CN1281050A - 银杏细胞培养生产银杏多糖 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及银杏细胞培养生产银杏多糖,该方法包括银杏外植体诱导愈伤组织,愈伤组织转移至悬浮培养,从悬浮细胞培养物中提取胞内多糖和胞外多糖,所述胞内多糖进一步分离到两个组分,所述胞外多糖分离到三个组分,测定了各组分的分子量以及单糖组成和摩尔比。同时,测定了所述胞内多糖和胞外多糖的药理活性。为进一步大规模培养可人工控制的生产银杏多糖的方法提供一条途径。

Description

银杏细胞培养生产银杏多糖
本发明涉及生物工程方法生产银杏活性代谢物--银杏多糖，及该银杏多糖的理化性质和药理活性。
银杏(Ginkgo biloba L．)是古老的中生代孑遗植物，现仅存一科一属一种，故有裸子植物“活化石”之称。银杏作为药用已有600多年的历史，但真正对其化学成分和药理学进行系统研究则始于60年代。70年代发现银杏叶提取物(EGb)对心脑血管疾病有效，80年代发现银杏叶中银杏内酯为强血小板活化因子拮抗剂。近十年来，西方发达国家掀起了银杏研究高潮(EP0402925；DE3940092；EP0303277)，已有大量保健品和化妆品上市，银杏叶制剂的年销售额已达十多亿美元，成为国际植物药研究开发的热点课题。
为保护天然物种资源和土地资源，并克服植物栽培中地域、气候和季节的影响，Kim等(WO9302204)研究了用生物工程方法生产银杏内酯的方法。鉴于植物多糖的研究收到越来越广泛的关注，人们逐渐认识到糖及其复合物分子具有极其重要的生理作用，它与免疫功能的调节、细胞与细胞的识别、细胞间物质的运输、癌症的诊断与治疗等有着密切的关系。因此，我们课题组利用生物工程的方法研究了银杏中另一种重要的活性代谢物--银杏多糖。
本发明的目的在于通过银杏愈伤组织培养和细胞悬浮培养以及进一步的大规模培养提供可人工控制的生产银杏多糖的方法，以实现保护资源、人工调控、提高产率的目的。
本发明的目的是通过以下几步实现的。(1)利用银杏树的各种外植体诱导出愈伤组织；(2)筛选健康的愈伤组织进行悬浮培养；(3)以细胞生长量和多糖含量为指标考察适当的悬浮培养条件；(4)以优选条件悬浮培养愈伤组织的细胞；(5)收获细胞和培养基并分别提取多糖；(6)胞内多糖和胞外多糖的理化性质和药理活性鉴定。
下面对本发明作进一步详细说明。
春季采摘银杏树幼嫩的叶、柄、茎尖、芽尖，切成合适尺寸的段或块，消毒后接种于诱导培养基，诱导培养基可以是含常见植物生长激素，例如萘乙酸(NAA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、吲哚乙酸(IAA)或吲哚丁酸(IBA)和常见植物细胞分裂素，例如激动素(KT)或6-苄氨基嘌呤(6-BA)的常规植物培养基，例如，MS(参见Murashige和Skoog，1962)、H(参见Nitsch，1969)、B5(参见Gamborg et al，1968)等。优选含生长素NAA 1-5 mg/L和细胞分裂素KT 0.1-0.5 mg/L的MS琼脂培养基。秋季采摘成熟的银杏果实，一部分果实剥出种子在无激素的1/2 MS琼脂培养基(除琼脂外，MS培养基中所有成分的浓度均减半)中无菌培养诱导生根发芽，将无菌苗长出的根切成合适尺寸的段，以同样方法接种于上述添加NAA 1-5 mg/L和KT 0.1-0.5 mg/L的MS诱导培养基中诱导愈伤组织。另一部分果实埋于土中，待长出胚后、剥出胚，切成段，以同样方法接种于上述诱导培养基中诱导愈伤组织接种后约30天将来源于叶、柄、芽、茎、无菌苗的根、胚外植体的愈伤组织转移至新配制的添加NAA 1-5 mg/L和KT 0.1-0.5 mg/L的MS琼脂培养基中继代培养，以后每隔三周继代一次。
