CN114145231B - 一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法 - Google Patents

一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括如下步骤：采集二色波罗蜜嫩枝，表面消毒灭菌后剪成茎段，接种在芽诱导培养基上诱导形成不定芽；将不定芽切成带1～2个芽的小块接入芽增殖培养基中进行增殖培养；再对增殖的丛芽进行复壮，后切取生长健壮、高3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，并炼苗移栽。本发明的优点：能够利用小量二色波罗蜜嫩枝快速繁殖、生产大量优质种苗，成活率高达80%，为二色波罗蜜的工厂化育苗提供了一条有效的途径。

Description

一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法。
背景技术
二色波罗蜜(Artocarpus styracifolius Pierre)为桑科波罗蜜属一种高大乔木，分布于我国广西、广东、海南、云南等地，可作家具用材，浆果酸甜，可作果酱。民间以其根入药，具有祛风除湿、舒筋活血等功效，用于治疗风湿关节炎、腰肌劳损、半身不遂、跌打损伤、扭挫伤等症。研究表明，二色波罗蜜茎皮中的异戊烯基黄酮类成分具有明显的抗锥虫活性，根皮中含有多种多元酚成分，对大鼠中性粒细胞呼吸爆发具有明显的抑制活性。现有研究主要集中于二色波罗蜜的化学及药理领域，其种苗繁殖技术尚未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法。
本发明以二色波罗蜜嫩枝茎段为启动材料，通过诱导产生不定芽，并对获得的不定芽进行继代增殖、壮苗及生根，快速获得大量二色波罗蜜种苗，从而实现本发明的目的。
本发明一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括以下步骤：
（1）选取生长健壮、无病虫危害的二色波罗蜜嫩枝，经表面消毒灭菌后剪成茎段，接入芽诱导培养基中诱导不定芽，芽诱导培养基为：MS + 6-BA 2.0～3.0 mg/L + ZT 0.1～0.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（2）将步骤（1）中获得的不定芽，接入芽增殖培养基中进行继代增殖培养，增殖培养基为：MS + 6-BA 0.5～1.5 mg/L + ZT 0.1～0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（3）将步骤（2）中增殖的丛芽切成小块，接入壮苗培养基中进行壮苗培养，壮苗培养基为：MS + 6-BA 0.2～0.4 mg/L + NAA 0.1～0.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（4）剪取步骤（3）中生长健壮、高3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：1/2 MS + NAA 0.5～1.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，成活率为75.5～82.5%。
所述步骤（1）中培养方法为茎段先在温度30±2℃下暗培养7天，再转入光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d的光下培养。
所述步骤（2）、（3）、（4）中培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃。
所述培养基中，6-BA为6-苄氨基腺嘌呤；NAA为1-萘乙酸；ZT为6-(4-羟基-3-甲基-2-丁烯基)氨基嘌呤（玉米素）。
MS主要包含以下成分：(1) NH4NO3 1650 mg/L、(2)KNO3 1900 mg/L、(3)CaCl2﹒2H2O440mg/L、(4)MgSO4﹒7H2O 370mg/L、(5)KH2PO4170 mg/L、(6)Na2-EDTA 37.3 mg/L、(7)FeSO4﹒7H2O 27.8 mg/L、(8)MnSO4﹒4H2O 22.3 mg/L、(9)ZnSO4﹒7H2O 8.6mg/L、(10)H3BO36.2 mg/L、(11)KI 0.83 mg/L、(12)Na2MoO4﹒2H2O 0.25mg/L、(13)CuSO4﹒5H2O 0.025mg/L、(14)CoCl2﹒6H2O 0.025mg/L、(15)盐酸硫胺素VB1 0.1mg/L、(16)烟酸0.5mg/L、(17)肌醇100mg/L、(18)甘氨酸2mg/L、(19)盐酸吡哆醇VB6 0.5 mg/L。
所述步骤（1）中嫩枝消毒灭菌方法为，在超净工作台上，先用体积分数为70~75%的酒精溶液浸泡30秒，再用质量分数为0.1%的升汞溶液浸泡消毒7~9分钟，后用无菌水冲冼5次，无菌滤纸吸干表面的水分备用。
所述芽诱导培养基优选为：MS + 6-BA 2.5 mg/L + ZT 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
所述芽增殖培养基优选为：MS + 6-BA 1.0 mg/L + ZT 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
所述壮苗培养基优选为：MS + 6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
所述生根培养基优选为：1/2 MS + NAA 1.0 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
将步骤（1）中消毒灭菌后的嫩枝剪成长2 cm的茎段，接种于步骤（1）的芽诱导培养基中，培养40天形成1.2～3.5个不定芽，诱导率达73.5～100%。
将步骤（1）中获得的不定芽剪成带1～2个芽的小块接种于步骤（2）的芽继代增殖培养基中，培养40天的增殖系数为3.1～5.2倍。
将经过壮苗培养的健壮芽剪成高3～4cm的单芽接入步骤（4）的生根诱导培养基中，培养50天能形成3～6条、长3～7cm的白色粗壮根，生根率达69.5～80.6%。
将生根试管苗炼苗后，移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，30天的成活率为75.5～80%。
本发明的优点为：
本发明方法建立了一套二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括不定芽诱导培养、芽增殖和复壮培养、试管苗生根培养。采用本发明方法繁殖二色波罗蜜种苗，具有繁殖速度快、产量大、种苗质量优、需时短、实际操作性强等特点，对二色波罗蜜种质资源保护和可持续利用具有重要意义，应用前景广阔。
附图说明
图1为实施例1芽诱导培养40天形成的不定芽情况；
图2为实施例1芽增殖培养40天形成的丛生芽情况；
图3为实施例1壮苗培养30天的生长情况；
图4为实施例1生根苗移栽70天的生长情况。
具体实施方式
