CN116171863B - 一种蝴蝶花高效再生的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蝴蝶花高效再生的方法，属于生物技术领域。具体步骤包括：材料准备、外植体消毒、胚的获得、愈伤组织的诱导、不定芽诱导、生根及移栽。本发明以蝴蝶花成熟胚为外植体，污染率低，诱导率高，一年内一个成熟胚可以获得10‑15cm的组培苗2万余株，大大促进蝴蝶花的推广与应用。
Description
技术领域
本发明公开了一种蝴蝶花高效再生的方法，属于生物技术领域。
背景技术
蝴蝶花(Iris japonica Thunb)为鸢尾科鸢尾属多年生草本植物，花型奇特，花色淡雅，耐阴、耐寒，四季常绿，是重要的常绿地被植物。另外蝴蝶花的根状茎在民间长期使用，主要用于治疗一些肝炎、食积胀满、咽喉肿痛、跌打损伤、子宫脱垂和蛇犬咬伤等(AbeF,Chen R F,Yamauchi T.Iridals from Belamcanda chinensis and Iris japonica[J].Phytochemistry,1991,30(10):3379-3382.)。栽培的蝴蝶花群体虽然开花多，但自然结实率很低，为6.54％，在自然状态下主要以无性系繁殖为主，生产上常采用分株方法繁殖(关文灵，李叶芳，陈贤，杨德.蝴蝶花花器结构和开花授粉生物学特性[J].园艺学报，2009，36(10)1458-1490)，但分株繁殖效率低且易感病，不能满足大规模的市场需求。
目前，鸢尾属植物中组培研究较多的种为德国鸢尾、路易斯安娜鸢尾等，但是由于种间差异较大，植物激素种类及浓度对不同材料诱导的影响较大，因此建立不同种的组培快繁体系对获得大量鸢尾属种苗具有重要意义。蝴蝶花再生相对困难，茎尖为外植体的污染率较高，花器官为外植体的诱导率较低，成熟种子胚为外植体，由于胚乳较硬，胚获取困难，因此关于蝴蝶花再生的报道甚少，建立其高效再生体系，对于推动蝴蝶花品种选育研究尤其重要。
发明内容
本发明克服现有技术中的不足，提供一种蝴蝶花高效再生的方法，本发明提供的培养方法具有操作简单、繁殖系数高，移栽成活率高等优点。
提供一种蝴蝶花高效再生的方法，包括下述步骤：
(1)材料准备
取蝴蝶花自交后35～40d的蒴果于4℃冰箱中保存备用，所取蒴果为胚成熟，胚乳尚未完全硬化；
(2)外植体消毒
将步骤(1)中的蒴果，在体积比为10％的洗洁精溶液中浸泡10～15min，再在流水下冲洗30～50min，然后置于超净工作台上进行消毒处理；
(3)胚的获得
将步骤(2)处理后的蒴果，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子置于无菌滤纸上；操作人员将种子拿在手上，有萌发孔的一端朝上，用解剖针轻轻挑破萌发孔端的种皮，用手轻轻挤出白色的胚；
(4)愈伤组织的诱导
将步骤(3)取出的胚接种至愈伤组织诱导培养基；再将接种的胚置于25℃，黑暗条件下培养；所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(5)不定芽诱导
在愈伤组织诱导培养基上培养3～4周后，胚膨大并长出黄色致密的愈伤组织团块；用解剖刀将愈伤组织团块切下，在愈伤组织诱导培养基上继代2～3次后转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃，光照周期为14/10h的条件下培养；所述愈伤组织分化培养基为MS培养基+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(6)生根培养
步骤(5)中分化出的小苗长至3-5cm时，将其接种到生根培养基上，在25℃，光照周期为14/10h的条件下培养；所述生根培养基为MS培养基+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(7)移栽
将生根后的植株在组培室内打开瓶盖炼苗3-5d，之后取出植株，洗净根部附着的培养基，移栽到灭菌的蛭石中，置于培养箱中培养。
步骤(2)中，所述消毒处理步骤为：将蒴果置于0.1％的升汞溶液中浸泡10-15min后，用无菌水清洗4次，然后置于经高温灭菌的滤纸上备用。
步骤(4)中，所述愈伤组织诱导培养基为含0～2.0mg/L 2,4-D、0～1.0mg/L TDZ、30g/L蔗糖和6g/L琼脂粉的MS培养基，且培养基溶液的pH值为5.8～5.9。
相对于现有技术，本申请取得了以下有益效果：
1.本发明以蝴蝶花幼胚为外植体，具有污染率低，操作简便、获得的愈伤组织结构紧密，颗粒性强。
2.蝴蝶花自交后35～40d时的蒴果，胚成熟但胚乳未完全硬化，胚可轻松取出，操作简便，同时减少对植株本身的破坏。
3.本发明获得的愈伤组织可用于增殖或用于遗传转化体系，为蝴蝶花的分子育种奠定基础。
4.本发明同样适用于蝴蝶花的杂交胚，对于蝴蝶花的远缘杂交育种奠定了基础。
5.本发明一年内可以获得15-20cm的组培苗2万余株，大大促进蝴蝶花的推广与应用。
附图说明
图1：蝴蝶花自交35-40d的蒴果；
图2：胚诱导出的带芽的愈伤组织团块；
图3：诱导出的不定芽丛；
图4：增殖苗；
图5：不定芽生根；
图6：移栽40d后的蝴蝶花组培苗。
实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述：
下面的实施例可以使本专业的专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
其步骤如下：
(1)材料准备：
取蝴蝶花自交后35～40d的蒴果于4℃冰箱中保存备用，所取蒴果为胚成熟，胚乳尚未完全硬化；
(2)外植体消毒
将步骤(1)中的蒴果，在体积比为10％的洗洁精溶液中浸泡10～15min，再在流水下冲洗30～50min，然后置于超净工作台上进行消毒处理；
(3)胚的获得
