CN112690216B

CN112690216B - 一种银杏高效快速组培繁殖方法

Info

Publication number: CN112690216B
Application number: CN202110106970.XA
Authority: CN
Inventors: 宁坤; 马艳; 周婷; 陈娅; 王耀龙
Original assignee: Institute of Botany of CAS; Jinling Institute of Technology
Current assignee: Institute of Botany of CAS; Jinling Institute of Technology
Priority date: 2021-01-27
Filing date: 2021-01-27
Publication date: 2022-11-08
Anticipated expiration: 2041-01-27
Also published as: CN112690216A

Abstract

一种银杏高效快速组培繁殖方法，属于植物培养技术领域。其主要包含以下步骤：1）制备银杏组织无菌材料；2）胚培养；3）不定芽增殖培养；4）生根培养；5）炼苗和移栽。本发明的有益之处是：采用本发明所提供的银杏快速组培繁殖方法，具有增殖周期短，繁殖系数高和移栽成活率高的特性，可缩减银杏组培繁育环节，保持植株优异性状，节约时间成本，且通过此法获得的植株，根系及茎秆粗壮，新梢长势好，移栽后的成活率高达92%。

Description

一种银杏高效快速组培繁殖方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体的说涉及一种银杏高效快速组培繁殖方法。

背景技术

银杏（Ginkgo biloba L.）是新生代第四纪冰川期的孑遗植物，为我国独存的叶果材兼优的珍稀名贵树种，现仅存一科一属一种，素有裸子植物“活化石”之称。我国拥有世界银杏资源的90%以上，大面积种植区包含山东、河南、江苏、浙江、安徽南部、江西北部、湖南、湖北、广西、四川等地。银杏被广泛应用于园林景观绿化及城市行道树中，具有较高的经济、生态及文化价值。

银杏为雌雄异株植物，实生苗开花结果时间较长，常规育种效率低、周期长。利用植物组织培养技术开展银杏优良品种的繁育，是苗木生产过程中最行之有效的技术之一。银杏组织培养研究主要以配子体、原生质体、成熟与未成熟胚以及营养器官为材料，探究不同种类及浓度的激素对形态发生与分化的影响，但其存在着污染率高，生产成本高及成活率低的突出问题。

发明内容

本发明旨在降低污染率的同时提升存活率，同时实现短期内获得批量一致稳定性状的优良繁育材料。本发明采用了以下技术方案：

第一步：制备银杏组织无菌材料。具体为：选取银杏种子作为培养材料，将种子浸入含有洗衣粉的水溶液中清洗种子表面，把种子放入容器中置于流动水下流动冲洗，而后用多菌灵溶液浸泡，用蒸馏水冲洗种子并放无菌环境内，采用酒精浸泡后，使用无菌水冲洗后再放入次氯酸钠溶液中浸泡一定时间，无菌水冲洗后，去除种子表面水分。

具体的为选取表面干燥平整、圆润饱满的银杏种子，浸入含有10%洗衣粉的水中清洗种子表面5~10 min，随后把种子放入1L玻璃烧杯中，置于自来水下流动冲洗30~40 min，采用800~1000倍的多菌灵溶液浸泡30 ~40 min，蒸馏水冲洗5~10次，超净工作台内用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗后放入15%次氯酸钠溶液（每升量中加入3滴吐温80）中浸泡3~7min，无菌水冲洗5次，无菌纸吸干种子表面水分。

第二步：胚培养，对第一步获得的培养材料在无菌环境内破壳，取出内部完整的银杏胚，后将银杏胚接种于改良1/2MS培养基（去除肌醇）上进行培养。

优选的培养条件为：在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16h/d下培养14 d。

具体的：

首先，对灭菌后的种子材料进行种皮破壳处理，利用无菌破壳器具将种子夹碎，取出银杏种子中的完整胚。

再次，将银杏胚接种于改良1/2MS培养基（去除肌醇）上进行培养；

胚培养过程中的光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养14 d。

第三步：不定芽增殖培养，从第二步获得的幼苗选取生长健壮的幼苗茎段为材料，在无菌条件下将其切至1.5 ~3.0 cm长度，接种到改良WPM培养基（去除肌醇），每升培养基中加入10 mgL-丙氨酰-L-谷氨酰胺，5 mg甘氨酸，20 mg硫酸腺嘌呤，添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.02 mg/L Thidiazuron激素组合，琼脂用量为6.5 g/L，蔗糖为30 g/L，pH调至5.5~6.0。先进行暗培养15 d，再转为光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养20 d。

