CN101130763B - 银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶源的获得、愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞培养、愈伤组织或悬浮细胞中产生黄酮类化合物等步骤，本发明方法所制备的银杏愈伤组织或悬浮细胞中有较高含量的银杏黄酮类化合物。本发明方法利用稀土、水杨酸等诱导子对银杏愈伤组织或悬浮细胞的培养和黄酮的生产进行有目的的调控，可以在短期内获得大量的制药原料，并能有效降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织或细胞的繁殖方法，尤其涉及含有较高黄酮类化合物的银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，属于植物生物技术领域。
背景技术
银杏(Ginkgo biloba L.)是原产我国的古老孑遗植物，集药用、食用、观赏、材用于一体，银杏叶中存在特有的两类重要生理活性物质——黄酮类化合物(flavonoides)和萜内酯(银杏内酯ginkgolides，GKs包括A，B，C，J，M和白果内酯bilobalides，BB)。这两类药物对中老年冠心病、高血压等心脑血管病、内毒素休克、器官排异反应、气管炎、哮喘等均有较好的效果。另外银杏药物还具有抗衰老、抗老年性痴呆症、增强记忆力的功效，用于研制营养口服液、保健食品和化妆品等添加剂。
由于银杏制品存在着巨大的市场潜力，先后在法国、德国、韩国、美国、日本等掀起了银杏叶制剂、药品的研制、开发与销售，世界上银杏制剂的年销售额为20亿～40亿美元。在大力开发研制银杏产品的同时，存在着对资源的掠夺，人力物力的浪费。
银杏黄酮和萜内酯主要来源于银杏叶片，但含量很低，银杏叶黄酮含量为0.3％～3.8％，萜内酯在银杏叶内含量更低，比黄酮含量低一个数量级(约0.1％～0.3％)大面积的建立叶用林是不现实的，同时存在地理环境、季节等诸多因素的限制，且提取、分离时操作繁琐费时。利用植物细胞或愈伤组织的大量培养生产银杏次生物质代谢产物，可以工业化的生产银杏黄酮类化合物，是银杏黄酮类化合物的一条有效制备途径。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，由该快速繁殖方法所制备得到银杏愈伤组织或悬浮细胞有较高含量的银杏黄酮类化合物，可以规模化的为药厂提供银杏黄酮化合物的来源。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
一种银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶源的获得、愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞培养等步骤，其主要步骤如下：
1、按照常规植物组织培养的芽或叶片增殖的方法，获得大量无菌的银杏芽苗或叶片；
2、将步骤1所获得的银杏无菌芽苗或叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，初代培养后连续继代5～6次，获得松散的愈伤组织；
3、将步骤2所获得的松散愈伤组织接种在含有萘乙酸(Naphthalene-aceticacid，NAA)、激动素(Kinetin，KT)的MS(MS培养基的配方请参考下述文献：刘庆昌，吴国良主编的植物细胞培养技术[M]，中国农业大学出版社，33)液体培养基中振荡培养，其中继代培养2次，得到液体悬浮培养细胞；
4、将所得到的液体悬浮培养细胞接种在下述任意一种液体培养基中进行振荡培养：(1)MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，或(2)MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5～5mg/L；收集细胞培养物，即得；或将步骤2中所得到的愈伤组织继代在下述任意一种固体培养基上培养：(1)MS固体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，或(2)MS固体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5～5mg/L，收获愈伤组织培养物，即得。
上述制备方法中，优选的，步骤1中所述的银杏芽或叶片增殖的方法，步骤如下：
(1)将银杏成熟种胚消毒后接种在DCR、WPM 3或改良MS中的任一种基本培养基上，培养(优选培养30天)形成幼苗；其中，所述的种胚消毒方式优选如下：将银杏成熟种胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡约2min和0.1％HgCl2浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水分；
(2)取步骤(1)所得到的无菌幼苗，剪取(优选为剪取1cm左右)带芽茎段接种在下述的任意一种固体培养基上进行芽和叶片的诱导培养(优选为培养1个月)：改良MS固体培养基+NAA0.1～0.5mg/L+6-苄基嘌呤(6-benzyladenine，6-BA)0.5～1.0mg/L，或DCR培养基+NAA0.1～0.5mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L；
(3)将步骤(2)所获得的芽或叶片转接到改良MS或DCR基本培养基中培养(优选为培养1个月)，进行芽的增殖和叶片的生产，获得大量无菌的银杏芽苗或叶片。
步骤1中银杏芽和叶片增殖的另外一种优选的方法，包括：
取室外银杏雌株的实生苗春季嫩梢(优选为3月下旬～4月上旬的苗春季嫩梢)接种在接种在以下任意一种固体培养基中培养2个月(30天继代一次)：(1)改良MS固体培养基+0.25％活性炭(Aactive carbon，AC)、或(2)WPM培养基+0.25％AC；获得大量的无菌的银杏芽苗和叶片。
步骤2中，作为一种优选的技术方案，将步骤1所获得的银杏无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到下述任意一种愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导：(1)MS固体培养基+NAA0.5～1.5mg/L+BA0.5～1.0mg/L、或(2)MS固体培养基+NAA0.5～1.5mg/L+KT0.5mg/L；初代培养30天后连续继代5～6次，继代周期20天，获得松散的愈伤组织；
步骤3中，所述的含有NAA、KT的MS液体培养基的具体组成为：MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L。
步骤1-3中所述的MS液体培养基中蔗糖重量用量为30g/L，不添加琼脂；所述的MS固体培养基中蔗糖重量用量为30g/L，琼脂重量用量为6.5g/L。
所述培养基消毒方式为在121℃下灭菌20min，培养基的pH值为5.8～5.9。
上述制备方法中，步骤1-3中所述的培养条件优选为温度25±2℃，采用光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14小时/天。
步骤1-3中所述的改良MS培养基指MS基本培养基中大量元素减半；