将步骤(2)处理后的蒴果，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子置于无菌滤纸上；操作人员将种子拿在手上，有萌发孔的一端朝上，用解剖针轻轻挑破萌发孔端的种皮，用手轻轻挤出白色的胚；
(4)愈伤组织诱导
将步骤(3)取出的胚接种至愈伤组织诱导培养基；再将接种的胚置于25℃，黑暗条件下培养；所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+1.0mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(5)不定芽诱导
在愈伤组织诱导培养基上培养3～4周后，胚膨大并长出黄色紧密的愈伤组织团块；用解剖刀将愈伤组织团块切下，在愈伤组织诱导培养基上继代2～3次后转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃，光照周期为14/10h的条件下培养；所述愈伤组织分化培养基为MS培养基+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(6)生根培养
步骤(5)中分化的小苗长至3-5cm时，将其接种至生根培养基上，在25℃，光照周期为14/10h的条件下培养；所述生根培养基为MS培养基+NAA 0.1mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(7)移栽
将生根后的植株在组培室内打开瓶盖炼苗3-5d，之后取出植株，洗净根部附着的培养基，移栽到灭菌的蛭石中，置于培养箱中培养，成活率达98％。
实施例2
采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(4)培养基中植物激素的不同含量，分别于接种后42d统计愈伤组织诱导率、愈伤组织状态及愈伤组织颜色，结果如表1所示。
表1不同激素浓度对蝴蝶花愈伤组织诱导的影响
对上述数据进行分析可知，本发明步骤(4)采用2，4-D含量为1.0mg/L、TDZ含量为0.1mg/L，可以使愈伤组织诱导率达到最高，高达89.1％、获得的愈伤组织紧密，颗粒或圆球状突起，愈伤组织状态好。
实施例3
采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(5)中培养基中植物激素的不同含量，分别于接种后30d统计愈伤组织分化率、不定芽数及不定芽状态，结果如表2所示。
表2不同激素浓度对蝴蝶花愈伤组织分化的影响
对上述数据进行分析可知，本发明步骤(5)采用TDZ含量的多少对蝴蝶花愈伤组织分化率影响不显著，但对不定芽数影响较大。随着TDZ浓度的提高，不定芽数逐渐增多，但当TDZ浓度为1.0mg/L时，分化的不定芽数虽然多，但不定芽细弱，状态差，因此最佳愈伤组织分化培养基为添加0.5mg/L TDZ和0.1mg/L NAA的培养基，不定芽诱导率高，达91.7％，且获得的不定芽健壮，增殖系数高。
实施例4
采用实施例1中的处理方法，其区别在于步骤(6)中培养基中NAA浓度不同，分别于接种后30d统计生根率、生根数及生根状态，结果如表3所示。
表3不同NAA浓度对蝴蝶花不定芽生根的影响
对上述数据进行分析可知，本发明步骤(6)采用NAA浓度的大小对生根率的影响不显著，均达到90％以上，但对生根数和根的状态影响较大。随着NAA浓度的提高，生根数越来越多，根越来越粗壮，但当NAA浓度含量为0.5mg/L时，根虽然粗壮，但容易折断，因此最适蝴蝶花生根的NAA浓度为0.1mg/L，生根率高且生根质量好，植株移栽成活率高。
Claims (2)
1.一种蝴蝶花高效再生的方法，其特征在于，所述蝴蝶花高效再生的方法具体包括下述步骤：
(1)材料准备
取蝴蝶花自交后35～40d的蒴果于4℃冰箱中保存备用，所取蒴果为胚成熟，胚乳尚未完全硬化；
(2)外植体消毒
将步骤(1)中的蒴果，在体积比为10％的洗洁精溶液中浸泡10～15min，再在流水下冲洗30～50min，然后置于超净工作台上进行消毒处理；
(3)胚的获得
将步骤(2)处理后的蒴果，用镊子和解剖刀沿果实纵棱切开，取出颗粒饱满的种子置于无菌滤纸上；操作人员将种子拿在手上，有萌发孔的一端朝上，用解剖针轻轻挑破萌发孔端的种皮，用手轻轻挤出白色的胚；
(4)愈伤组织的诱导
将步骤(3)取出的胚接种至愈伤组织诱导培养基；再将接种的胚置于25℃，黑暗条件下培养；所述愈伤组织诱导培养基为MS培养基+1.0mg/L2,4-D+0.1mg/L TDZ+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(5)不定芽诱导
在愈伤组织诱导培养基上培养3～4周后，胚膨大并长出黄色致密的愈伤组织团块；用解剖刀将愈伤组织团块切下，在愈伤组织诱导培养基上继代2～3次后转接到愈伤组织分化培养基上，在25℃，光照周期为14/10h的条件下培养；所述愈伤组织分化培养基为MS培养基+0.5mg/L TDZ+0.1mg/L NAA+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(6)生根培养
步骤(5)中分化出的小苗长至3-5cm时，将其接种到生根培养基上，在25℃，光照周期为14/10h的条件下培养；所述生根培养基为MS培养基+NAA0.1 mg/L+30g/L蔗糖+6g/L琼脂粉，pH值为5.8～5.9；
(7)移栽
将生根后的植株在组培室内打开瓶盖炼苗3-5d，之后取出植株，洗净根部附着的培养基，移栽到灭菌的蛭石中，置于培养箱中培养。
2.根据权利要求1所述的一种蝴蝶花高效再生的方法，其特征在于，步骤(2)中的消毒处理步骤为：将蒴果置于0.1％的升汞溶液中浸泡10-15min后，用无菌水清洗4次，然后置于经高温灭菌的滤纸上备用。
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