CN112690216B - 一种银杏高效快速组培繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
一种银杏高效快速组培繁殖方法,属于植物培养技术领域。其主要包含以下步骤:1)制备银杏组织无菌材料;2)胚培养;3)不定芽增殖培养;4)生根培养;5)炼苗和移栽。本发明的有益之处是:采用本发明所提供的银杏快速组培繁殖方法,具有增殖周期短,繁殖系数高和移栽成活率高的特性,可缩减银杏组培繁育环节,保持植株优异性状,节约时间成本,且通过此法获得的植株,根系及茎秆粗壮,新梢长势好,移栽后的成活率高达92%。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,具体的说涉及一种银杏高效快速组培繁殖方法。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)是新生代第四纪冰川期的孑遗植物,为我国独存的叶果材兼优的珍稀名贵树种,现仅存一科一属一种,素有裸子植物“活化石”之称。我国拥有世界银杏资源的90%以上,大面积种植区包含山东、河南、江苏、浙江、安徽南部、江西北部、湖南、湖北、广西、四川等地。银杏被广泛应用于园林景观绿化及城市行道树中,具有较高的经济、生态及文化价值。
银杏为雌雄异株植物,实生苗开花结果时间较长,常规育种效率低、周期长。利用植物组织培养技术开展银杏优良品种的繁育,是苗木生产过程中最行之有效的技术之一。银杏组织培养研究主要以配子体、原生质体、成熟与未成熟胚以及营养器官为材料,探究不同种类及浓度的激素对形态发生与分化的影响,但其存在着污染率高,生产成本高及成活率低的突出问题。
发明内容
本发明旨在降低污染率的同时提升存活率,同时实现短期内获得批量一致稳定性状的优良繁育材料。本发明采用了以下技术方案:
第一步:制备银杏组织无菌材料。具体为:选取银杏种子作为培养材料,将种子浸入含有洗衣粉的水溶液中清洗种子表面,把种子放入容器中置于流动水下流动冲洗,而后用多菌灵溶液浸泡,用蒸馏水冲洗种子并放无菌环境内,采用酒精浸泡后,使用无菌水冲洗后再放入次氯酸钠溶液中浸泡一定时间,无菌水冲洗后,去除种子表面水分。
具体的为选取表面干燥平整、圆润饱满的银杏种子,浸入含有10%洗衣粉的水中清洗种子表面5~10 min,随后把种子放入1L玻璃烧杯中,置于自来水下流动冲洗30~40 min,采用800~1000倍的多菌灵溶液浸泡30 ~40 min,蒸馏水冲洗5~10次,超净工作台内用75%酒精浸泡30 s,无菌水冲洗后放入15%次氯酸钠溶液(每升量中加入3滴吐温80)中浸泡3~7min,无菌水冲洗5次,无菌纸吸干种子表面水分。
第二步:胚培养,对第一步获得的培养材料在无菌环境内破壳,取出内部完整的银杏胚,后将银杏胚接种于改良1/2MS培养基(去除肌醇)上进行培养。
优选的培养条件为:在光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光周期为16h/d下培养14 d。
具体的:
首先,对灭菌后的种子材料进行种皮破壳处理,利用无菌破壳器具将种子夹碎,取出银杏种子中的完整胚。
再次,将银杏胚接种于改良1/2MS培养基(去除肌醇)上进行培养;
胚培养过程中的光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光照条件为16 h/d下培养14 d。
第三步:不定芽增殖培养,从第二步获得的幼苗选取生长健壮的幼苗茎段为材料,在无菌条件下将其切至1.5 ~3.0 cm长度,接种到改良WPM培养基(去除肌醇),每升培养基中加入10 mgL-丙氨酰-L-谷氨酰胺,5 mg甘氨酸,20 mg硫酸腺嘌呤,添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.02 mg/L Thidiazuron激素组合,琼脂用量为6.5 g/L,蔗糖为30 g/L,pH调至5.5~6.0。先进行暗培养15 d,再转为光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光照条件为16 h/d下培养20 d。
第四步:生根培养,无菌条件下选取诱导良好的不定芽,切下茎长1.0~2.0 cm的不定芽,接种在生根培养基上,在光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光照条件为16 h/d下培养30 d。
优选的,生根培养基以1/2MS为基本培养基,添加0.5 mg/L IBA,0.05 mg/L NAA,6.5 g/L琼脂和25 g/L蔗糖,pH为5.8。
第五步:炼苗和移栽,将生根银杏幼苗的组培瓶盖子打开,开口处于三分之一大小状态,组培室内放置3 d,再将瓶口完全开启,继续放置3 d,取出幼苗用自来水洗去根部残留的培养基,移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石(按照3:2:1比例)构成的混合基质,置于营养钵(12*10 cm)内培养。
