CN112841030B

CN112841030B - 一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法

Info

Publication number: CN112841030B
Application number: CN202110105358.0A
Authority: CN
Inventors: 宁坤; 马艳; 周婷; 王耀龙
Original assignee: Institute of Botany of CAS; Jinling Institute of Technology
Current assignee: Institute of Botany of CAS; Jinling Institute of Technology
Priority date: 2021-01-26
Filing date: 2021-01-26
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-01-26
Also published as: CN112841030A

Abstract

一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法，属于植物培养技术领域。其主要包含以下步骤：1）制备秋子梨无菌材料；2）茎段培养形成芽；3）芽诱导生根；4）炼苗和移栽。本发明的有益之处是：采用本发明所提供的秋子梨离体繁殖方法，具有培养周期短，繁殖系数高，遗传稳定性强以及移栽成活率高的特性，可缩减秋子梨组培繁育环节，节约时间成本，且通过此法获得的植株，根系及茎秆粗壮，新梢长势好，移栽后的成活率高达95%以上。

Description

一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说涉及一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法。

背景技术

梨为蔷薇科（Rosaceae）梨属（Pyrus L.）落叶果树，属于世界性的重要果树树种，在全球超过80多个国家均有栽培和分布，其栽培历史悠久，至少有3000多年的历史。梨品种资源丰富，广泛认可的梨属植物有22种，中国起源的占13种，中国乃世界上梨品种资源最为丰富的国家。在我国主要栽培的梨种包括：白梨、砂梨、秋子梨及新疆梨。秋子梨（Pyrus ussuriensis Maxim.）在我国寒冷地区的果树生产中占有十分重要的地位，近年来品质退化较为严重，大大降低了其果实品质，对品质进行遗传改良研究意义重大。梨树多采用嫁接方式进行繁殖，存在可供选用的优质接穗量少，嫁接效率低下及投入成本高的问题，因此造成生产中苗木相对短缺的现状。

梨品种再生较为困难，再生率低下，且不同品种之间再生率差异较大。关于梨离体培养的研究多集中于西洋梨品种，有关秋子梨的再生报道甚少，建立高效再生体系，对于推动秋子梨品种选育研究尤为重要。

植物组织培养过程中的器官发生途径可以分为间接器官发生与直接器官发生两种途径。间接器官发生途径要经过愈伤组织这一阶段，培养耗时长且易发生体细胞无性系变异，变异存在着不定向性，以及不可控性，这种器官发生途径不稳定，不适用于以性状定向改良为目标的基因工程育种；直接器官发生途径可以不经过愈伤组织阶段直接分化出器官，培养周期短、变异小、遗传稳定，更适合于遗传转化研究。为此，建立秋子梨直接器官发生途径的再生体系迫在眉睫，一方面成为离体植株快速繁殖的有效途径，另一方面也是对其进行遗传转化的关键环节。

发明内容

本发明旨在短期内批量获得一致性状稳定的优良繁育材料。为了完成上述目的，本发明利用秋子梨茎段作为外植体，选取茎段进行芽的诱导与增殖，在获得大量芽的前提下进行生根培养，能够最大限度的保持亲本的优良性状，同时缩短了繁育周期，获得高效及快速的繁殖体系。

本发明采用了以下技术方案：

第一步：制备秋子梨无菌材料，首先剪取梨树生长健壮且无病虫害的当年生枝条，将枝条剪成1.0~2.0 cm左右长度的茎段，保证每个茎段上至少留有一个饱满的芽体，且芽的生长位置位于茎段上端1/3处。将剪好的茎段放入玻璃烧杯中，浸入含有8~10%洗衣粉的水溶液中清洗5~8 min，随后置于流动水下流动冲洗30~40 min。用1000倍的多菌灵溶液浸泡30min，10%的84消毒液浸泡20 min，将茎段用蒸馏水冲洗5次，放入无菌环境内，使用75%酒精浸泡30 s，放入20%次氯酸钠溶液（每升量中加入3滴吐温80）中浸泡6~10 min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干茎段表面的水分。

第二步：茎段培养形成芽，将上一步获得的无菌茎段外植体在无菌条件下接种到芽诱导培养基中，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16 h/d下培养20~25 d。

优选的，所述的芽诱导培养基的基本培养基为改良1/2MS（去除肌醇），添加2.0mg/L 6-BA和0.2 mg/L IBA，每升培养基中添加30g 蔗糖和7.5g 琼脂，pH调至5.5~6.0。

第三步：芽诱导生根，无菌条件下取出诱导良好的芽，切下茎长1.0~1.5 cm的芽，接种在诱导不定根生成的生根培养基上，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养15~20d。

优选的，所述的生根培养基以WPM为基本培养基，添加1.5 mg/L IBA和0.15 mg/LNAA。

第四步：炼苗和移栽，生根良好的秋子梨幼苗的组培瓶开启三分之一大小的开口，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3 d。取出幼苗，洗净根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（按照3:2:1比例）构成的混合基质，继续培养。

本发明的有益效果是：

在20%的次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80，吐温80是一种非离子型表面活性剂，可以使次氯酸钠消毒更加彻底。

选取秋子梨当年生位于树冠上部外围的嫩枝，其生长旺盛，有机物质同化较快，里面营养充足，在培养过程中自身养分供给及营养吸收能力强。

秋子梨幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（3:2:1）构成的混合基质，其土壤营养，含水量及通透性都有保障，移栽成活率大大提高，约95%。

