CN116686706A - 一种芫花的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种芫花组织培养方法，步骤包括芫花外植体的前处理、芫花外植体的采取、芫花外植体的消毒、芫花外植体的诱导培养、芫花芽的增殖培养、芫花芽的壮苗培养、芫花苗的生根培养。本发明诱导采用低氮培养基培养，增殖、壮苗、生根采用低铵态氮培养基培养，在芫花各个培养基中添加了叶酸、盐酸硫胺素等形成不同的培养基配方，以满足不同阶段苗木对营养的需求，减少了芫花玻璃化以及难生根的现象；采用母本遮光处理的方式，极大提高了芫花的诱导成活率，可以在短时间内得到更多的芫花苗，可满足大规模商业生产的需求。
Description
技术领域
本发明涉及植物繁殖技术领域，具体而言涉及一种芫花的组织培养方法。
背景技术
在植物繁殖技术领域，组织培养是植物的人工营养繁殖方法之一。芫花(Daphnegenkwa Sieb.et Zucc.)为瑞香科瑞香属落叶灌木，其花朵锦簇、花色艳丽，具有较高的观赏价值，为我国优良野生花卉资源。同时也是我国重要的中药材和生物农药。芫花一般采用播种方法进行繁殖，但种子繁殖其后代性状发生分离，无法保持母本植株的优良性状。芫花的扦插繁殖，生根成活率低，加之穗源少，繁殖效率低，不能实现快速大量繁殖。采用组织培养方法繁殖芫花，可保持母本优良性状，为优良单株的快速扩繁提供途径。
现有技术中，申请号为CN201710176227.5的发明专利中公开了一种芫花茎段外植体初代组织培养基，包括如下组分：MS+0.1mg/L NAA+1.0-1.5mg/L ZT，加入蔗糖25-30g/L、琼脂6.5-7g/L，调整酸碱度至pH＝5.7-5.8。包括如下步骤：
(1)芫花外植体的选取：采集生长健壮，腋芽饱满，无病虫害的芫花当年生枝条，去除全部叶片，剪截成8～10cm带腋芽茎段作为外植体；(2)芫花外植体的处理：将外植体用洗衣粉溶液浸泡洗涤15～20min，接着用流水冲洗8～12小时。在无菌环境下将外植体剪成4-5cm茎段进行消毒处理；消毒后用无菌水冲洗，将茎段剪成1.5～2.5cm的长度，接入芫花茎段外植体初代组织培养的培养基中；(3)芫花外植体的培养：将步骤(2)接入初代培养基中的外植体置于培养室的培养架进行光照培养，直至诱导丛生芽萌发。
然而，上述芫花的组织培养方法仅限于诱导生芽阶段，对于后续的增殖、壮苗、生根等阶段，现有技术中没有记载。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种芫花的组织培养方法，诱导采用低氮培养基培养，增殖、壮苗、生根采用低铵态氮培养基培养，减少了芫花的玻璃化现象；在整个芫花组织培养中采用基本配方1/3MS和花宝1号组合在一起的培养基，添加叶酸、盐酸硫胺素形成不同的培养基配方，以满足不同阶段苗木对营养的需求；通过采用母本遮光处理的方式，极大提高了芫花的诱导成活率，可以在短时间内得到更多的芫花苗。
本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种芫花组织培养方法，所述培养方法包括，芫花外植体的前处理、芫花外植体的采取、芫花外植体的消毒、芫花外植体的诱导培养、芫花芽的增殖培养、芫花芽的壮苗培养、芫花苗的生根培养；
其中，所述前处理包括选取芫花高40～60cm中等大小的无病无虫害的目标母株，将盆栽苗搬入温室大棚遮光50％处理一个月，促使盆栽苗长出嫩芽枝条，在此期间只浇水不施肥，从盆栽苗基部浇水，避免水落到新长出嫩芽枝条上增加组培污染率；一个月之后进行采集，将采集好的芫花外植体进行消毒；消毒完成后进行诱导培养；
所述诱导培养基由1/3MS+KT 0.5～2mg/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8，每瓶接种一个外植体；所述增殖培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+6-BA0.1～0.3mg/L+KT 0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8；所述壮苗培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+KT0～0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8；所述生根培养的培养基由1/3MS+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+IBA1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8。
优选地，所述诱导培养基由1/3MS+KT 2mg/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成；所述增殖培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+6-BA0.25mg/L+KT 0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成；所述壮苗培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+KT0.2mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成。