本发明的有益效果是:
在15%次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80,吐温80是一种非离子型表面活性剂,可以使次氯酸钠消毒更加彻底。
秋季十月中旬选取树龄超过30年的银杏,选取经过生理后熟的优质种子,内部生长的胚长度可达到0.5~1.0 cm,内生菌含量较少,能够降低污染率,且维持较高的萌发率。
利用破壳器具将银杏种皮夹碎,取出内部完整的胚,保证胚的两片子叶完好,子叶作为营养贮存体,能够在胚的培养过程中提供部分营养。
幼苗长出后选取生长健壮的茎段,切至长度1.5~3.0cm左右,接种到不定芽增殖的改良WPM培养基上,去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。
切取茎长1.0~2.0 cm的不定芽进行生根培养,采用1/2MS为基本培养基,由于培养基中的一些无机盐成分不利于根的形成,要通过适量降低无机盐的浓度来促进根的分化,因此大量元素要降到1/2左右。生根过程中降低蔗糖用量是为了刺激生根加强其自养能力。
银杏幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程,移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石(3:2:1)构成的混合基质,其土壤营养,含水量及通透性都有保障,移栽成活率大大提高。
本发明利用银杏胚作为外植体,出苗后选取茎段进行不定芽的诱导与增殖,在获得大量不定芽的前提下进行生根培养,能够最大限度的保持亲本的优良性状,同时缩短了繁育周期,获得高效及快速的繁殖方法。整个方案操作简便,污染率低,成活率高,培养周期短。
附图说明
图1银杏种子中挑取出的成熟胚。
图2银杏胚诱导形成幼苗。
图3幼苗茎段诱导形成不定芽。
图4不定芽诱导生根。
具体实施方式
使用本申请提供的方法培育一批银杏,具体的步骤如下:
实施例1
制备银杏组织无菌材料:选取表面干燥平整、圆润饱满的银杏种子,浸入含有10%洗衣粉的水中清洗种子表面5 min,随后把种子放入1L玻璃烧杯中,置于自来水下流动冲洗30 min,分别采用800~1000倍的多菌灵溶液浸泡30 min。蒸馏水冲洗5次,超净工作台内用75%酒精浸泡30 s,无菌水冲洗后放入15%次氯酸钠溶液(每升量中加入3滴吐温80)中浸泡3、4、5、6、7 min(共5种不同处理时间),无菌水冲洗5次,无菌纸吸干种子表面水分。
银杏种子收集在秋季十月中旬,主要选取树龄超过30年的银杏树种子,并挑选经过生理后熟的优质种子。
实施例2
胚培养:超净台内利用灭菌过的破壳器具将种皮夹碎,取出种子内部完整的胚。将银杏胚分别接种于改良1/2MS(去除肌醇)、改良MS(去除肌醇)、改良1/2WPM(去除肌醇)和改良WPM(去除肌醇)四种培养基上进行培养。
实验设置三次重复,每种培养基下接种60瓶(每一重复接种20瓶),每瓶里面放入3个完整的胚。在光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光周期为16 h/d下培养14d。
实施例3
不定芽增殖培养:银杏胚培养获得幼苗后,从中选取生长健壮的幼苗,切取茎段部分,无菌条件下将其切至1.5~3.0 cm长度,分别接种到改良1/2MS(去除肌醇)、改良MS(去除肌醇)、改良1/2WPM(去除肌醇)和改良WPM(去除肌醇)四种培养基上。每升培养基中加入10mgL-丙氨酰-L-谷氨酰胺,5 mg甘氨酸,20 mg硫酸腺嘌呤,添加0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/LNAA+0.02 mg/L Thidiazuron激素组合,琼脂用量为6.5 g/L,蔗糖为30 g/L,pH调至5.8。
实验设置三次重复,每种培养基下接种60瓶(每一重复接种20瓶),每瓶里面放入1个茎段。先进行暗培养15 d,再转为光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光照条件为16 h/d下培养20 d。
实施例4
生根培养:无菌条件下选取诱导良好的不定芽,切下茎长1.0~2.0 cm的不定芽,接种在生根培养基上。生根共设置1/2MS、MS、1/2WPM和WPM四种基本培养基,分别添加0.5 mg/L IBA+0.05 mg/L NAA,琼脂用量6.5 g/L,蔗糖用量降至25 g/L,pH为5.8。
实验设置三次重复,每种培养基下接种60瓶(每一重复接种20瓶),每瓶里面放入1个不定芽。在光照强度为2800 Lux,培养室温度为25±2 ℃,光照条件为16 h/d下培养30d。
实施例5
