CN101245334A - 悬浮培养原生植株药用有效成份的铁皮石斛胚状体工艺 - Google Patents

Abstract

采用野外生长的铁皮石斛成株茎段休眠直接诱导胚状体，在1/2MS矿物成份，CH1000毫克/升(1/2MS.矿物盐类成份：2.5％蔗糖和0.5％麦芽糖为炭源、5％香蕉汁、B150mg/L、B650mg/L、NAA、BA适量的固体培养基)在90转/分回转式摇床上，29℃±1，自然室内光照条件下，经3－4个月连续筛选，获得8.4～9.2毫克/克·天，固液比达到25～35％，培养的胚状体细胞核DNA与原生植株细胞核DNA对比完全相同，多糖含量达16％以上，得干率10％以上的技术工艺流程，其上述技术参数周年稳定。

Description

悬浮培养原生植株药用有效成份的铁皮石斛胚状体工艺

技术领域：

本发明属于生物技术领域。本发明涉及一种高等植物生物技术克隆工程，特别是针对像铁皮石斛这种在自然环境中生长十分缓慢，对环境条件要求十分苛刻，生物量十分低下，目前自然资源十分枯竭、濒灭而名贵的中药材。

技术背景：

“21世纪是生物技术的世纪”。随着城市化进程的迅速发展和人口的不断增长，生态环境的不断退化，使许多名贵中药材资源枯竭和濒灭。尤其像铁皮石斛这类，生长缓慢、对环境要求十分苛刻、生物量又及其低下的物种更是“首当其冲”。虽然从上个世纪80年代开始，人们试图用种子繁殖，人工栽培等手段或通过组织培养，诱导种子原茎球来扩增植株，再进行人工引种栽培等方法，扩大铁皮石斛的生产。但是迄今成效甚微。

本发明根据高等植物细胞的两个全能性：植物细胞具有分化成完整植株的全能性和植物细胞能合成原生植株药用有效成份的全能性。根据这样的理论基础，针对铁皮石斛这一具体物种，发明了一整套从铁皮石斛原生植株成株茎段休眠芽上直接诱导出胚状体，从源头上保证了药材的“原汁原味”。

本发明有别于通常的组织培养中使用的脱分化和再分化手段筛选后代的做法。一般地说，凡通过脱分化过程容易引起遗传变异，较难保证药材的“地道”标准。利用本发明的铁皮石斛胚状体悬浮培养技术工艺，其生长速率达到8.4～9.2毫克/克·天；相当于自然生长速度的1300倍以上。“固液比”达到25～35％，每10天收获一次得干率10％以上。经胚状体细胞核DNA与原生植株细胞核DNA对比检测，两者的DNA完全相同。其遗传稳定性可靠。通过实施本发明的技术工艺，使铁皮石斛的生物培养规模从实验水平向工厂化生产规模转化提供了物质保证。

发明内容：

本发明公开了直接从铁皮石斛原生植株成株茎段的休眠芽上诱导出胚状体的技术工艺。有别于通过脱分化、细胞再分化成芽簇或植株的过程。铁皮石斛带休眠芽茎段，经常规灭菌后，在超净台上切取带节的切段，插入到1/2 MS.矿物盐类成份2.5％蔗糖和0.5％麦芽糖为炭源、5％香蕉汁、4.5克/升琼脂粉、PH5.8、NAA、BA适量的固体培养基上。29℃±1，自然室内光照条件，经45～50天后，在休眠芽上生长出浅绿色的起始胚状体。等到起始胚状体“球”长到黄豆粒大小时，小心地、及时地将胚状体球剥离外植体，放在相同的上述培养基上扩增。达到足够数量后，转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，进行悬浮培养，每个150毫升三角瓶装液75毫升，每瓶按5％(W/W)接种率接种；每7天继代一次；经3-4次继代后；进入筛选程序，从培养物中不断挑选出那些生长紧密、呈圆球状、浅绿色、增殖速度快的胚状体“球”，淘汰那些长成丛芽状或芽簇状的培养物。通过3～4个月的连续筛选，最终达到每10天收获一次，其“固液比”达到25～35％，多糖含量达到16％以上；“比生物生长速率”达到8.4～9.2毫克/克·天；并能保持周年稳定的成熟系。