从各来源继代6次后稳定的愈伤组织中，筛选生长健康(淡黄色半透明固体块，含水适中，碰触易散、生长量大)的愈伤组织块，转移至添加NAA 1-5 mg/L和KT 0.1-0.5mg/L的MS液体培养基(无琼脂)的摇瓶中，在摇床上震荡培养、摇床m转速90-110 rpm，温度25±2℃，黑暗或光照悬浮培养。悬浮培养18-21天后分别收集培养的细胞和培养基。分别测细胞生长量[=(每瓶收获细胞量(g)-每瓶接种细胞量(g))/每瓶培养基体积(1)]、培养基中多糖含量(参见董群等，中国药学杂志，1996，31(9)：550-553；戴明华等，南京大学学报(自然科学版)，1995，31：436-442)和细胞内多糖含量(参见董群等，中国药学杂志，1996，31(9)：550-553；陈建民等，中药材，1994，17(8)：32-33)。
以细胞生长量和多糖产量为指标筛选最佳生物学因子和理化因子。对来源于叶、茎、根外植体的愈伤组织分别在光照和黑暗条件下进行悬浮培养，培养18-21天测细胞生长量和多糖产量，确定根来源的细胞系在光照条件下多糖产量最高。调整上述悬浮培养基中的蔗糖浓度分别为20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L(其它条件不变)，对根细胞系光照下进行悬浮培养，以细胞生长量和多糖产量为指标筛选培养基中的最佳蔗糖浓度为40 g/L。调整上述悬浮培养基中激素的种类和浓度(其它条件不变)，其中生长素包括萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，细胞分裂素包括激动素(KT)和6-苄氨基嘌呤(6-BA)，对根细胞系光照下进行悬浮培养，确定优选的激素组合为NAA 4.0 mg/L+KT 0.4 mg/L。
对优选的根细胞系，光照条件下，在蔗糖浓度为优选的40 g/L，激素组合为优选的NAA 4.0 mg/L+KT 0.4 mg/L的MS培养基中，其它同上述悬浮培养条件进行悬浮培养，培养三周收获。过滤并离心收集培养的细胞和培养基上清液，按照本领域常规的水提醇沉法分别提取胞内多糖(ICP)和胞外多糖(ECP)。
分别对胞内多糖(ICP)和胞外多糖(ECP)进行性质鉴定。ICP和ECP分别在DEAE Sephadex A-50(购自Pharmacia Chem.)上按照商品说明书的指示，用0.1 mol/L Na-Pi缓冲液(pH 6.0)作为初始洗脱液，用0.5 mol/L Na-Pi缓冲液(pH 6.0)作为极限洗脱液进行梯度洗脱。分步收集器收集到的各组分分别用苯酚-硫酸法(参见：董群等，中国药学杂志，1996，31(9)：550-553)测定糖含量，并描绘洗脱曲线。ICP分离到两个组分ICP-1和ICP-2，ECP分离到三个组分ECP-1、ECP-2和ECP-3。收集到的各组分分别在蒸馏水中透析48-72小时，透析液冷冻真空干燥。分别用Sephacry S-300HR凝胶色谱和PAGE-凝胶电泳对分离到的各组分进行纯度验证。确定上述各组分的纯度后，分别测定各组分的分子量(Sephacry S-300HR凝胶色谱法)以及单糖组成和摩尔比(气相色谱法，岛津GC-17A)。
分别对银杏细胞培养得到的细胞内多糖(ICP)和培养基多糖(ECP)进行药理活性测定。分别检测了ICP对常压的缺氧小鼠、急性脑缺氧小鼠、脑循环障碍性缺氧小鼠和低压缺氧小鼠的保护作用，确定ICP具有明显的耐缺氧作用。并且检测了ECP对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响和对醋酸所致小鼠毛细血管通透性增大的影响，确定ECP具有较好的抗炎作用。