下面结合实施例和附图对本发明内容作进一步的阐述，但不是对本发明的限制。实施例中未注明具体条件及操作的实验方法，按照常规方法，或按照说明书上制造商提供的要求进行。除非特别定义，本发明中所使用的专业用语均为本领域科技人员熟悉的含义。
培养基的制备：按照常规方法配制培养基，调节pH值，分装后124℃灭菌25 min，备用。
嫩枝处理及消毒：采集二色波罗蜜嫩枝，去除叶片，清洗干净。在超净工作台上，先用体积分数为70~75%的酒精溶液浸泡30秒，再用质量分数为0.1%的升汞溶液浸泡消毒7~9分钟，后用无菌水冲冼5次，无菌滤纸吸干表面的水分，剪成长2.0 cm的茎段备用。
实施例1
一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括以下具体步骤：
（1）选取生长健壮、无病虫危害的二色波罗蜜嫩枝，经表面消毒灭菌后剪成茎段，接入芽诱导培养基中诱导产生不定芽，芽诱导培养基为：MS + 6-BA 2.5 mg/L + ZT 0.2mg/L，同时添加琼脂粉5.5g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；茎段先在温度30±2℃下暗培养7天，再转入光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d的光下培养；培养7~10天可见不定芽分化，40天形成3.5个不定芽，诱导率达100%，参见图1；
（2）将步骤（1）中获得的不定芽剪成带1～2个芽的小块，接入芽增殖培养基中进行继代增殖培养，芽增殖培养基为：MS + 6-BA 1.0 mg/L + ZT 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉5.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d，温度 28±2℃；培养40天的增殖系数为5.2倍，参见图2；
（3）将步骤（2）中增殖的丛芽切成小块，接入壮苗培养基中进行壮苗培养，壮苗培养基为：MS + 6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉5.5g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃；培养30天的生长情况参见图3；
（4）剪取步骤（3）中生长健壮、高3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：1/2 MS + NAA 1.0 mg/L，同时添加琼脂粉5.5 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；培养条件为光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d ，温度 28±2℃；培养50天能形成3～6条、长3～7cm的白色粗壮根，生根率80.6%；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，移栽70天的成活率为78.5%，参见图4。
实施例2
一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括以下具体步骤：
材料处理方法、培养基添加物、培养条件及操作步骤同实施例1；
（1）芽诱导培养基为：MS + 6-BA 2.0 mg/L + ZT 0.1 mg/L；培养7~10天可见不定芽分化，40天形成2.8个不定芽，诱导率90.3%；
（2）芽增殖培养基为：MS + 6-BA 1.5 mg/L + ZT 0.2 mg/L；培养40天的增殖系数4.5倍；
（3）壮苗培养基为：MS + 6-BA 0.4 mg/L + NAA 0.5 mg/L；
（4）生根培养基为：1/2 MS + NAA 1.5 mg/L；培养50天生根率76.5%；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，移栽70天的成活率为80%。
实施例3
一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括以下具体步骤：
材料处理方法、培养基添加物、培养条件及操作步骤同实施例1；
（1）芽诱导培养基为：MS + 6-BA 3.0 mg/L + ZT 0.5 mg/L；培养40天形成1.2个不定芽，诱导率73.5%，形成大量愈伤组织，部分不定芽叶片出现异常；
（2）芽增殖培养基为：MS + 6-BA 0.5 mg/L + ZT 0.1 mg/L；培养40天的增殖系数3.1倍；
（3）壮苗培养基为：MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.1 mg/L；
（4）生根培养基为：1/2 MS + NAA 0.5 mg/L；培养50天生根率69.5%；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，移栽70天的成活率为75.5%。
实施例4
一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括以下具体步骤：
材料处理方法、培养基添加物、培养条件及操作步骤同实施例1；
（1）芽诱导培养基为：MS + 6-BA 2.0 mg/L + ZT 0.5 mg/L；培养7~10天可见不定芽分化，40天形成3.4个不定芽，诱导率达94.5%；
（2）芽增殖培养基为：MS + 6-BA 1.0 mg/L + ZT 0.1 mg/L；培养40天的增殖系数为3.9倍；
（3）壮苗培养基为：MS + 6-BA 0.2 mg/L + NAA 0.2 mg/L；
（4）生根培养基为：1/2 MS + NAA 1.0 mg/L。培养50天生根率75.8%；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，移栽70天的成活率为79.5%。
对比实施例
一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，包括以下具体步骤：
材料处理方法、培养基添加物、培养条件及操作步骤同实施例1；
（1）芽诱导培养基为：MS + 6-BA 4.0 mg/L + ZT 0.2 mg/L；培养40天形成1.6个不定芽，诱导率达47.8%，不定芽严重玻璃化，多数为无效芽；
（2）芽增殖培养基为：MS，培养40天的增殖系数为1.5倍；
（3）壮苗培养基为：MS + NAA 0.2 mg/L；
（4）生根培养基为：1/2 MS + NAA 1.0 mg/L。培养50天生根率为50.5%，根系细弱；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，移栽70天的成活率为22.5%。
实施例1-4采用本发明二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，茎段接种40天能诱导形成1.2～3.5个不定芽，诱导率73.5～100%；不定芽继代40天繁殖系数为3.1～5.2倍，生根率为69.5～80.6%，生根苗移栽成活率为75.5～80%。
实施例1-4与对比实施例相比二色波罗蜜茎段的诱导率和生根试管苗的移栽成活率显著提高。本发明方法为二色波罗蜜的工厂化育苗提供了一条有效的途径。