所述的稀土优选是硝酸镧稀土。
采用分光光度法或高效液相色谱法测定结果表明，由本发明方法所制备得到的银杏愈伤组织或悬浮细胞，其总黄酮苷的含量范围多为0.5～1.9％。
本发明利用组织及细胞培养生产含有较高黄酮类化合物的银杏愈伤组织或悬浮细胞，不仅可以节约大量的土地资源、人力资源和物力资源，保护生态环境，而且不受季节等外界条件的限制，源源不断的提供银杏黄酮类化合物药源。本发明方法利用稀土和水杨酸诱导子对细胞的培养和黄酮类化合物的生产进行有目的的调控，在短期内可获得大量的制药原料，降低生产成本，可以与制药厂形成一体化进行规模化、工厂化生产，将对银杏产业的进一步发展、制药领域的进一步开拓具有重要的现实意义。
具体实施方式
以下通过具体实施方式对本发明进行进一步说明。这里想要指出的是，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可以根据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的范围之内。
本发明中所用到的各种常规培养基的配方见表1。
表1 培养基的配方
| 培养基成分 | MS(1962)Murashigeand Skoog | WPM | DCR | MT(1969) | 改良MS | N6(1974) |
| KCl | ||||||
| MgSO4·7H2O | 370 | 370 | 370 | 370 | 370 | 185 |
| NaH2PO4·H2O | ||||||
| CaCl2·2H2O | 440 | 85 | 440 | 440 | 166 | |
| KNO3 | 1900 | 340 | 1900 | 1900 | 2830 | |
| CaCl2 | 96 | 64.7 | ||||
| Na2SO4 | ||||||
| (NH4)2SO4 | 463 | |||||
| NH4NO3 | 1650 | 400 | 400 | 1650 | 825 | |
| KH2PO4 | 170 | 170 | 170 | 170 | 170 | 400 |
| K2SO4 | 990 | |||||
| Ca(NO3)2 | 556 |
| FeSO4·7H2O | 27.8 | 27.8 | 27.8 | 27.8 | 27.8 | 27.8 |
| Na2-EDTA | 37.3 | 37.3 | 37.3 | 37.3 | 37.3 | 37.3 |
| MnSO4·4H2O | 22.3 | 22.3 | 22.3 | 4.4 | ||
| MnSO4·H2O | 22.3 | 22.3 | ||||
| KI | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 0.83 | 0.8 | |
| CoCl2·6H2O | 0.025 | 0.025 | 0.025 | 0.025 | ||
| NiCl2·6H2O | 0.025 | |||||
| ZnSO4·7H2O | 8.6 | 8.6 | 8.6 | 8.6 | 8.6 | 1.5 |
| CuSO4·5H2O | 0.025 | 0.25 | 0.25 | 0.025 | 0.025 | |
| H3BO3 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 6.2 | 1.6 |
| Na2MoO4·2H2O | 0.25 | 0.25 | 0.25 | 0.25 | ||
| Fe2(SO4)3 | ||||||
| 肌醇 | 100 | 100 | 200 | 100 | 100 | |
| 烟酸VB3 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| 盐酸硫胺素VB1 | 0.1 | 1.6 | 1 | 0.1 | 1 | |
| 盐酸吡哆醇VB6 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | |
| 甘氨酸 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 |
说明：本发明中实施例1、实施例2所用的银杏品种为大佛指；实施例3、实施例4所用的银杏品种为马铃；实施例5和实施例6所用的银杏为室外的雌株春季嫩梢。
实施例1
1.银杏成熟胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡约2min和0.1％HgCl2浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水份，在无菌条件下从胚乳中取出胚，接种在不加调节剂的改良MS基本培养基(蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)上。培养温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。接种后胚开始萌发，8d后成完整小苗，30d后苗高可达2～3cm；
2.将步骤1得到的1个月龄的无菌幼苗，剪掉胚根、子叶，将幼茎剪成1cm左右带芽小段接种到改良MS(NH4NO3减半)基本培养基，附加NAA0.1mg/L+6-BA0.5mg/L，培养1个月后，再在不加NAA和6-BA的改良MS(NH4NO3减半)基本培养基中培养1个月。接种后芽开始分化、顶芽、腋芽长出、叶片也逐渐增多，面积增加，60d的芽苗高可达3cm，叶片数达8片；
3.将步骤2所得到的茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到MS+NAA0.5mg/L mg/L+BA0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基中。培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。初代培养30d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4.上述步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸镧稀土0.5mg/L的固体培养基中，培养20d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为12.53mg/g.干重；
5.将步骤3所培养的松散愈伤组织接种到MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的不加琼脂的液体培养基(培养基中蔗糖用量为30g/L，pH值5.8～5.9，在121℃下灭菌20min)中振荡培养，旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。培养一周后，用无菌脱脂棉滤去大细胞团，滤液继续培养，每10～15d继代一次。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d，悬浮细胞生长量较愈伤组织的高，得到大量的液体悬浮培养细胞；