本发明用生物工程方法生产银杏多糖有以下几个优点：(1)通过优化细胞培养条件(理化因子和生物学因子)，可以人工控制细胞生长和银杏多糖的生产，使目的产物产量不断提高，以利于工业化生产；(2)培养的愈伤组织细胞生长速度较快，初级代谢物的产生也随之较快，这对生产多糖有利，并且细胞培养物收集多糖时较少杂质的干扰，这对提取多糖的后处理有利；(3)细胞培养物胞内多糖和胞外多糖经鉴定均有药理活性。本发明为生产植物活性高分子化合物提供了新的方法。下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的描述。
图1．初始蔗糖浓度对细胞生长及多糖合成的影响。
图2．ICP的DEAE-SephadcxA-50洗脱图谱。1：ICP-1(收率为6.8％)；2：ICP-2(收率为16.6％)。
图3．ECP的DEAE-Sephadex A-50洗脱图谱。3：ECP-1(收率为27.9％)；4：ECP-2(收率为9.2％)；5：ECP-3(收率为10.2％)。
图4．标准单糖乙酰衍生物和各多糖水解产物乙酰衍生物的气相色谱图。A：标准单糖乙酰衍生物气相色谱图；B/C/D/E/F：ECP1/ECP-2/ECP-3/ICP-1/ICP-2水解产物的乙酰衍生物气相色谱图；a鼠李糖；b．阿拉伯糖；c．木糖；d．甘露糖；e．葡萄糖；f半乳糖。
实施例1
春季采摘生长十年以上银杏树幼嫩的叶、柄、茎尖、芽尖，在超净工作台上将各外植体切成约5 mm长(或见方)的块，在浓度为0.1％的HgCl2中处理0.5-1.5分钟，随后在酒精中浸泡10-20分钟以消毒外植体，用无菌蒸馏水漂洗3-5次后，接种于预先热压灭菌(121℃，0.1KPa)的含40 ml诱导培养基的100 ml培养瓶中，诱导培养基为含萘乙酸(NAA)1.0 mg/l和激动素(KT)0.1 mg/l的MS琼脂培养基(下文简写为MS+NAA1.0+KT0.1)。然后在25℃，黑暗或光照下诱导愈伤组织。
秋季采摘成熟的银杏果实，一部分果实剥出种子，消毒后在预先热压灭菌的无激素1/2MS琼脂培养基(MS培养基中除琼脂外所有成分的浓度均减半)上诱导生根发芽，将长出的无菌苗的根切成约5 mm长的段，以上述同样方法消毒后接种于MS+NAA1.0+KT0.1琼脂培养基中诱导愈伤组织。另一部分果实埋于土中，待长出胚后，剥出胚，切成约5 mm长的段，以同样方法灭菌后接种于MS+NAA1.0+KT0.1琼脂培养基中诱导愈伤组织。
接种后约30天，将叶、柄、芽、茎、无菌苗的根、胚外植体诱导出的愈伤组织转移至新配制的MS+NAA1.0+KT0.1琼脂培养基中，于25+2℃，黑暗或光照下继代培养，以后每隔18-21天继代一次。
实施例2
来源于叶、茎、柄、芽、胚、根的愈伤组织继代六代后，愈伤组织已完全稳定，挑选生长健康的叶、茎、根愈伤组织，表现为色泽淡黄色、半透明、生长旺盛、结构疏松、易于分散。将挑选出的愈伤组织预先留样干燥并称重(为接种量)，然后转移到预先热压灭菌(121℃，0.1 KPa)的装有80 ml液体培养基的250ml摇瓶中，液体培养基为MS+NAA1.0+KT0.1不合琼脂的培养基，连续光照或黑暗培养，摇床转速100 rpm，培养温度25±2℃，培养18-21天收获。
收获后，用双层滤纸抽滤并离心(7000 rpm，15 min)收集细胞和培养基。所得细胞用蒸馏水冲洗掉残余培养基，置红外灯下干燥(＜60℃)至恒重，称重(为收获量)，用下列公式计算细胞生长量，所得结果为每一实验条件下3～6瓶细胞培养物的平均值。
Figure 9911310100091
