CN112970585B - 一种面包果种苗的高通量繁育方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及组织培养及种苗高通量繁育技术领域，特别涉及一种面包果种苗的高通量繁育方法。该方法包括：将面包果母株根段进行扦插，取根段上生长出的茎段制备外植体，清洗、消毒灭菌；将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导，得到带愈伤组织的茎段；将带愈伤组织的茎段接种到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽增殖分化，得到丛生芽；将丛生芽进行分株后，接种到生根培养基上进行生根，得到完整植株。本发明以母株根段扦插，根部上长出的茎段为外植体材料，才能诱导出丛生芽，获得丛生芽。

Description

一种面包果种苗的高通量繁育方法

技术领域

本发明涉及组织培养及种苗高通量繁育技术领域，特别涉及一种面包果种苗的高通量繁育方法。

背景技术

面包果Artocarpus altilis(Parkinson)Fosberg，别名面包树，英文名breadfruit，是桑科菠萝蜜属多年生热带优稀果树品种或木本粮食作物，有“长面包的树”之美称。原产于南太平洋的玻利尼西亚和西印度群岛，是当地的主要粮食作物。面包果营养丰富，不仅是热带地区的主要粮食作物，还是总糖、还原糖、蛋白质、抗坏血酸、膳食纤维、矿物质的重要来源，既可以做南方的粮食作物，也可以作为特色热带水果开发。此外，成熟的果实用途多样，可煮汤，切片用火烤或油炸，果肉松软，香味似面包；在我国引种地海南万宁兴隆地区，盛产期的面包果植株，年平均株产量可达100kg以上，产量可观，兴隆当地人家常切块煮咖喱，口感甚佳，这里需区分面包果Artocarpus altilis和面包树Artocarpusincisa，英文名breadnut。面包树Artocarpus incisa 叶子类似面包果Artocarpusaltilis，常在福建、海南、广西一些地方绿化观赏，果实有种子，不富含淀粉，两者不同，具体见图1和图2。随着市场经济的发展，人们对各种名优稀特色杂粮的需求与日俱增，健康、营养丰富的天然面包也将是大家最想了解和品尝的项目，因而，面包果产业具有很好的开发潜力和市场前景。

目前，面包果在我国热区处于适度产业化阶段，在海南兴隆地区筛选的面包果无籽类型能正常开花结果，较好适应当地的气候条件，目前已开展区域试种研究，植株进入全面开花结果，但作物推广面积、产量仍然有限、果实上市少，并不为大多数人所知。究其原因，优良种苗缺乏是制约其产业发展的重要因素，且已知的面包果无籽类型良苗繁育依靠根蘖自然繁殖或刺伤地表根系产生根蘖繁殖，生长慢，周期长，数量少，且具有不确定性。因而建立一套适用可行的面包果种苗繁育技术，为进一步开发利用提供技术支撑显得尤为重要。

采用无性繁育方法，如嫁接、扦插与组培等，能保证母体品种的优良遗传特性和经济性状，减少品种的分化和衰退、提高引进品种的适应性，扩大繁育和迅速推广优良品种。其中组织培养技术，主要是在室内进行种苗繁育，避免遭受天气因素的干扰，生长状态相对一致，利于集中管理，降低成本。并且以面包果愈伤组织作为外植体材料，通过丛生芽诱导或进行体细胞胚发生进行植株再生，能够摆脱对母株材料的限制，极大地提高面包果种苗的繁育效率，达到高通量繁育种苗的目的。因此组织培养技术对于面包果种苗繁育具有重要的实用价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种面包果种苗的高通量繁育方法。本方法最终实现了只需要以带腋芽茎段为外植体，进行增殖分化，再生根成完整植株，节省了初级诱导时间与材料，同时避免了初级诱导中内生菌污染的问题。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种面包果种苗的高通量繁育方法，包括以下步骤：

步骤1：将面包果母株根段进行扦插，取根段上生长出的茎段制备外植体，清洗、消毒灭菌；

步骤2：将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导，得到带愈伤组织的茎段；愈伤组织诱导培养基为含有0.5～3.0mg/L 6-BA、 0.1～1.0mg/L IBA的MS培养基；将带愈伤组织的茎段接种到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽增殖分化，得到丛生芽；丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IBA、0.5～3.0mg/L TDZ的MS培养基；