利用上述技术方法建立秋子梨组培再生体系，操作简便，污染率低，成活率高，培养周期短（45d即可以完成移栽）。

附图说明

图1秋子梨茎段诱导形成芽。

图2秋子梨芽诱导生根。

具体实施方式

实施例1

使用本发明提供的方案进行秋子梨的再生培育，具体的如下：

制备秋子梨无菌材料：剪取生长健壮且无病虫害的梨树当年生枝条，将枝条剪成1.0~2.0 cm长度的茎段，保证每个茎段上至少留有一个饱满的芽体，且芽的生长位置位于茎段上端1/3处。将剪好的茎段放入玻璃烧杯中，浸入含有10%洗衣粉的水溶液中清洗5~8min，随后置于自来水下流动冲洗30~40 min。用1000倍的多菌灵溶液浸泡30min，10%的84消毒液中浸泡20 min，将茎段用蒸馏水冲洗5次，放入超净工作台内，然后用75%酒精浸泡30s，放入20%次氯酸钠溶液（每升量中加入3滴吐温80）中浸泡6~10 min，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干茎段表面的水分。共计制备1000份秋子梨无菌材料。

实施例2

茎段培养形成芽：灭菌获得的茎段外植体接种到芽诱导培养基中，培养基成分为改良1/2MS（去除肌醇）、改良MS(去除肌醇)、1/2MS、MS。

添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，每升培养基中添加30 g 蔗糖和7.5 g 琼脂，pH调至5.8。

实验设置三次重复，每种培养基下接种90瓶（一次重复接种30瓶），每瓶里面放入一个灭菌过的茎段，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16 h/d下培养20~25 d。

实施例3

芽诱导生根：在无菌条件下取出实施例2制备的诱导良好的芽，切下茎长1.0~1.5cm的芽，接种在诱导不定根的生根培养基上。生根培养基以WPM为基本培养基，分别添加1.5mg/L IBA和0.15 mg/L NAA。

实验设置三次重复，每种培养基下接种90瓶（一次重复接种30瓶），每瓶里面放入一个芽。在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养15~20d。

实施例4

炼苗和移栽：将已经生根良好的梨树幼苗的组培瓶开启三分之一大小的开口，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3d。取出幼苗，用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（按照3:2:1比例）构成的混合基质，置于营养钵（12*10cm）内培养。20 d后测定得出其移栽成活率可达95%。

以上实施例1所对应的实验结果如下：

以上实施例2所对应的实验结果如下：

茎段诱导芽所用培养基	芽诱导率（%）
		改良1/2MS	95.6 ± 3.5
改良MS	74.7 ± 4.1
		1/2MS	78.3 ± 5.4
MS	56.5 ± 4.8

以上实施例3所对应的实验结果如下：

诱导生根培养基	诱导生根率（%）
		WPM	92.4 ± 4.3
MS	70.5 ± 5.8

以上实施例4所对应的实验结果如下：

生根培养基	炼苗成活率（%）	移栽成活率（%）
			WPM	96.4 ± 3.5	95.2 ± 3.4

由实施例1-实施例4相对比可知，本申请提供的方案在灭菌处理时，增加使用20%的次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80，吐温80是一种非离子型表面活性剂，可以使次氯酸钠对秋子梨茎段的消毒更加彻底，处理时长为10 min时其最终的污染率为14.6%。

选取生长健壮的茎段，切至长度1.0~2.0 cm，接种到芽诱导的改良1/2MS培养基上，去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。

秋子梨树幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（3:2:1）构成的混合基质，其土壤营养，含水量及通透性都有保障，移栽成活率大大提高。

利用上述技术方法建立梨树组培再生体系，操作简便，污染率低，成活率高，培养周期短（45 d即可以完成移栽）。

Claims

1.一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法，其特征在于：处理步骤如下：

第一步，制备秋子梨无菌材料，即选取秋子梨当年生枝条，将枝条剪成1 .0 ~ 2 .0 cm长度的茎段，放入容器中，浸入含有洗衣粉的水溶液中清洗，随后置于自来水下流动冲洗，用稀释的多菌灵溶液浸泡后，再用稀释的消毒液浸泡，将茎段用蒸馏水冲洗，移入无菌环境中，75%酒精浸泡后，放入次氯酸钠溶液中浸泡，无菌水冲洗，处理干净茎段表面的水分；第二步，即将无菌秋子梨茎段培养形成芽，将第一步获得的灭菌茎段外植体接种到芽诱导培养基中，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16 h/d下培养20 ~ 25d，无菌秋子梨茎段培养形成芽，所述的芽诱导的培养基为改良1/2MS+2 .0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA+30 g蔗糖+7 .5 g 琼脂，其中改良1/2MS是1/2MS去除肌醇，pH调至5 .5 ~ 6.0；第三步，芽诱导生根，将第二步获得的材料在无菌条件下取出诱导良好的芽，切下茎长1 .0 ~ 1 .5 cm的芽，接种在诱导不定根的生根培养基上，进行生根培养，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养15 ~ 20d，至芽生根形成幼苗，所述的生根培养基为WPM为基本培养基+1 .5 mg/L IBA+0 .15 mg/L NAA；第四步：炼苗和移栽；将第三步中已经生根良好的秋子梨幼苗组培瓶进行开盖炼苗，首先开启三分之一大小的开口，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3 d，取出幼苗，用自来水洗净根部残留的培养基，移栽至混合基质。

2.根据权利要求1所述的一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法，其特征在于：所述的茎段上至少有一个饱满的芽体，且芽的生长位置位于茎段上端1/3处。

3.根据权利要求1所述的一种秋子梨茎段高效再生体系的建立方法，其特征在于：所述的混合基质由草炭土、珍珠岩和蛭石构成，比例为3:2:1。