用苯酚-硫酸法分别测定离心得到的培养基上清液和干燥细胞中的多糖含量。培养基上清液中多糖含量的测定参见董群等，中国药学杂志，1996，31(9)：550-553和戴明华等，南京大学学报(自然科学版)，1995，31：436-442；细胞内多糖含量的测定参见董群等，中国药学杂志，1996，31(9)：550-553和陈建民等，中药材，1994，17(8)：32-33)。用下列公式计算多糖产量：
多糖产量(mg/L)=胞外多糖含量(mg/L)+细胞生长量(g/L)
                ×胞内多糖含量(mg/g)
实施例3
筛选银杏细胞培养的较佳生物学因子、物理和化学因子。
将来源于叶、茎、根外植体的愈伤组织按照实施例2的方法，分别在连续光照和连续黑暗条件下悬浮培养，收获后分别测细胞生长量和多糖产量。确定优选的愈伤组织细胞系为根细胞系，并采用连续光照培养，结果见表1。
表1.银杏细胞悬浮培养较佳生物学因子和物理因子的筛选
    愈伤组织细胞系 细胞生长量(g/L) 胞外多糖含量(mg/L) 胞内多糖含量(mg/g) 多糖产量(mg/L)
光    叶     13.28     189     26.2     537
培    茎     12.17     406     20.7     658
养    根     12.49     448     30.9     834
暗    叶     11.99     196     8.40     297
培    茎     7.29     249     21.1     403
养    根     9.23     236     22.2     441
根愈伤组织细胞系按照实施例2的方法，连续光照悬浮培养，其中培养基中蔗糖浓度分别为20 g/L、30 g/L、40 g/L、50 g/L。收获后测定细胞生长量、胞外多糖产量和培养基中残存蔗糖浓度(参见波钦诺克，X.H：植物生物化学分析方法，荆家海译，科学出版社，P148)，结果如图1所示。结果表明培养基的初始蔗糖浓度为40 g/L时，细胞生长量和胞外多糖产量均最高。
按照上述实施例2的方法，调整培养基中激素的种类和浓度，连续光照下对根细胞系进行悬浮培养，其中生长素包括萘乙酸(NAA)或2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，细胞分裂素包括激动素(KT)或6-苄氨基嘌呤(6-BA)，培养18-21天后收获，测细胞生长量和多糖产量，以其二者为指标确定较佳的激素组合。结果如表2所示。
表2不同激素组合及浓度水平对细胞生长和多糖含量的影响
实验号   激素组合a 细胞生长量(g/L) 胞外多糖(mg/L) 胞内多糖(mg/g) 多糖产量(mg/L)
    1     N1K0.1     13.09     227     18.0     463
    2     N2K0.2     12．48     290     22.6     572
    3     N4K0.4     12.90     303     23.4     607
    4     N1B0.1     13.24     228     17.6     461
    5     N2B0.2     12.32     245     19.9     490
    6     N4B0.4     13.74     300     22.6     610
    7     D1K0.1     7.28     101     14.3     205
    8     D3K0.3     12.23     126     12.8     282