6.将上述步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸镧稀土0.5mg/L的液体培养基中，培养23d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为13.99mg/g.干重；总黄酮苷中主要成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝70.09∶13.60∶16.31
实施例2
1.银杏成熟胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡约2min和0.1％HgCl2浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水份，在无菌条件下从胚乳中取出胚，接种在不加调节剂的改良MS基本培养基(蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)上，培养温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。接种后胚开始萌发，8d后成完整小苗，30d后苗高可达2～3cm；
2.将步骤1得到的1个月龄的无菌幼苗，剪掉胚根、子叶，将幼茎剪成1cm左右带芽小段接种改良MS(NH4NO3减半)基本培养基，附加NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L，培养1个月后，再在不加NAA，6-BA的改良MS(NH4NO3减半)基本培养基中培养1个月。接种后芽开始分化、顶芽、腋芽长出、叶片也逐渐增多，面积增加，60d的芽苗高可达3cm，叶片数达8片；
3.将步骤2所得到的茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到MS+NAA1.5mg/L mg/L+BA1.0mg/L的愈伤组织诱导培养基中。培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。初代培养30d，愈伤组织诱导率达80～90％以上，连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4.上述步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸镧稀土0.5mg/L的固体培养基中，培养15d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为10.41mg/g.干重；
5.将步骤3所培养的松散愈伤组织接种到不加琼脂的液体培养基MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L(培养基中蔗糖用量为30g/L，pH值5.8～5.9，在121℃下灭菌20min)中振荡培养，旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。培养一周后，用无菌脱脂棉滤去大细胞团，滤液继续培养，每10～15d继代一次，共继代二次。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。悬浮细胞生长量较愈伤组织的高，得到大量的液体悬浮培养细胞；
6.将上述步骤5中的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸镧稀土0.5mg/L的液体培养基中，培养16d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为9.57mg/g.干重；总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝69.95∶15.02∶15.03
实施例3
1.银杏成熟胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡约2min和0.1％HgCl2浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水份，在无菌条件下从胚乳中取出胚，接种在不加调节剂的WPM基本培养基上。培养温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。接种后胚开始萌发，8d后成完整小苗，30d后苗高可达2～3cm；
2.将步骤1所得到的1个月龄的无菌幼苗，剪掉胚根、子叶，将幼茎剪成1cm左右带芽小段接种到DCR基本培养基，附加NAA0.1mg/L+6-BA1.0mg/L，培养1个月后，再在不加NAA，6-BA的DCR基本培养基中培养1个月。接种后芽开始分化、顶芽、腋芽长出、叶片也逐渐增多，面积增加，60d的芽苗高可达3cm，叶片数达8片；
3.将步骤2所得到的茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到MS+NAA0.5mg/L+KT0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基中(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)，培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。初代培养30d，愈伤组织诱导率达80～90％以上。连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4.上述步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5～2.0mg/L的固体培养基中，培养12d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为18.7～19.0mg/g.干重；
5.将步骤3所得到的松散愈伤组织接种到不加琼脂的液体培养基MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L(培养基中蔗糖用量为30g/L，pH值5.8～5.9，在121℃下灭菌20min)中振荡培养，旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。培养一周后，用无菌脱脂棉滤去大细胞团，滤液继续培养，每10～15d继代一次，共继代二次。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d；
6.将上述步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5mg/L的液体培养基中，培养10d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为9.19mg/g.干重；
实施例4
1.银杏成熟胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡约2min和0.1％HgCl2浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水份，在无菌条件下从胚乳中取出胚，接种在不加调节剂的WPM基本培养基上。培养温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。接种后胚开始萌发，8d后成完整小苗，30d后苗高可达2～3cm；