进一步地，所述采集包括将用75％的酒精消毒过的剪刀剪取芫花盆栽苗新长出的长约10～15cm的嫩芽枝条，去除全部叶片，剪截成带2～3个腋芽的茎段作为外植体。
进一步地，所述消毒包括将采集好的芫花外植体在超净工作台上先用75％的酒精消毒60s，并用手不断摇晃；之后倒掉酒精用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后倒入2％的NaClO溶液，并加入3～5滴吐温80消毒12～15分钟，轻轻摇晃使外植体与消毒液充分接触。
进一步地，所述诱导培养具体为，将消毒好后的外植体用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后用消毒好的镊子将消毒好的外植体夹到无菌盘中，用无菌手术刀将外植体的两端漂白的部分切掉，将消毒好后的外植体切割成一段一个腋芽，接种在含有诱导培养基的培养瓶中；将接种好的培养瓶放在培养架上黑暗培养7天，有利于减少褐化，7天后打开灯光，灯源为冷光源，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果培养15天后外植体长出单芽。
进一步地，所述增殖培养具体为，将诱导培养后的单芽从茎段上切割下来，将单芽分割成茎段接种至含有增殖培养基的培养瓶中，每瓶接种3～5个茎段；光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果单芽接种到增殖培养基中30天左右会长出3～5棵芽。
进一步地，所述壮苗培养具体为，将增殖培养基中新长出来的芽，切割成茎段和顶芽，茎段接种在增殖培养基上继续增殖，顶芽接种至含有壮苗培养基的培养瓶中，每瓶接种20个顶芽；光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果30天之后丛生芽会长成具有2～3个节和4～5片叶子的组培苗。
进一步地，所述生根培养具体为，等到芫花中的顶芽在壮苗培养基中长至2～3个节时，将小苗接种至含有生根培养基的培养瓶中，每瓶接种15棵苗；暗培养7天，然后打开灯管光照强度控制在2000lx-3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果30天之后会长出3条以上的根。
本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明提供的芫花组织培养方法，具有以下几点优势：
1)本发明采用无性组织培养的技术，提高了芫花的繁殖率和花色的稳定性，传统的繁殖方式比如播种可能会存在花色变异的现象，导致品种不稳地；芫花有三个花色(紫色、白色、粉色)属于公司变异新品种，如果采用传统方法播种繁殖会导致形状变异无法稳定遗传，而采用本发明方法，繁殖量呈指数倍增加，能满足芫花商业化生产需求；
2)本发明在外植体消毒过程中进行了外植体遮光处理，使外植体消毒成功及消毒后的成活率更高；
3)本发明在外植体诱导阶段采用黑暗培养7天，极大减少了外植体褐化死亡的数量，增加外植体腋芽生长的成功率；
4)本发明在生根诱导阶段采用黑暗培养7天，减少了小苗的褐化程度，使切口加速愈合长根；
5)本发明在壮苗和生根培养中采用了不同的培养基，先获得芫花的芽，然后将芽接入壮苗培养基中获得较大的品质好的苗，再将小苗接入生根培养基中，这样做可以大大提高芫花苗的生根率和成活率；
6)本发明采用低铵态氮培养基，大大降低了芫花玻璃化比例；
7)本发明额外添加了盐酸硫胺素、叶酸大大增加了外植体芽的生长速度；其中，添加叶酸有利于芽的生长；额外添加的硫酸硫胺素也促进了苗的生长。
具体实施方式
下面通过具体实施例来进一步说明本发明。但这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
操作步骤及培养方法：
1)选取芫花高40～60cm中等大小的无病无虫害的盆栽苗，将盆栽苗搬入温室大棚遮光50％处理一个月(视嫩芽生长速度而定)。促使盆栽苗长出嫩芽枝条，在此期间只能浇水不宜施肥，浇水要从盆栽苗基部浇水，避免水落到新长出嫩芽枝条上。
2)一个月后，将芫花盆栽苗新长出的长约10～15cm的嫩芽枝条用75％的酒精消毒过的剪刀，剪取新长出来的嫩枝，拿到实验室用手术刀去除全部叶片，用手术刀将嫩芽枝条切割成带2～3个腋芽的茎段作为外植体。另外在户外直接采集没有进行50％遮光的芫花外植体用同样的采集方式进行处理。
3)将采集好的红花荷外植体在超净工作台上先用75％的酒精消毒60s并用手不断摇晃，之后倒掉酒精用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后倒入2％的NaClO溶液并加入3～5滴吐温80消毒15分钟，轻轻摇晃使外植体与消毒液充分接触以达到更好的消毒效果，消毒效果如附表1所示。