    9     D6K0.6     13.11     183     17.0     406
    10     D1B0.1     1．36     -b     -     -
    11     D3B0.3     9.37     152     12.7     271
    12     D6B0.6     12.55     241     16.0     442
“a”：N：NAA；K：KT；B：6-BA；D：2.4-D；N1K0.1：NAA 1.0 mg/L+KT 0.1 mg/L；其它类推。
“b”：细胞褐化死亡。
由表2的结果可以看到生长素NAA对多糖产量的促进作用比较显著，并且随含量成正比。KT为较常见的细胞分裂素，且对多糖产量的促进作用较为稳定，因此确定较佳激素组合为NAA 4.0 mg/L+KT 0.4mg/L。
经过对银杏细胞悬浮培养条件的筛选，确定优选条件为根细胞系，连续光照培养，培养温度25±2℃，摇床转速90-110 rpm，培养基为蔗糖浓度40 g/L，添加激素NAA 4.0 mg/L和KT 0.4 mg/L的MS培养基，培养18-21天收获。
实施例4
用上述实施例3得到的优选培养条件进行悬浮培养，即根细胞系，连续光照，培养温度25±2℃，摇床转速90-110 rpm，培养基为蔗糖浓度40 g/L，添加激素NAA 4.0 mg/L和KT 0.4 mg/L的MS培养基，培养18-21天收获。收获的细胞培养物首先用双层滤纸抽滤，滤液离心(7000 rpm，15 min)，收集上清液提取细胞外多糖。沉淀并入上述滤渣，水洗，红外灯下(＜60℃)干燥，得到的干燥细胞收集胞内多糖。按照下述方式分别提取胞内多糖(ICP)和胞外多糖(ECP)。
得到的胞内多糖(ICP)和胞外多糖(ECP)分别在DEAE-SephadexA-50(购自Pharmacia Chem.)凝胶色谱柱上按照产品说明书指示的方法进行纯化，采用梯度洗脱，初始洗脱液为0.1 mol/L的Na-Pi缓冲液(pH 6.0)，极限洗脱液为0.5 mol/L的Na-Pi缓冲液(pH 6.0)，用苯酚-硫酸法测定各收集管的糖含量，绘制洗脱曲线如图2(ICP)和图3(ECP)所示，其中ICP分离到两个组分，ICP-1和ICP-2；ECP分离到三个组分，ECP-1、ECP-2和ECP-3。合并出峰管，对蒸馏水透析2-3天，真空干燥(LG-3型多用冷冻干燥机)透析后的各组分。
分别用Sephacry S-300HR(购自Pharmacia Chem．)凝胶色谱和聚丙烯酰胺凝胶电泳验证ICP-1、ICP-2、ECP-1、ECP-2和ECP-3的纯度。
实施例5
确定分离到的ICP-1、ICP-2、ECP-1、ECP-2和ECP-3的分子量和单糖组成及其摩尔比。
用Sephacry S-300HR(购自Pharmacia Chem.)凝胶色谱按照商品说明书指示的方法测定上述各单体的分子量。首先将标准葡聚糖T10、T70、T100、T250和T700(购自Farco Chem.)在上述凝胶柱上洗脱，得到一系列洗脱体积(Ve)，再将蓝葡聚糖上柱，得到空体积(V0)，以Ve/V0对lgMW作线性回归得：
lgMW=-3.08 Ve/V0+9.15(r=-0.9925，n=5)
将ICP-1、ICP-2、ECP-1、ECP-2和ECP-3分别以同样条件在上述凝胶柱上洗脱，得到的洗脱体积代入上述回归方程，计算相应的分子量。结果如表3所示。
        表3多糖组分的分子量
       ECP-1    ECP-2    ECP-3    ICP-1    ICP-2
分子量 13.6    5.4     34.2    10.0    1.6×104 (Da.)