或者，将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上直接进行丛生芽增殖分化，得到丛生芽；

步骤3：将丛生芽进行分株后，接种到生根培养基上进行生根，得到完整植株；生根培养基为含有0.1～0.5mg/LNAA的1/2MS培养基。

作为优选，面包果母株根段的制备方法为：采集面包果接近地表的、1.5～ 6厘米粗的根系，剪成15～30厘米长，根段上口剪平，下口斜剪；

作为优选，扦插所用基质为椰糠，扦插的培养条件为：遮阴，苗床湿度为80％以上，温度为23～30℃。

作为优选，外植体的长度为1～1.5cm。

作为优选，愈伤组织诱导培养基为含有2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA的 MS培养基，或者为含有1.0mg/L 6-BA、0.5mg/L IBA的MS培养基。

作为优选，丛生芽诱导培养基为含有2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA、0.5mg/L TDZ的MS培养基。

作为优选，生根培养基为含有0.5mg/LNAA的1/2MS培养基。

作为优选，愈伤组织诱导的条件为：28±2℃、光照强度500～1000lux、光照周期12h/d。

优选地，愈伤组织诱导的光照强度600lux

作为优选，丛生芽增殖分化的条件为：28±2℃、光照强度1500～2500lux、光照周期12h/d。

优选地，丛生芽增殖分化的光照强度为1800～2000lux。

作为优选，生根的条件为：28±2℃、光照强度1500～2500lux、光照周期 12h/d。

优选地，生根的光照强度为2000lux。

作为优选，外植体的清洗、消毒灭菌程序为：外植体先用洗洁精清洗，然后再用升汞灭菌。

优选地，外植体的清洗、消毒灭菌程序为：首先将外植体置于容器内，加入吐温-203～4滴，用纱布封口进行流水冲洗10～30min；随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌4～8min，无菌水洗涤4～5次，无菌水每次洗涤1～2min，沥干水分。

本发明提供了一种面包果种苗的高通量繁育方法。该方法包括：将面包果母株根段进行扦插，取根段上生长出的茎段制备外植体，清洗、消毒灭菌；将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导，得到带愈伤组织的茎段；愈伤组织诱导培养基为含有0.5～3.0mg/L 6-BA、0.1～1.0mg/L IBA的 MS培养基；将带愈伤组织的茎段接种到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽增殖分化，得到丛生芽；丛生芽诱导培养基为含有0.5～3.0mg/L6-BA、0.1～1.0mg/L IBA、0.5～3.0mg/L TDZ的MS培养基；将丛生芽进行分株后，接种到生根培养基上进行生根，得到完整植株；生根培养基为含有0.1～0.5mg/LNAA的1/2MS 培养基。本发明具有如下技术效果：

本发明以不同外植体和培养基作为对照方法，与本发明方法在相同环境条件下进行培养，结果显示，只有以母株根段扦插，根部上长出的茎段为外植体材料，才能诱导出丛生芽，获得丛生芽，以侧芽、顶芽与根芽为外植体材料，污染率高，并在培养中逐渐褐化死亡，没有获得愈伤组织或丛生芽，因此在面包果愈伤组织诱导与丛生芽再生方面，本发明方法显著优于各对照方法；

本发明方法选择母株根部长出的茎段作为外植体，愈伤组织诱导培养基配方：以MS为基础培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和吲哚丁酸(IBA)；丛生芽诱导培养基配方：以MS为基础培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)和噻苯隆(TDZ)；丛生芽生根培养基配方：以1/2MS为基础培养基，添加萘乙酸(NAA)，实现了一根带愈伤组织的茎段通过培养，能够拥有 4根以上丛生芽的分化率，对日后的面包果种苗的高通量繁育与基因工程学研究具有重要意义。

附图说明

图1为面包果，1-1为植株照片，1-2为果实纵切面图(果实种子败育)；

图2为面包树，2-1为植株照片，2-2为果实纵切面图(果实有种子，品质不佳)；

图3为本发明面包果种苗组培快繁技术方法。

具体实施方式

本发明公开了一种面包果种苗的高通量繁育方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明涉及面包果组织培养及种苗高通量繁育技术领域，公开了一种以面包果母株根段扦插，以根部长出的茎段为外植体的种苗快繁技术方法。本发明技术所述方法将面包果母株根部长出的茎段摘取下来分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段，经过消毒灭菌后，培养30d左右，茎段基部诱导出愈伤组织；随后，转接到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽诱导；待从愈伤组织部分分化出的丛生芽长度达0.5cm左右，才能对丛生芽进行分芽，最后生根长成完整植株，以达到高通量繁育的目的。首先在含6-BA与IBA的MS培养基上培养 30至40天中，待茎段基部逐渐膨大分化出愈伤组织，随后将带愈伤组织的茎段接在含6-BA、IBA与TDZ的MS培养基上增殖分化成丛生芽团。其中丛生芽块继代在含NAA的1/2MS培养基上培养30至40天后，丛生芽开始生根并展叶成完整植株，并可移栽入土。本方法最终实现了只需要以根部长出的茎段为外植体，进行增殖分化，再生根成完整植株，大大提高了丛生芽的分化率及有效降低外植体的污染率，缩短育苗周期。这一面包果的离体再生方法，为日后面包果种苗的工厂化高通量繁育与基因工程育种研究提供了技术支撑。

