单位对这一珍稀物种资源进行了多年的调查研究，南川木菠萝的种子繁殖技术取得了某些阶段性成果(孙容，2011)，形成了扦插繁殖方法，但扦插成活率仅50％左右(罗宏果等，2013)，其繁殖受到季节影响，且需要大量土地和人工，不利于规模化生产。

因此，建立南川木菠萝的组织培养体系可很好的保护南川木菠萝这一濒危植物资源，解决产业开发所需种苗，同时为建立遗传转化体系和进一步挖掘相关资源奠定基础。

发明内容

本发明的目的在于提供一种南川木菠萝组织培养方法，旨在解决南川木菠萝这一濒危植物的资源保护和产业开发所需种苗，同时为建立南川木菠萝的遗传转化体系和挖掘相关基因资源奠定基础。

本发明是这样实现的，一种南川木菠萝组织培养方法，所述南川木菠萝组织培养方法建立起南川木菠萝的组织培养体系；南川木菠萝组织培养的外植体为带芽茎段；南川木菠萝愈伤培养的培养基为WPM+2.0mg/L 2，4–D+0.2或0.3mg/L 6-BA+3g/L PVP；芽诱导培养基为WPM+3.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+3g/L PVP；生根培养基为WPM+1.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+3g/L PVP；组培苗炼苗时长为6－9天，使用灭菌营养土。

进一步，所述南川木菠萝组织培养方法包括以下步骤：

步骤一，采集10年以上成年南川木菠萝树上带芽茎段为外植体；

步骤二，选取适度大小的带有2-3个芽的茎段，去掉衰老腐化的组织，蒸馏水浸泡5分钟，流水冲洗15分钟，用蒸馏水冲洗3-5次，75％乙醇处理30-60秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠处理10-15分钟，无菌滤纸吸干水，接种至相应培养基上进行培养；

步骤三，消毒完成的带芽茎段首先放入枝条生长培养基，再选取重新生长出来的幼叶切割成1-2平方厘米的外植体进行愈伤诱导，芽的分化诱导，生根培养及移栽成苗。

进一步，所述培养基包括：枝条生长培养基、愈伤诱导培养基、芽诱导培养基和生根培养基。

进一步，所述枝条生长培养基、愈伤诱导培养基、芽诱导培养基和生根培养基采用高压蒸汽进行培养基灭菌，在121℃、0.105MPa的压力下，灭菌15min～20min，灭好备用。

进一步，所述枝条生长培养基:以WPM为基本培养基，附加3g/L的聚乙烯吡咯烷酮。

进一步，所述愈伤诱导培养基以WPM为基本培养基，PH＝5.7，附加2.0mg/L 2，4–D、0.2或0.3mg/L 6-BA和3g/L PVP。

进一步，所述芽诱导培养基以WPM为基本培养基，PH＝5.8，附加3.0mg/L6-BA、0.2mg/L NAA和3g/L PVP。

进一步，所述生根培养基以WPM为基本培养基，PH＝5.8，附加1.5mg/L IBA、0.1mg/L NAA和3g/L PVP。

进一步，所述愈伤诱导采用暗处理，28℃处理48小时，琼脂用量为6.0g/L，培养基pH值为5.7。其它培养条件为白天25℃，夜晚18℃；光照强度1000～2000lx；光暗周期15h/9h；相对湿度80％，琼脂用量为6.0g/L，培养基pH值5.8。

进一步，所述炼苗营养土采用灭菌处理，炼苗时间为6天～9天。

本发明提供的南川木菠萝组织培养方法，首次建立了南川木菠萝组织培养繁殖体系，通过叶片即可大量繁殖南川木菠萝，使南川木菠萝这一濒危植物资源通过实验室条件得以很好保护，同时又可以提供大量苗木用于生产；南川木菠萝作为林木树种，在组织培养过程中褐化比较严重，从而导致组织培养过程部分组织死亡而不能成功诱导出苗。本发明克服了南川木菠萝组织培养过程中褐化致死现象，能成功诱导出幼苗，建立的南川木菠萝组织培养技术体系可使幼叶愈伤诱导率达100％，出芽诱导率200％(30个带愈伤外植体可诱导出60个芽)，生根率达75％以上，移栽成活率90％以上，因此可以使用该组织培养技术进行南川木菠萝的苗木生产；进行南川木菠萝苗木生产时，是在常规实验室条件下利用叶片形成愈伤，再诱导分化出幼苗，生产苗木的初始原料为切割的小叶片外植体，相对于扦插育苗可以规模化低成本的开展南川木菠萝的苗木生产，同时克服了扦插育苗的季节性和低成活率的局限。本发明南川木菠萝组织培养的外植体为带芽茎段，通过带芽茎段获得的无菌幼叶进行愈伤诱导时基本无褐化现象；南川木菠萝愈伤培养的培养基为WPM+2.0mg/L 2，4–D+0.2或0.3mg/L 6-BA+3g/L PVP，能很好的利用茎段再生幼叶诱导出愈伤组织，防止褐化现象的发生，愈伤诱导率为100％；芽诱导培养基为WPM+3.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+3g/LPVP，该培养基能很好的促进愈伤组织分化出芽，芽诱导率为200％；生根培养基为WPM+1.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+3g/L PVP，可使75％的幼苗诱导生根，减轻褐化现象的发生；组培苗炼苗时长为6－9天，使用灭菌营养土，可以提高移栽成活率。