第四步：生根培养，无菌条件下选取诱导良好的不定芽，切下茎长1.0~2.0 cm的不定芽，接种在生根培养基上，在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养30 d。

优选的，生根培养基以1/2MS为基本培养基，添加0.5 mg/L IBA，0.05 mg/L NAA，6.5 g/L琼脂和25 g/L蔗糖，pH为5.8。

第五步：炼苗和移栽，将生根银杏幼苗的组培瓶盖子打开，开口处于三分之一大小状态，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3 d，取出幼苗用自来水洗去根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（按照3:2:1比例）构成的混合基质，置于营养钵（12*10 cm）内培养。

本发明的有益效果是：

在15%次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80，吐温80是一种非离子型表面活性剂，可以使次氯酸钠消毒更加彻底。

秋季十月中旬选取树龄超过30年的银杏，选取经过生理后熟的优质种子，内部生长的胚长度可达到0.5~1.0 cm，内生菌含量较少，能够降低污染率，且维持较高的萌发率。

利用破壳器具将银杏种皮夹碎，取出内部完整的胚，保证胚的两片子叶完好，子叶作为营养贮存体，能够在胚的培养过程中提供部分营养。

幼苗长出后选取生长健壮的茎段，切至长度1.5~3.0cm左右，接种到不定芽增殖的改良WPM培养基上，去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。

切取茎长1.0~2.0 cm的不定芽进行生根培养，采用1/2MS为基本培养基，由于培养基中的一些无机盐成分不利于根的形成，要通过适量降低无机盐的浓度来促进根的分化，因此大量元素要降到1/2左右。生根过程中降低蔗糖用量是为了刺激生根加强其自养能力。

银杏幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（3:2:1）构成的混合基质，其土壤营养，含水量及通透性都有保障，移栽成活率大大提高。

本发明利用银杏胚作为外植体，出苗后选取茎段进行不定芽的诱导与增殖，在获得大量不定芽的前提下进行生根培养，能够最大限度的保持亲本的优良性状，同时缩短了繁育周期，获得高效及快速的繁殖方法。整个方案操作简便，污染率低，成活率高，培养周期短。

附图说明

图1银杏种子中挑取出的成熟胚。

图2银杏胚诱导形成幼苗。

图3幼苗茎段诱导形成不定芽。

图4不定芽诱导生根。

具体实施方式

使用本申请提供的方法培育一批银杏，具体的步骤如下：

实施例1

制备银杏组织无菌材料：选取表面干燥平整、圆润饱满的银杏种子，浸入含有10%洗衣粉的水中清洗种子表面5 min，随后把种子放入1L玻璃烧杯中，置于自来水下流动冲洗30 min，分别采用800~1000倍的多菌灵溶液浸泡30 min。蒸馏水冲洗5次，超净工作台内用75%酒精浸泡30 s，无菌水冲洗后放入15%次氯酸钠溶液（每升量中加入3滴吐温80）中浸泡3、4、5、6、7 min（共5种不同处理时间），无菌水冲洗5次，无菌纸吸干种子表面水分。

银杏种子收集在秋季十月中旬，主要选取树龄超过30年的银杏树种子，并挑选经过生理后熟的优质种子。

实施例2

胚培养：超净台内利用灭菌过的破壳器具将种皮夹碎，取出种子内部完整的胚。将银杏胚分别接种于改良1/2MS（去除肌醇）、改良MS（去除肌醇）、改良1/2WPM（去除肌醇）和改良WPM（去除肌醇）四种培养基上进行培养。

实验设置三次重复，每种培养基下接种60瓶（每一重复接种20瓶），每瓶里面放入3个完整的胚。在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光周期为16 h/d下培养14d。

实施例3

不定芽增殖培养：银杏胚培养获得幼苗后，从中选取生长健壮的幼苗，切取茎段部分，无菌条件下将其切至1.5~3.0 cm长度，分别接种到改良1/2MS（去除肌醇）、改良MS（去除肌醇）、改良1/2WPM（去除肌醇）和改良WPM（去除肌醇）四种培养基上。每升培养基中加入10mgL-丙氨酰-L-谷氨酰胺，5 mg甘氨酸，20 mg硫酸腺嘌呤，添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+0.02 mg/L Thidiazuron激素组合，琼脂用量为6.5 g/L，蔗糖为30 g/L，pH调至5.8。

实验设置三次重复，每种培养基下接种60瓶（每一重复接种20瓶），每瓶里面放入1个茎段。先进行暗培养15 d，再转为光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养20 d。