4)将消毒好后的外植体用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后用消毒好的镊子将消毒好的外植体夹到无菌盘中，用无菌手术刀将外植体的两端漂白的部分切掉，然后将消毒好后的外植体切割成一段一个腋芽，进行初代诱导实验，实验设置实验激素为1/3MS+KT(0.5mg、1mg、2mg)/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L以及激素为1/3MS+6-BA(0.5mg、1mg、2mg)/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L的培养基中进行实验对比，PH调至5.6～5.8之间，每瓶接种一个外植体。将接种好的培养瓶放在培养架上黑暗培养7天，7天后打开灯光，光照强度控制在2000lx-3000lx之间，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据附表2实验结果对比优选3号处理培养基，在3号培养基中培养一个月后外植体会长出健康的单芽。
5)将芽从茎段上切割下来，将芽分割成茎段，将切割好的茎段接种至增殖实验培养基中，实验设置实验激素为1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+6-BA(0.1mg、0.15mg、0.2mg、0.25mg、0.3mg)/L+KT0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L，pH调至5.6～5.8之间，每瓶接10个茎段，光照强度控制在2000lx～3000lx之间，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据附表3的实验结果优选4号处理培养基，在4号处理培养基中培养30天一棵芽会平均增殖成4棵芽左右。
6)将增殖培养基中新长出来的芽，切割成茎段和顶芽，茎段接种在增殖培养基上继续增殖；顶芽接种至壮苗实验培养基中，实验设置实验激素为1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+KT(0mg、0.1mg、0.2mg、0.5mg)/L+糖20g/L+琼脂6g/L，PH值调至5.6～5.8之间，每瓶接种10个顶芽，光照强度控制在2000lx～3000lx之间，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据附表4的实验结果优选3号处理培养基，在3号处理培养基中培养30天之后丛生芽大部分会长成高2cm的小苗。
7)将壮苗培养基中的高度不同的芽接种至由1/3MS+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+IBA 1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L构成的生根培养基中，pH调至5.6～5.8之间，每瓶接种10棵苗，暗培养7天，然后打开灯管光照强度控制在3000lx～5000lx之间，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据附表5的实验观察结果选取高度为2cm或者高于2cm的芫花苗培养30天之后100％会长出3条以上的根，根系状态好，移植到大棚的成活率高达90％以上。
表1做了前处理的芫花和没做前处理的芫花消毒后污染率、外植体褐化率、外植体成活率对比。
注：前处理为50％遮光处理，每个编号接种20瓶，每瓶接种一个茎段外植体，培养条件一样。
表2不同激素配比对芫花外植体芽的萌发和生长情况的影响。
注：每个处理接种20瓶，每瓶接种一个茎段，培养条件相同。
表3不同激素配比对芫花茎段的增殖系数以及增殖芽生长情况的影响。
注：每个处理接种20瓶，每瓶接种10个茎段，培养条件相同。
表4不同激素配比对芫花芽的壮苗影响。
注：每个处理接种20瓶，每瓶接种10棵芽，培养条件相同。
表5不同高度的苗在生根培养基中的生根率。
注：每个处理接种20瓶，每瓶接种10棵芽，培养条件相同。
经过不同配方的试验，优选的培养基为：
诱导培养基：1/3MS+KT2 mg/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L；
增殖培养基：1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+6-BA0.25mg/L+KT0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L；
壮苗培养基：1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+KT0.2mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L；
生根培养基：1/3MS+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+IBA 1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L。
以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。
Claims (8)
1.一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述培养方法包括，芫花外植体的前处理、芫花外植体的采取、芫花外植体的消毒、芫花外植体的诱导培养、芫花芽的增殖培养、芫花芽的壮苗培养、芫花苗的生根培养；