本发明中所用培养基、试剂等均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：本发明所述方法

将采集面包果接近地表的根系，1.5厘米～6厘米粗的根，剪成15厘米～ 30厘米长，根段上口剪平，修剪切口时保持切口平整，根段保持完整没有裂开，下口斜剪。表面可覆盖1厘米厚的细椰糠，并使用多菌灵500倍液喷淋苗床一次，根的上部2～3厘米暴露在空气中，在苗床上搭高50～80厘米高的塑料薄膜拱棚并在顶部设置遮荫网盖顶，定期浇水保持苗床湿度在80％以上，并通风降温控制拱棚内温度在23～30℃之间，出芽率在60％～85％之间，待出芽后，挑取优质侧芽作为外植体。

截取面包果根部长出的带腋芽的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。事先对采样株进行3天的农药灭菌(多菌灵+农用硫酸链霉素1000倍液)后将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，无菌水每次洗涤1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的茎段置于愈伤组织诱导培养基上，28±2℃、光照强度600lux、光照周期12h/d下培养进行丛生芽诱导，培养基配方为MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)。

将诱导出的带愈伤组织的茎段进行丛生芽诱导，接种到丛生芽诱导培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行丛生芽增殖分化，光照周期12h/d，培养基配方为MS+2.0mg/L6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸 (IBA)+0.5mg/L噻苯隆(TDZ)。

将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到生根培养基上，28±2℃下2000lux 光照培养进行增殖生根，光照周期12h/d，培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸(NAA)。

本实施例组培快繁技术中各个时期的培养效果见图3。

实施例2：

以实施例1所得面包果侧芽为外植体，培养方法具体如下：

取面包果母株上的侧芽作为外植体材料。事先对采样株进行3天的农药灭菌(多菌灵+农用硫酸链霉素1000倍液)后将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤 4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的侧芽置于丛生芽诱导培养基上，28±2℃下1800lux光照培养进行丛生芽诱导，光照周期12h/d，培养基配方为MS+1.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+0.5mg/L吲哚丁酸(IBA)。

侧芽基部并未有愈伤组织生出，但随后侧芽基部分化出新芽，能诱导出 4-5个芽。

将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到生根培养基上，28±2℃下2000lux 光照培养进行增殖生根，光照周期12h/d，培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸(NAA)。

对照例1：

以面包果侧芽为外植体，采用实施例1中培养方法。具体如下：

取面包果母株上的侧芽作为外植体材料。事先对采样株进行3天的农药灭菌(多菌灵+农用硫酸链霉素1000倍液)后将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤 4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的侧芽置于愈伤组织诱导培养基上，28±2℃、光照强度600lux、光照周期12h/d下培养进行愈伤组织诱导，培养基配方为MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)。

侧芽基部有愈伤组织生出，但随后侧芽并未长大，且愈伤组织化后死亡。

对照例2：

以面包果根芽为外植体，采用实施例1中培养方法。具体如下：

截取面包果根部长出的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的根芽置于愈伤组织诱导培养基上，28±2℃、光照强度600lux、光照周期12h/d下培养进行丛生芽诱导，培养基配方为MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)。

将诱导出的带愈伤组织的茎段后，进行丛生芽诱导，接种到丛生芽诱导培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行丛生芽增殖分化，培养基配方为 MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5mg/L噻苯隆(TDZ)。

将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到增殖生根培养基上，28±2℃下 2000lux光照培养进行增殖生根，培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸(NAA)。

对照例3：

以面包果顶芽为外植体，采用实施例1中培养方法。具体如下：

截取面包果顶芽，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌 4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的根芽置于愈伤组织诱导培养基上，28±2℃、光照强度600lux、光照周期12h/d下培养进行丛生芽诱导，培养基配方为MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)。

将诱导出的带愈伤组织的茎段后，进行丛生芽诱导，接种到丛生芽诱导培养基上，28±2℃下2000lux光照培养进行丛生芽诱导，培养基配方为 MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)+0.5mg/L噻苯隆(TDZ)。