实施例4

生根培养：无菌条件下选取诱导良好的不定芽，切下茎长1.0~2.0 cm的不定芽，接种在生根培养基上。生根共设置1/2MS、MS、1/2WPM和WPM四种基本培养基，分别添加0.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA，琼脂用量6.5 g/L，蔗糖用量降至25 g/L，pH为5.8。

实验设置三次重复，每种培养基下接种60瓶（每一重复接种20瓶），每瓶里面放入1个不定芽。在光照强度为2800 Lux，培养室温度为25±2 ℃，光照条件为16 h/d下培养30d。

实施例5

炼苗和移栽：将生根良好的内含银杏植株的组培瓶盖子打开，开启程度达到三分之一大小的开度，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3 d。取出幼苗，用自来水洗净根部残留的培养基，移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石（按照3:2:1比例）构成的混合基质，置于营养钵（12*10 cm）内培养。20 d后测定得出其移栽成活率可达92%。

以上实施例1所对应的实验结果如下：

以上实施例2所对应的实验结果如下：

胚培养所用培养基	胚萌发率（%）
		改良1/2MS	94.6 ± 3.7
改良MS	71.3 ± 4.5
		改良1/2WPM	85.4 ± 5.1
改良WPM	66.8 ± 5.2

以上实施例3所对应的实验结果如下：

诱导不定芽培养基	不定芽增殖率（%）
		改良1/2MS	76.5 ± 5.6
改良MS	83.1 ± 6.4
		改良1/2WPM	85.3 ± 6.1
改良WPM	94.4 ± 3.2

以上实施例4所对应的实验结果如下：

诱导生根培养基	诱导生根率（%）
		1/2MS	95.7 ± 3.4
MS	72.3 ± 5.6
		1/2WPM	83.5 ± 6.8
WPM	68.6 ± 5.2

以上实施例5所对应的实验结果如下：

生根培养基	炼苗成活率（%）	移栽成活率（%）
			1/2MS	96.5 ± 4.2	92.4 ± 3.1

由实施例1-5的实验结果可以看出：

在15%次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80，吐温80是一种非离子型表面活性剂，可以使次氯酸钠消毒更加彻底，处理时长为7 min时其最终的污染率为12.5%。

幼苗长出后选取生长健壮的茎段，切至长度1.5~3.0 cm，接种到不定芽增殖的改良WPM培养基上，去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。

本发明提供的银杏高效快速组培繁殖方法，其从银杏胚的培养到移栽至混合基质，整个培养周期最短为85 d，移栽成活率达到92%。

Claims

1.一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：包括以下步骤：第一步：制备银杏组织无菌材料，即首先选取银杏种子作为培养材料，将种子浸入含有洗衣粉的水溶液中一定时间，清洗种子表面后把种子放入容器中置于流动水下流动冲洗，而后用多菌灵溶液浸泡，用蒸馏水冲洗种子并放入无菌环境内，采用酒精浸泡后，使用无菌水冲洗后再放入次氯酸钠溶液中浸泡一定时间，无菌水冲洗后，去除种子表面水分；第二步：胚培养，对第一步获得的培养材料在无菌环境内破壳，取出内部完整的银杏胚，并接种于改良1/2MS培养基上进行培养，获得幼苗，其中，改良1/2MS培养基为去除肌醇的1/2MS培养基；第三步：不定芽增殖培养，即从第二步获得的幼苗选取生长健壮的幼苗茎段为材料，在无菌条件下将茎段切至1.5 ~ 3 .0cm长度，接种到不定芽增殖培养基，并先进行暗培养，再转为光照培养，获得不定芽，不定芽增殖培养基为改良WPM培养基+10 mg/L L -丙氨酰-L-谷氨酰胺+5 mg/L 甘氨酸+20 mg/L 硫酸腺嘌呤+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.02 mg/L Thidiazuron+6 .5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖,其中改良WPM培养基为去除肌醇的WPM培养基，pH调至5 .5 ~ 6 .0；第四步：生根培养，将第三步获得的不定芽切下，转入生根培养基进行生根培养，其中，生根培养基为1/2MS基础培养基+0 .5 mg/L IBA+0 .05 mg/L NAA+6 .5 g/L琼脂+25 g/L蔗糖，pH调整为5 .5 ~ 6 .0；第五步：炼苗和移栽，第四步中生根良好的内含银杏植株的组培瓶盖子打开部分，组培室内放置3 d，再将瓶口完全开启，继续放置3d，取出幼苗，用自来水洗净根部残留的培养基，移栽至混合基质，置于营养钵内培养。

2.根据权利要求1所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法，其特征在于：所述不定芽切下的茎长为1 .0 ~ 2 .0 cm。