其中，所述前处理包括选取芫花高40～60cm中等大小的无病无虫害的目标母株，将盆栽苗搬入温室大棚遮光50％处理一个月，促使盆栽苗长出嫩芽枝条，在此期间只浇水不施肥，从盆栽苗基部浇水，避免水落到新长出嫩芽枝条上增加组培污染率；一个月之后进行采集，将采集好的芫花外植体进行消毒；消毒完成后进行诱导培养；
所述诱导培养基由1/3MS+KT 0.5～2mg/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8，每瓶接种一个外植体；所述增殖培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+6-BA0.1～0.3mg/L+KT 0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8；所述壮苗培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+KT0～0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8；所述生根培养的培养基由1/3MS+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+IBA1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成，pH调至5.6～5.8。
2.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述诱导培养基由1/3MS+KT 2mg/L+NAA0.1mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成；所述增殖培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+6-BA0.25mg/L+KT 0.5mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成；所述壮苗培养的培养基由1/3MS+花宝1号1g/L+盐酸硫胺素2ml/L+叶酸2ml/L+KT0.2mg/L+糖20g/L+琼脂6g/L组成。
3.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述采集包括将用75％的酒精消毒过的剪刀剪取芫花盆栽苗新长出的长约10～15cm的嫩芽枝条，去除全部叶片，剪截成带2～3个腋芽的茎段作为外植体。
4.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述消毒包括将采集好的芫花外植体在超净工作台上先用75％的酒精消毒60s，并用手不断摇晃；之后倒掉酒精用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后倒入2％的NaClO溶液，并加入3～5滴吐温80消毒12～15分钟，轻轻摇晃使外植体与消毒液充分接触。
5.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述诱导培养具体为，将消毒好后的外植体用无菌水清洗3～5次，每次清洗一分钟，然后用消毒好的镊子将消毒好的外植体夹到无菌盘中，用无菌手术刀将外植体的两端漂白的部分切掉，将消毒好后的外植体切割成一段一个腋芽，接种在含有诱导培养基的培养瓶中；将接种好的培养瓶放在培养架上黑暗培养7天，有利于减少褐化，7天后打开灯光，灯源为冷光源，光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果培养15天后外植体长出单芽。
6.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述增殖培养具体为，将诱导培养后的单芽从茎段上切割下来，将单芽分割成茎段接种至含有增殖培养基的培养瓶中，每瓶接种3～5个茎段；光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果单芽接种到增殖培养基中30天左右会长出3～5棵芽。
7.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述壮苗培养具体为，将增殖培养基中新长出来的芽，切割成茎段和顶芽，茎段接种在增殖培养基上继续增殖，顶芽接种至含有壮苗培养基的培养瓶中，每瓶接种20个顶芽；光照强度为2000lx～3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果30天之后丛生芽会长成具有2～3个节和4～5片叶子的组培苗。
8.如权利要求1所述的一种芫花的组织培养方法，其特征在于：所述生根培养具体为，等到芫花中的顶芽在壮苗培养基中长至2～3个节时，将小苗接种至含有生根培养基的培养瓶中，每瓶接种15棵苗；暗培养7天，然后打开灯管光照强度控制在2000lx-3000lx，光照时间为16小时，温度为25～28℃，根据实验结果30天之后会长出3条以上的根。
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