将诱导出的丛生芽，进行分株后，接种到增殖生根培养基上，28±2℃下 2000lux光照培养进行增殖生根，培养基配方为1/2MS+0.5mg/L萘乙酸(NAA)。

对照例4：

将实施例1中的丛生芽诱导培养基改为MS+0.1mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸 (2,4-D)+0.5mg/L 6-BA。具体如下：

截取采用实施例1获得的扦插面包果根部长出的茎段，分成每节都有腋芽的1.0-1.5cm的茎段。首先将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用75％酒精表面消毒30-50s后，无菌水洗涤3-4次，再用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，每次无菌水洗涤1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的茎段基部置于愈伤组织诱导培养基上，28±2℃、光照强度600 lux、光照周期12h/d下培养进行愈伤组织诱导，培养基配方为MS+0.1mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸(2,4-D)+0.5mg/L 6-BA。带腋芽的茎段并未诱导出愈伤组织，但可以从未污染的茎段基部分化出1-2个芽。

对照例5：

截取面包果母株长出的嫩叶与顶芽，分成1.0-1.5cm²的叶片与剥去外叶鞘的0.3cm左右的顶芽。事先对采样株进行3天的农药灭菌(多菌灵+农用硫酸链霉素1000倍液)后将外植体装在三角瓶内，加入吐温-203-4滴，用洁净纱布封口进行流水冲洗10-30min，直至外植体表面泡沫冲洗干净。随后转到无菌操作台上，用0.1％升汞灭菌4-8min，无菌水洗涤4-5次，无菌水每次洗涤 1-2min，沥干水分后待接种。

将灭菌好的嫩叶与顶芽置于愈伤组织诱导培养基上，28±2℃、光照强度 600lux、光照周期12h/d下培养进行愈伤组织或丛生芽诱导，培养基配方为 MS+2.0mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)+1.0mg/L吲哚丁酸(IBA)。

两者都未诱导出愈伤组织与丛生芽，培养一段时间后均褐化死亡。

试验例1：对比试验

按照实施例1-2和对照例1-5的方法进行试验，统计愈伤组织诱导率与丛生芽诱导率，结果见表1、2。

表1不同培养方法丛生芽诱导率、丛生芽诱导率对比

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表2不同处理方法中单芽诱导增殖发芽数对比

处理	诱导时间	增殖发芽数
			扦插面包果根部发芽(对照)	30d	2
愈伤组织诱导丛生芽(实施例1)	30d	8
			单芽直接诱导丛生芽(实施例2)	30d	10

由表1可以看出，采用本发明实施例1所提供的愈伤诱导、丛生芽分化的培育方式，愈伤组织诱导率达78％左右，丛生芽分化率达88％左右，相比其他对照方法，为最优的培育方法。另外，采用实施例2的方法，侧芽直接分化丛生芽的方式，虽然没有愈伤组织产生，但丛生芽的分化率最高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种面包果种苗的高通量繁育方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1：将面包果母株根段进行扦插，取根段上生长出的带腋芽的茎段制备外植体，清洗、消毒灭菌；

步骤2：将外植体接种到愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导，得到带愈伤组织的茎段；将带愈伤组织的茎段接种到丛生芽诱导培养基上进行丛生芽增殖分化，得到丛生芽；

步骤3：将丛生芽进行分株后，接种到生根培养基上进行生根，得到完整植株；

所述面包果母株根段的制备方法为：采集面包果接近地表的1.5～6厘米粗的根系，剪成15～30厘米长，根段上口剪平，下口斜剪；

所述扦插所用基质为椰糠，所述扦插的培养条件为：遮阴，苗床湿度为80%以上，温度为23～30℃；

所述外植体的长度为1~1.5cm；

所述愈伤组织诱导培养基为含有2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA的MS培养基；

所述丛生芽诱导培养基为含有2.0mg/L 6-BA、1.0mg/L IBA、0.5mg/L TDZ的MS培养基；

所述生根培养基为含有0.5mg/L NAA的1/2MS培养基。

2.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导的条件为：28±2℃、光照强度500~1000 lux、光照周期12h/d。

3.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述丛生芽增殖分化的条件为：28±2℃、光照强度1500~2500 lux、光照周期12h/d。

4.根据权利要求1所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述生根的条件为：28±2℃、光照强度1500~2500 lux、光照周期12h/d。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的高通量繁育方法，其特征在于，所述外植体的清洗、消毒灭菌程序为：外植体先用洗洁精清洗，然后再用升汞灭菌。

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