2.将步骤1所得到的1个月龄的无菌幼苗，剪掉胚根、子叶，将幼茎剪成1cm左右带芽小段接种到DCR基本培养基，附加NAA0.5mg/L+6-BA1.0mg/L，培养1个月后，再在不加NAA，6-BA的DCR基本培养基中培养1个月。接种后芽开始分化、顶芽、腋芽长出、叶片也逐渐增多，面积增加，60d的芽苗高可达3cm，叶片数达8片；
3.将步骤2所得到的茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到MS+NAA1.5mg/L+KT0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基中(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)，培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d，初代培养30d，愈伤组织诱导率达80～90％以上。连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
4.上述步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5～2.0mg/L的固体培养基中，培养20d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为13.8～15.8mg/g.干重；
5.将步骤3所得到的松散愈伤组织接种不加琼脂的液体培养基MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L(培养基中蔗糖用量为30g/L，pH值5.8～5.9，在121℃下灭菌20min)中振荡培养，旋转式摇床转速为110r/min，振幅25cm。培养一周后，用无菌脱脂棉滤去大细胞团，滤液继续培养，每10～15d继代一次。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d，悬浮细胞生长量较愈伤组织的高，得到大量的液体悬浮培养细胞；
6.将上述步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+水杨酸0.5mg/L的液体培养基中，培养16d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为9.55mg/g.干重；总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝58.52∶11.63∶29.85
实施例5
1、取室外银杏雌株的春季嫩梢(3月下旬～4月上旬)接种在改良MS+0.25％AC培养基中培养2个月(30d继代一次)。嫩梢逐渐抽长高，叶片逐渐长出，苗高达3～4cm，叶片数达10～12片，叶面积可达3.3cm2。上述各培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9。培养基在121℃下灭菌20min，培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d；
2、将上述茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到MS+NAA1.5mg/Lmg/L+BA0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)中。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。初代培养30d，愈伤组织诱导率达80～90％以上。连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
3.将上述步骤2中的愈伤组织继代在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸镧稀土0.5mg/L的培养基(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)上，培养15d收获培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为14.8mg/g.干重；总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝89.15∶8.29∶2.56
实施例6
1、取室外银杏雌株的春季嫩梢(3月下旬～4月上旬)接种在WPM+0.25％AC培养基(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9)中培养2个月(30d继代一次)，嫩梢逐渐抽长，叶片逐渐长出，苗高达3～4cm，叶片数达10～12片，叶面积可达3.3cm2。培养基在121℃下灭菌20min，培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d；
2.将上述茎段诱导的无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到MS+NAA1.5mg/L+KT0.5mg/L的愈伤组织诱导培养基(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9)中，培养基在121℃下灭菌20min。培养室温度25±2℃，光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14h/d。初代培养30d，愈伤组织诱导率达80～90％以上。连续继代5～6次，继代周期20d，获得大量松散的愈伤组织；
3.将上述步骤2中的愈伤组织继代在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+硝酸镧稀0.5mg/L的培养基(培养基中蔗糖用量为30g/L，琼脂6.5g/L，pH值5.8～5.9，培养基在121℃下灭菌20min)上，培养20d收获培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为13.06mg/g.干重；
对比试验例1
将实施例1中步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L固体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例1；培养20d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为10.01mg/g.干重；
将实施例1中步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例1；培养23d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为6.01mg/g.干重。总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝75.4∶13.21∶11.39
对比试验例2