附图说明

图1是本发明实施例提供的南川木菠萝组织培养方法流程图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明从外植体选择到幼苗移栽，对南川木菠萝组织培养各相关环节进行了研究。首次建立起了南川木菠萝的组织培养体系；结果表明，南川木菠萝组织培养适宜的外植体为带芽茎段，探明了获得无菌外植体的方法；南川木菠萝愈伤培养的优选培养基为WPM+2.0mg/L 2，4–D+0.2或0.3mg/L 6-BA+3g/L PVP，芽诱导优选培养基为WPM+3.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+3g/L PVP，生根优选培养基为WPM+1.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+3g/L PVP；适宜的组培苗炼苗时长为6－9天，使用灭菌营养土较好，移栽存活率可达90％以上。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1所示，本发明实施例的南川木菠萝组织培养方法包括以下步骤：

S101：采集10年以上成年南川木菠萝树上带芽茎段为外植体；

S102：选取适度大小的带2-3个芽的茎段，去掉衰老腐化的组织，蒸馏水浸泡5分钟，流水冲洗15分钟，用蒸馏水冲洗3-5次，75％乙醇处理30-60秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠处理10-15分钟，无菌滤纸吸干水，接种至相应培养基上进行培养；

S103：消毒完成的带牙茎段首先放入枝条生长培养基，再选取重新生长出来的幼叶切割成1-2平方厘米的外植体进行愈伤诱导，芽的分化诱导，生根培养及移栽成苗。

下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。

1材料与方法

1.1材料

南川木菠萝组织培养快速繁殖系统的建立以重庆綦江区东坡镇野生群为试材。采集10年以上成年南川木菠萝树上带芽茎段、嫩叶、幼嫩茎段为外植体。

1.2材料处理

1.2.1消毒：选取适度大小的嫩叶、带芽茎段、幼嫩茎段，去掉衰老腐化的组织，蒸馏水浸泡5分钟，流水冲洗15分钟，用蒸馏水冲洗3-5次，75％乙醇处理30-60秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠(滴加几滴tween-20)处理10-15分钟，无菌滤纸吸干水，接种至相应培养基上进行培养。

1.2.2组织培养方式：消毒完成的带芽茎段首先放入枝条生长培养基，再选取重新生长出来的幼叶切割成1-2平方厘米的外植体进行愈伤诱导，芽的分化诱导，生根培养及移栽成苗。直接从成年大树上采集的幼叶和幼嫩茎段经过消毒处理后，幼叶切割为1-2平方厘米，幼嫩茎段切割为1.5-2厘米直接进行愈伤诱导。

1.3培养基

采用高压蒸汽进行培养基灭菌，设定在121℃，0.105MPa的压力下，灭菌15－20min，灭好备用。

1.3.1枝条生长培养基

以WPM(Woody Plant medium)为基本培养基，附加3g/L的聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Polyvinylpyrrolidone)。

1.3.2愈伤诱导培养基

以WPM为基本培养基，PH＝5.7，附加6-BA和2，4－D或IAA，具体浓度设计组成见表1。PVP附加浓度为3.0g/L。每个处理设计3次重复，每个重复设计10个外植体，统计愈伤诱导率(愈伤诱导率＝形成愈伤外植体数/总外植体数)。

1.3.3芽诱导培养基

以WPM为基本培养基，PH＝5.8，附加不同浓度6-BA，NAA和3g/L的PVP，6-BA设计1.0ppm，2.0ppm,3.0ppm，4.0，5.0 5个浓度，NAA设计0.1ppm,0.2ppm2个浓度，不同浓度的6-BA和NAA进行两两组合配制培养基。每种激素组合接种愈伤3瓶，每瓶接种带有愈伤的外植体5块，并统计芽诱导率。