参照黄荣清等(黄荣清，王作华，王红霞，等：中药材，1996；19(1)：25～26)的方法用气相色谱定量分析了ICP-1、ICP-2、ECP-1、ECP-2和ECP-3的单糖组成和摩尔比。首先将标准单糖葡萄糖(Glu)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、半乳糖(Gal)、阿拉伯糖(Ara)和木糖(Xyl)混合用盐酸羟胺和醋酐乙酰化，用肌醇六乙酰酯作内标进行气相色谱(岛津GC-17A)分析，得到的各标准单糖乙酰衍生物和内标的气相色谱图如图4的A所示。并按照下列公式计算各单糖的重量校正因子：
f=Wi/Ws/Ai/As
f：重量矫正因子；Wi：标准单糖重量；Ws：内标重量；Ai：标准单糖峰面积；As：内标峰面积
ICP-1、ICP-2、ECP-1、ECP-2和ECP-3用浓硫酸完全酸水解，按照上述方法乙酰化，以与标准单糖相同色谱条件进行气相色谱分析，ECP-1、ECP-2、ECP-3、ICP-1和ICP-2水解产物的乙酰衍生物的气相色谱图如图4的B、C、D、E和F所示。同时按照下列公式计算各多糖中组成单糖的摩尔比
各多糖中组成单糖的摩尔比=A1/As·f1/M1∶A2/A5·f2/M2∶…Ai：单糖的峰面积；A5：内标峰面积；f1：单糖的重量校正因子；Mi为单糖的分子量，结果见表4。
    表4各多糖中的单糖组成及摩尔比
ECP-1  ECP-2  ECP-3  ICP-1  ICP-2
 Rha   0.09   0.12   1.00   1.20   1.44
 Ara    -a     -   2.27     -   1.29
 Xyl   3.12   5.93     -   1.00     -
 Man   0.08     -     -     -     -
 Glu   4.62   0.11   0.07     -     -
 Gal   1.00   1.00   5.83   0.10   1.00
  “-”：为不合该单糖组分。实施例6
银杏细胞培养物胞内多糖(ICP)和胞外多糖(ECP)的药理活性检测。(一)ICP的耐缺氧作用1、对小鼠常压缺氧的保护作用(参见：徐叔云，等主编，药理实验方法学，人民卫生出版社，1982)
雄性小鼠70只，随机分为7组，对照组腹腔注射生理盐水(NS)，给药组分别腹腔注射ICP 25、50、100mg/kg，给药后30min，将小鼠分别置入150ml磨口广口瓶，内放置10g碱石灰用于吸收小鼠呼出的CO2，密封后倒置于水槽中，以呼吸停止为死亡标志，记录小鼠的存活时间，并作组间t检验，计算延长率。
Figure 9911310100141
实验结果如表5所示。结果显示ICP对小鼠常压缺氧具有明显的保护作用，不同剂量组与对照组比较均有显著性差异。
表5 ICP对常压缺氧小鼠存活时间的影响(n=10 X±SD)
    药物 剂量(mg/kg) 存活时间(min) 呼吸延长率(％)
    NS     -  22.8±5.3     -
    ICP     25  29.6±4.0   **     29.70
    50  31.8±6.9   **     39.24
    100  33.8±10.7  **     47.95
**P＜0.01(与对照组相比)2、对小鼠急性脑缺氧的保护作用(参见：陈奇等，中药药理研究方法学，人民卫生出版社，1993)
小鼠70只，雌雄各半，随机分成7组，对照组腹腔注射生理盐水，给药组分别腹腔注射ICP各25、50、100mg/kg，30min后，用利剪沿耳下部快速断头，记录小鼠断头至张口喘气停止时间，并作组间t检验，计算延长率。结果如表6所示。结果表明小鼠急性脑缺氧时，ICP能明显延长脑功能维持时间，与对照组比较差异显著。
表6 ICP对急性脑缺氧小鼠喘息时间的影响(n=10 X±SD)
药物 剂量(mg/kg) 喘气持续时间(s) 呼吸延长率(％)
    NS      -  20.3+2.1       -
    ICP     25  24.8±3.9**     22.2
    50  27.3±5.8**     34.5
    100  28.8±2.8***     41.9
与对照组相目比**P＜0.01；***P＜0.0013、对小鼠脑循环障碍性缺氧的保护作用(参见：冯亦璞，孙亚宁，陈宝泰，等：药学学报，1989，24：89～91)
小鼠70只，雌雄各半，随机分为7组，对照组腹腔注射生理盐水，给药组分别腹腔注射LGP、ICP各25、50、100mg/kg，30min后，用乙醚麻醉，剪开颈部皮肤分离两侧颈总动脉，每侧连同迷走神经用丝线结扎。双侧均结扎后开始记时，以呼吸停止为死亡指标，记录小鼠存活时间，并作组间t检验，计算延长率。结果如表7所示。结果显示，ICP 50、100mg/kg对脑循环障碍性缺氧具有明显的保护作用。表7 ICP对双侧颈总动脉连迷走神经结扎小鼠存活时间的影响(n=10 X+SD)