炼苗和移栽:将生根良好的内含银杏植株的组培瓶盖子打开,开启程度达到三分之一大小的开度,组培室内放置3 d,再将瓶口完全开启,继续放置3 d。取出幼苗,用自来水洗净根部残留的培养基,移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石(按照3:2:1比例)构成的混合基质,置于营养钵(12*10 cm)内培养。20 d后测定得出其移栽成活率可达92%。
以上实施例1所对应的实验结果如下:
以上实施例2所对应的实验结果如下:
胚培养所用培养基 | 胚萌发率(%) |
改良1/2MS | 94.6 ± 3.7 |
改良MS | 71.3 ± 4.5 |
改良1/2WPM | 85.4 ± 5.1 |
改良WPM | 66.8 ± 5.2 |
以上实施例3所对应的实验结果如下:
诱导不定芽培养基 | 不定芽增殖率(%) |
改良1/2MS | 76.5 ± 5.6 |
改良MS | 83.1 ± 6.4 |
改良1/2WPM | 85.3 ± 6.1 |
改良WPM | 94.4 ± 3.2 |
以上实施例4所对应的实验结果如下:
诱导生根培养基 | 诱导生根率(%) |
1/2MS | 95.7 ± 3.4 |
MS | 72.3 ± 5.6 |
1/2WPM | 83.5 ± 6.8 |
WPM | 68.6 ± 5.2 |
以上实施例5所对应的实验结果如下:
生根培养基 | 炼苗成活率(%) | 移栽成活率(%) |
1/2MS | 96.5 ± 4.2 | 92.4 ± 3.1 |
由实施例1-5的实验结果可以看出:
在15%次氯酸钠溶液中每升量中加入3滴吐温80,吐温80是一种非离子型表面活性剂,可以使次氯酸钠消毒更加彻底,处理时长为7 min时其最终的污染率为12.5%。
秋季十月中旬选取树龄超过30年的银杏,选取经过生理后熟的优质种子,内部生长的胚长度可达到0.5~1.0 cm,内生菌含量较少,能够降低污染率,且维持较高的萌发率。
利用破壳器具将银杏种皮夹碎,取出内部完整的胚,保证胚的两片子叶完好,子叶作为营养贮存体,能够在胚的培养过程中提供部分营养。
幼苗长出后选取生长健壮的茎段,切至长度1.5~3.0 cm,接种到不定芽增殖的改良WPM培养基上,去除肌醇是为了防止愈伤组织的生长。
切取茎长1.0~2.0 cm的不定芽进行生根培养,采用1/2MS为基本培养基,由于培养基中的一些无机盐成分不利于根的形成,要通过适量降低无机盐的浓度来促进根的分化,因此大量元素要降到1/2左右。生根过程中降低蔗糖用量是为了刺激生根加强其自养能力。
银杏幼苗在组培室内经历了两个阶段的逐步壮苗过程,移栽至草炭土、珍珠岩和蛭石(3:2:1)构成的混合基质,其土壤营养,含水量及通透性都有保障,移栽成活率大大提高。
本发明提供的银杏高效快速组培繁殖方法,其从银杏胚的培养到移栽至混合基质,整个培养周期最短为85 d,移栽成活率达到92%。
Claims (2)
1.一种银杏高效快速组培繁殖方法,其特征在于:包括以下步骤:第一步:制备银杏组织无菌材料,即首先选取银杏种子作为培养材料,将种子浸入含有洗衣粉的水溶液中一定时间,清洗种子表面后把种子放入容器中置于流动水下流动冲洗,而后用多菌灵溶液浸泡,用蒸馏水冲洗种子并放入无菌环境内,采用酒精浸泡后,使用无菌水冲洗后再放入次氯酸钠溶液中浸泡一定时间,无菌水冲洗后,去除种子表面水分;第二步:胚培养,对第一步获得的培养材料在无菌环境内破壳,取出内部完整的银杏胚,并接种于改良1/2MS培养基上进行培养,获得幼苗,其中,改良1/2MS培养基为去除肌醇的1/2MS培养基;第三步:不定芽增殖培养,即从第二步获得的幼苗选取生长健壮的幼苗茎段为材料,在无菌条件下将茎段切至1.5 ~ 3 .0cm长度,接种到不定芽增殖培养基,并先进行暗培养,再转为光照培养,获得不定芽,不定芽增殖培养基为改良WPM培养基+10 mg/L L -丙氨酰-L-谷氨酰胺+5 mg/L 甘氨酸+20 mg/L 硫酸腺嘌呤+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA+0.02 mg/L Thidiazuron+6 .5 g/L琼脂+30 g/L蔗糖,其中改良WPM培养基为去除肌醇的WPM培养基,pH调至5 .5 ~ 6 .0;第四步:生根培养,将第三步获得的不定芽切下,转入生根培养基进行生根培养,其中,生根培养基为1/2MS基础培养基+0 .5 mg/L IBA+0 .05 mg/L NAA+6 .5 g/L琼脂+25 g/L蔗糖,pH调整为5 .5 ~ 6 .0;第五步:炼苗和移栽,第四步中生根良好的内含银杏植株的组培瓶盖子打开部分,组培室内放置3 d,再将瓶口完全开启,继续放置3d,取出幼苗,用自来水洗净根部残留的培养基,移栽至混合基质,置于营养钵内培养。
2.根据权利要求1所述的一种银杏高效快速组培繁殖方法,其特征在于:所述不定芽切下的茎长为1 .0 ~ 2 .0 cm。
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