1.3.4生根培养基

以WPM为基本培养基，PH＝5.8，附加不同浓度IBA、NAA和3g/L的PVP，IBA设计0.5ppm，1.0ppm，1.5ppm，2.0ppm四个浓度，NAA设计0.1ppm和0.2ppm两个浓度。每个浓度处理使用20个幼苗，统计出根苗数，计算生根率(生根率＝生根苗数/总苗数)，3个月后结束生根统计。

1.4培养条件

愈伤诱导阶段采用暗处理，28℃48小时，其它无菌培养条件为白天25℃，夜晚18℃；光照强度1000～2000lx；光暗周期15h/9h；相对湿度80％。琼脂用量为6.0g/L，培养基pH值5.8。

1.5炼苗移栽

营养土处理设计灭菌和不灭菌。炼苗时间长设计为0天、3天、6天、9天、12天、15天5个处理，每个处理10株。统计移栽存活率(移栽存活率＝存活苗数/移栽总苗数)。

2结果与分析

2.1不同外植体的愈伤诱导

从母株上采取的嫩叶、幼茎在愈伤诱导培养基中培养7-10天后表现出褐化现象；而带芽茎段在枝条培养基培养20-25天可长出新叶，再利用长出的新叶作为外植体在愈伤培养基上培养可形成良好愈伤。因此，本发明以茎段芽长出的新叶为材料进行愈伤、幼芽诱导及生根培养。在培养基中附加PVP可以缓解外植体培养的褐化，在没有添加PVP的培养基中进行愈伤、芽诱导及生根培养时，褐化较严重，PVP的添加浓度以3g/L为宜。

2.2不同激素组合对愈伤诱导的影响

取从无菌枝条新长出的嫩叶，切割成约1x1.5厘米大小的外植体，置于附加不同激素的愈伤培养基进行愈伤诱导。接种10－12天后，叶片周围明显增厚，体积膨大，周围先形成愈伤组织。30天后进行愈伤诱导统计(表1)，结果表明不同激素和浓度其愈伤组织诱导率差异明显，附加2，4–D的培养基愈伤诱导率为17％－100％，而附加IAA的愈伤诱导率为7％－50％。附加2，4–D对南川木菠萝叶片愈伤的诱导以2.0mg/L水平最好，平均诱导率为98％，比1.0mg/L和3.0mg/L2，4–D的平均诱导率分别高70％和9％。在本发明中2，4–D对南川木菠萝叶子的愈伤诱导效果比IAA好，其中WPM+2，4–D 2.0mg/L+6-BA 0.2或0.3mg/L以及WPM+2，4–D 3.0mg/L+6-BA 0.2诱导率高达100％。

表1 不同激素对南川木菠萝叶片愈伤诱导的影响

2.3不同激素组合对芽诱导的影响

在愈伤培养基中培养3-4周后转入芽诱导培养基，不同激素组合的芽诱导培养基对愈伤组织培养的褐化程度不同，其中附加1.0mg/L和5.0的6-BA愈伤褐化程度较高，实验的30个带愈伤外植体没有诱导出芽，附加2.0和3.0mg/L的6-BA的培养基芽诱导效果较好，其中培养基WPM+3.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA+3g/L PVP芽诱导率最高，30个外植体可诱导60个芽。当提高6-BA附加浓度到4.0mg/L，芽诱导率极低，30个外植体诱导出2个芽，且褐化较重。NAA的浓度以0.2mg/L与6-BA的组合，较适宜南川木菠萝芽的诱导。

2.4生根培养

当芽伸长到约3厘米时，从基部切取幼苗，并带少量愈伤接入生根培养基。不同激素对南川木菠萝芽的根诱导，以培养基wps+1.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+3mg/L PVP效果最好，生根率达75％，相对较高，1个月左右可使幼苗生根，而附加1.0mg/L的IBA培养基生根需要约2个月，且生根率为25％，相对较低。当基础培养基中附加0.5ppm和2.0的IBA时，三个月内不能诱导出根。