药物 剂量(mg/kg) 喘气维持时间(min) 呼吸延长率(％)
N.S     -     2.9+2.0       -
 ICP     25     4.9+2.8     67.7
    50     6.8±4.7**     132.5
    100     7.0±3.4**     137.6
与对照组相比**P＜0.014、对小鼠低压缺氧的保护作用(参见：陈奇等，中药药理研究方法学，人民卫生出版社，1993)
小鼠84只，雄性，随机分为7组，对照组腹腔注射生理盐水，给药组分别腹腔注射ICP各25、50、100mg/kg，给药30min后，将小鼠放入体积为3000ml的密闭真空干燥器中(7只为一组)，减压至37.2Kpa(280mmHg)，观察，记录各鼠的存活时间，并作组间t检验，计算延长率。结果如表8所示。结果表明ICP能增强小鼠耐低压缺氧能力，各实验组与对照组比较均具有显著性差异。
表8 ICP对低压缺氧小鼠存活时间的影响(n=12 X±SD)
    药物 剂量(mg/kg) 存活时间(min) 呼吸延长率(％)
    N.S     -     23.8+5.0       -
    ICP     25     30.1±0.5*     26.23
    50     31.0±7.6*     29.87
    100     35.8±5.7**     50.28
与对照组相比*P＜0.05；**P＜0.01(二)ECP的抗炎作用1、对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响(参见：徐叔云，等主编，药理实验方法学，人民卫生出版社，1982)
健康小鼠，雌雄兼用，随机分组。阴性对照组给予NS，阳性对照组给予地塞米松注射液，实验组分别给予不同剂量的ECP，给药方法见表9。给药后30min，给小鼠右耳涂抹巴豆油致炎剂50μg/只，4hr后处死小鼠，沿耳廓剪下双耳，打耳孔(直径9mm)，称重左右耳片，计算肿胀度(左右耳片重量之差)，并作组间t检验，计算抑制率。
结果如表9所示。结果表明ECP各剂量组均有抗炎作用，且随剂量增大抗炎作用增强。
表9 ECP对巴豆油所致小鼠耳肿胀的影响(X±SD)
药物 剂量(mg/kg) 给药途径 动物数 肿胀度(mg) 抑制率(％)
NS     -     ip     10     23.9±6.9     -
 Dex     5     10     6.9+3.9***     71.1
 ECP     25     -     10     13.0±8.4***     45.6
    50     10     9.4±5.2***     60.7
    100     10     4.8±1.5***     80.0
与对照组相比***P＜0．0012、对醋酸所致小鼠毛细血管通透性增大的影响(参见：徐叔云，等主编，药理实验方法学，人民卫生出版社，1982)
取健康小鼠，雌雄各半，随机分组，阴性对照组给予NS，阳性对照组给予地塞米松注射液，实验组分别给予不同剂量的ECP，给药方法见表10。给药后1小时，分别尾静脉注射1％的Evan’s blue生理盐水溶液(0.1ml/10g)，然后腹腔注射0.7％醋酸(0.1ml/10g)。30min后，颈椎脱臼处死。剪开腹部以6ml NS分数次洗涤腹腔，用吸管吸出洗液，合并后用NS标定至10ml，离心(3000rpm，15min)，取上清夜，用分光光度计于590nm处测吸收度值。记录吸收度值，进行t检验，并计算抑制率。
Figure 9911310100181
结果如表10所示。结果表明ECP能显著抑制醋酸所致小鼠毛细血管通透性的增高。表10 ECP对醋酸所致小鼠毛细血管通透性增大的影响(X±SD)
药物 剂量(mg/kg) 给药途径 动物数     吸收度 抑制率(％)
N.S     -     sc     11  0.303±0.042     -
 Dex     5     sc     7  0.148±0.043***     51.2
 ECP     50     sc     11  0.211±0.050***     30.4
    100     sc     8  0.166±0.066***     45.2
与对照组相比***P＜0.001
以上实验结果表明，银杏细胞培养物胞内多糖具有明显的耐缺氧作用，胞外多糖具有较好的抗炎作用。银杏多糖免疫活性和抗肿瘤活性的深入研究正在进行中。