将实例2中步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的固体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例2；培养15d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为7.19mg/g.干重；
将实施例2中步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例2；培养16d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为8.27mg/g.干重。总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝76.54∶8.62∶14.84
对比试验例3
将实例3中步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的固体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例3；培养12d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为15.7mg/g.干重；
将实施例3中步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例5；培养10天后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为6.88mg/g.干重。总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝38.8∶0∶61.2
对比试验例4
将实例4中步骤3中继代5～6次的松散的愈伤组织，接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的固体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例4；培养20d后收集愈伤组织培养物，吸干水分称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；测定结果为：总黄酮苷的含量为12.67mg/g.干重；
将实施例4中步骤5中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例4；培养16d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为6.88mg/g.干重。总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝38.8∶0∶61.2
对比试验例5
将实施例5步骤3中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例5；培养15d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；高效液相色谱法测定总黄酮苷的成分及含量。
测定结果为：总黄酮苷的含量为11.14mg/g.干重。总黄酮苷中各成分的组成比例为：槲皮素∶山柰素∶异鼠李素＝40.92∶53.86∶5.22
对比试验例6
将实施例6步骤3中继代2次的液体悬浮培养细胞接种在MS+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L的液体培养基中，其余步骤或方法完全同实施例6；培养20d后收集培养物，抽滤称取鲜重、干重，用分光光度法测定总黄酮苷；
测定结果为：总黄酮苷的含量为11.99mg/g.干重。
Claims (7)
1.一种银杏愈伤组织或悬浮细胞的快速繁殖方法，包括无菌叶源的获得、愈伤组织诱导及继代培养、悬浮细胞培养步骤，其主要步骤如下：
(1)、按照常规植物组织培养的芽或叶片增殖的方法，获得无菌的银杏芽苗或叶片；
(2)、将步骤(1)所获得的银杏无菌芽苗或叶片接种到愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，初代培养后连续继代5～6次，获得松散的银杏愈伤组织；
(3)、将步骤(2)所获得的银杏愈伤组织接种在含有NAA和KT的MS液体培养基中振荡培养，其中继代培养2次，得液体悬浮培养细胞；
(4)、将步骤(3)所得到的液体悬浮培养细胞接种在下述液体培养基中进行振荡培养：MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L；收集细胞培养物，即得银杏悬浮细胞；或将步骤(2)中的银杏愈伤组织继代在下述固体培养基上培养：MS固体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L+稀土0.5～5mg/L，收获愈伤组织培养物，即得银杏愈伤组织。
2.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(1)中所述无菌的银杏芽或叶片按照下述方法增殖得到：
(a)将银杏成熟种胚消毒后接种在DCR或WPM中的任一种基本培养基上，培养形成无菌幼苗；其中，所述的银杏成熟种胚消毒方式如下：将银杏成熟种胚用5％的84消毒液浸泡10min后，剥去骨质中种皮，依次用70％乙醇浸泡2min和0.1％HgCl2浸泡8～10min，无菌水清洗5次，然后用无菌的滤纸吸去材料表面的水分；
(b)取步骤(a)所得到的无菌幼苗，剪取带芽茎段接种在下述的固体培养基上进行芽和叶片的诱导培养：DCR培养基+NAA0.1～0.5mg/L+6-BA0.5～1.0mg/L；
(c)将步骤(b)所获得的芽或叶片转接到DCR基本培养基中培养，进行芽的增殖和叶片的生产，获得大量无菌的银杏芽苗或叶片。
3.按照权利要求1的快速繁殖方法中，其特征在于：步骤(1)中所述的银杏芽和叶片按照下述方法增殖得到：
取室外银杏实生苗春季嫩梢接种在以下固体培养基中培养2个月：WPM培养基+0.25％AC；获得大量的无菌的银杏芽苗和叶片。
4.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(2)中，将步骤(1)所获得的银杏无菌芽苗叶片剪成0.5cm2方块，接种到下述任意一种愈伤组织诱导培养基中进行愈伤组织诱导：(1)MS固体培养基+NAA0.5～1.5mg/L+BA0.5～1.0mg/L，或(2)MS固体培养基+NAA0.5～1.5mg/L+KT0.5mg/L；初代培养30天后连续继代5～6次，继代周期20天，获得松散的愈伤组织。
5.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(3)中所述的含有NAA、KT的MS液体培养基的组成为：MS液体培养基+NAA1.0mg/L+KT0.5mg/L。
6.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：所述的培养条件为温度25±2℃，采用光照强度1000～2000lx的日光灯照明，光照时间10～14小时/天。
7.按照权利要求1的快速繁殖方法，其特征在于：步骤(4)中所述的稀土是硝酸镧稀土。
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