Claims (6)

1.一种二色波罗蜜种苗快速繁殖方法，其特征在于包括以下步骤:
（1）二色波罗蜜嫩枝经表面灭菌后剪成茎段，接入芽诱导培养基中诱导产生不定芽，芽诱导培养基为：MS + 6-BA 2.0～3.0 mg/L + ZT 0.1～0.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
所述茎段先在温度30±2℃下暗培养7天，再转入光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d的光下培养；
（2）将步骤（1）中获得的不定芽，接入芽增殖培养基中进行继代增殖培养，增殖培养基为：MS + 6-BA 0.5～1.5 mg/L + ZT 0.1～0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（3）将步骤（2）中增殖的芽，接入壮苗培养基中进行壮苗培养，壮苗培养基为：MS + 6-BA 0.2～0.4 mg/L + NAA 0.1～0.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（4）剪取步骤（3）中生长健壮、高3～4cm的单芽接入生根培养基中诱导生根，生根培养基为：1/2 MS + NAA 0.5～1.5 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8；
（5）将生根试管苗在荫蔽度为70～85%的大棚里炼苗10～15天后，洗净培养基移栽于经甲基托布津消毒的火烧土:中沙:泥炭土为3:2:1的混合基质中，成活率为75.5～80.0%。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述芽诱导培养基为：MS + 6-BA2.5 mg/L + ZT 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述增殖培养基为：MS + 6-BA1.0 mg/L + ZT 0.1 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述壮苗培养基为：MS + 6-BA0.4 mg/L + NAA 0.2 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）所述生根培养基为：1/2 MS + NAA1.0 mg/L，同时添加琼脂粉4.5~6.0 g/L、蔗糖30 g/L，pH为5.8。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述步骤（2）、（3）和（4）中培养条件为：光照强度800～1200 lux，光照时间10±1 h/d，温度 28±2℃。
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