本发明首次用细胞培养方法生产了银杏多糖，并提取和纯化了细胞培养物胞内多糖和胞外多糖，进一步检测了胞内多糖和胞外多糖的药理活性，本发明的研究结果为工业化生产具有药理活性的银杏多糖奠定了基础。

Claims (10)

1、银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于，包括以下步骤：
a、银杏外植体诱导愈伤组织：
b、愈伤组织转移到液体培养基中进行悬浮培养；
c、提取并纯化悬浮细胞培养物的胞内多糖和胞外多糖。
2、根据权利要求1所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中银杏外植体包括叶、柄、茎、芽、胚和种子诱导的无菌苗的根，银杏外植体诱导愈伤组织的培养基包括含生长素和细胞分裂素的MS、H、B5、6，7-V和N6琼脂培养基。
3、根据权利要求2所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中银杏外植体诱导愈伤组织的培养基为含生长素和细胞分裂素的MS琼脂培养基，生长素包括NAA、2，4-D、IAA或IBA，所述细胞分裂素包括KT或6-BA，生长素为NAA 1.0-5.0mg/L，细胞分裂素为KT 0.1-0.5mg/L。
4、根据权利要求3所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中外植体诱导出的愈伤组织的继代培养条件为光照或黑暗培养，温度25±2℃ ，每隔18-21天继代至新配制的添加NAA 1.0-5.0mg/L和KT 0.1-0.5mg/L的MS琼脂培养基上。
5、根据权利要求1所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：步骤b的愈伤组织为继代6代以上的愈组织，愈伤组织为来源于无菌苗的根诱导的愈伤组织细胞系，其中步骤b的悬浮培养条件优选光照培养，温度25±2℃，摇床转速90-110rpm，培养周期18-21天，悬浮培养培养基为添加生长素NAA或2，4-D和细胞分裂素KT或6-BA的MS液体培养基。
6、根据权利要求5所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中所述培养基为添加NAA 1.0-5.0mg/L和KT 0.1-0.5mg/L的MS培养基和添加NAA 4.00mg/L和KT 0.4mg/L的MS培养基，MS培养基中蔗糖浓度为20-50g/L。
7、根据权利要求所述6的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中所述MS培养基中蔗糖浓度为40g/L。
8、根据权利要求1所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中步骤c中用水提醇沉法收集细胞培养物中的胞内多糖和胞外多糖，按照权利要求1的方法制备的银杏细胞培养物胞内多糖和胞外多糖，用离子交换凝胶色谱DEAE-Sephadex A-50纯化胞内多糖和胞外多糖，所述胞内多糖分离到两个组分ICP-1和ICP-2；所述胞外多糖分离到三个组分ECP-1、ECP-2和ECP-3。
9、根据权利要求8所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中ICP-1和ICP-2的分子量分别为10.0×104和1.6×104Da.；ECP-1、ECP-2和ECP-3分子量分别为13.6×104、5.4×104和34.2×104Da.，其中ICP-1的单糖组成和摩尔比为鼠李糖∶木糖∶半乳糖=1.20∶1.00∶0.10；ICP-2为鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖=1.44∶1.29∶1.00；ECP-1为鼠李糖∶木糖∶甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖=0.09、3.12、0.08、4.62、1.00；ECP-2为鼠李糖∶木糖∶葡萄糖∶半乳糖=0.12、5.93、0.11、1.00；ECP-3为鼠李糖∶阿拉伯糖∶葡萄糖∶半乳糖=1.00、2.27、0.07、5.83。
10、根据权利要求8所述的银杏细胞培养生产银杏多糖，其特征在于：其中胞内多糖对常压缺氧、急性脑缺氧、脑循环障碍性缺氧和低压缺氧模型小鼠具有保护作用；胞外多糖对炎症模型小鼠具有抗炎作用。
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