2.5幼苗驯化移栽

幼苗在生根培养基生长到6-8厘米时开始炼苗移栽，移栽前揭开封口膜进行炼苗。之后去掉大部分叶片和残留培养基，保留2-3片叶移入灭菌营养土。本发明中灭菌营养土可以明显提高移栽存活率，在炼苗6天的情况下，移栽15株幼苗存活14株，而使用未灭菌营养土移栽15株幼苗存活7株。炼苗时间6-9天比较适宜，在灭绝营养土中存活率可达90％，0天、3天、12天和15天炼苗时长相应的存活率分别为10％、30％、50％、30％。当炼苗时间较短时进行移栽，幼嫩茎段易干枯，影响存活率，炼苗时间较长则容易长菌，而且失水严重，降低移栽存活率。苗期要注意保持水分，使营养土保持润湿，移栽后约7天即可恢复生长。

南川木菠萝系桑科波罗蜜属分布在我国最北端的植物，是十分宝贵的植物资源，同时具有较好的市场开发前景。南川木菠萝组培繁殖技术的建立将有利于该濒危植物的保护；通过该技术可以培育大量苗木，促进该资源的绿化、食品、医药等产品的合理利用和开发；也为将来进一步开展相关生物学研究奠定基础。南川木菠萝是一种高大乔木植物，在进行组织培养时褐化现象比较严重，本发明表明PVP、适当的激素浓度和配比可以一定程度减缓褐化现象，探索抑制组织培养中的褐化现象，将是改良南川木菠萝组织培养技术的途径之一。例如，本发明中将形成的愈伤进行芽诱导时，如果中芽诱导培养基中附加6-BA浓度为1.0mg/L时愈伤呈现发育缓慢，培养3天左右即出现较严重的褐化现象，不能分化出芽；当6-BA浓度增加到3.0时，褐化相对较轻，能分化出芽，可能与提高6-BA的浓度进而促进细胞分裂有关；当6-BA浓度增加到5.0时，褐化相对1.0的浓度较轻，但较3.0浓度严重，且发育缓慢，检测的30个外植体中没有芽的分化，可能是高浓度的6-BA破坏了组织发育的激素平衡。可溶性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的，专一性吸附剂，用于防止褐化的发生，PVP能减轻南川木菠萝组织培养中的褐化率，2-5g/L的浓度都有作用，以3g/L效果较好。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种南川木菠萝组织培养方法，其特征在于，所述南川木菠萝组织培养方法建立起南川木菠萝的组织培养体系；

所述南川木菠萝组织培养方法包括以下步骤：

步骤一，采集10年以上成年南川木菠萝树上带芽茎段为外植体；南川木菠萝愈伤培养的培养基为WPM+2.0mg/L 2，4–D+0.2或0.3mg/L 6-BA+3g/L PVP；

步骤二，选取适度大小的带2-3个芽的茎段，去掉衰老腐化的组织，蒸馏水浸泡5分钟，流水冲洗15分钟，用蒸馏水冲洗3-5次，75％乙醇处理30-60秒，无菌水冲洗3次，2％次氯酸钠处理10-15分钟，无菌滤纸吸干水，接种至相应培养基上进行培养；

步骤三，消毒完成的带芽茎段首先放入枝条生长培养基，再选取重新生长出来的幼叶切割成1-2平方厘米的外植体进行愈伤诱导，芽的分化诱导，生根培养及移栽成苗；芽诱导培养基为WPM+3.0mg/L6-BA+0.2mg/L NAA+3g/L PVP，生根培养基为WPM+1.5mg/L IBA+0.1mg/L NAA+3g/L PVP；组培苗炼苗时长为6－9天，使用灭菌营养土；所述枝条生长培养基:以WPM为基本培养基，附加3g/L的聚乙烯吡咯烷酮。

2.如权利要求1所述的南川木菠萝组织培养方法，其特征在于，所述枝条生长培养基、愈伤诱导培养基、芽诱导培养基和生根培养基采用高压蒸汽进行培养基灭菌，在121℃、0.105MPa的压力下，灭菌15min～20min，灭好备用。

3.如权利要求1所述的南川木菠萝组织培养方法，其特征在于，所述愈伤诱导培养基以WPM为基本培养基，pH＝5.7。

4.如权利要求1所述的南川木菠萝组织培养方法，其特征在于，所述芽诱导培养基以WPM为基本培养基，pH＝5.8。

5.如权利要求1所述的南川木菠萝组织培养方法，其特征在于，所述生根培养基以WPM为基本培养基，pH＝5.8。

6.如权利要求1所述的南川木菠萝组织培养方法，其特征在于，所述愈伤诱导采用28℃下暗处理48小时，琼脂用量为6.0g/L，培养基pH值为5.7；其它培养条件为白天25℃，夜晚18℃，光照强度1000～2000lx；光暗周期15h/9h；相对湿度80％，琼脂用量为6.0g/L，培养基pH值5.8。