本发明公开了一种通过铁皮石斛原生植株成株茎段上的休眠芽，直接诱导出胚状体，在人工控制条件下，促进它的无限增殖，其遗传稳定性，经DNA检测完全与原植株相同。按本发明的技术工艺可以生产出符合铁皮石斛原生植株药用有效成本的干粉，扩大市场供应量，满足人们的需要。

实施案例：

下面结合实施案例，对本发明作进一步的描述，但不是限制本发明的局限性。

附图说明

附图1，铁皮石斛悬浮培养胚状体生产原生植株药用有效成干粉技术工艺流程图

实施例1.铁皮石斛胚芽的悬浮培养(见附图1)

1.铁皮石斛外植体采集、灭菌：采集野外生长的铁皮石斛植株成年茎段，一般带有7～10节(叶)茎段。先用自来水冲洗干净，用眼科尖头镊子仔细地剥去叶片和叶鞘，用手术刀切成带3～4节切段、50％乙醇、浸润3～5秒钟，放入用无菌水新配的0.1％升汞溶液中，15～17分钟；然后转入到同样用灭菌水新配制的饱和次氯酸钠或饱和次氯酸钙溶液中7～8分钟；在超净台上，用灭菌水冲洗后，浸泡在灭菌水中约20分钟；放到灭菌吸水纸上吸干多余的水份；用灭菌刀片切取带节茎段，节的上下各留0.5公分，然后按生物学上的上下极插入到诱导胚状体的固体培养基上；每个150毫升的三角瓶，装量75毫升，每瓶插一段。

2.起始胚状体的诱导培养基：经1.1大气压121℃、21分钟灭菌，(成份表：1/2MS.矿物盐类成份，2.5％蔗糖和0.5％麦芽糖为炭源、5％香蕉汁、4.5克/升琼脂粉、PH5.8、NAA、BA适量的固体培养基)接种好外植体三角瓶放在29℃±1，自然室内光照条件下，经45～50天培养后，起始胚状体在茎段休眠芽上长出。等到黄豆粒大小时，小心地、及时地将胚状体“球”剥离的外植体，将剥离的胚状体球，转入到上述相同的新配的培养基上，每个三角瓶中，按等边三角形放置3个胚状体球，以利于形成“条件培养基”，进一步促进胚状体球的增殖。

3.胚状体悬浮培养基及筛选程序：

A.悬浮培养基：上述固体培养基中去除琼脂粉即成液体培养基，同上述一样条件灭菌；

B.胚状体悬浮培养：等在上述固体培养基中长成足够量的胚状体后，将胚状体按5％(W/W)接种率，接种到150毫升三角瓶，装液量75毫升；三角瓶用铝铂纸封口，放到90转/分回转式摇床上，29℃±1，自然室内光照条件进行悬浮培养，每7天继代一次；3-4次继代后进入筛选培养程序。注意每次继代时，倒掉一半老的培养基，补充一半新鲜培养基，以利于形成“条件培养基”，促进悬浮培养基胚状体快速增长。

C.符合悬浮培养胚状体的筛选：经过3-4次继代后，进入筛选程序；仔细挑选那些结构紧密，呈球状的、浅绿色、增殖快的胚状体“球”，及时淘汰那些长成丛芽状或芽簇状的培养物。通过3-4个月的不断挑选，使每个500毫升三角瓶、200毫升液量中的培养物，在形态上一致，色泽上相似，结构上紧密，培养液清澈的培养体系。

D.“比生物生长速率”，“固液比”，“DNA对比检测”，“多糖含量检测”，得干率检测，达到C项中所述的培养体系后进入各项检测。

“比生物生长速率”(简称“生长速率”)检测：

资料显示，高等植物组织培养要达到工厂化生产，其生长速率起码达到5.7毫克/克·天；即，培养物鲜重增长达到每克(毫升)培养，每天增加5.7毫克以上；本发明在实施过程经检测，其生长速率达到8.4毫克/克·天；为了保证铁皮石斛多糖含量每10天收获一次。计算公式：(收获量-接种量)÷培养重量÷收获时培养天数＝生长速率；

固液比测定：培养鲜重÷(培养基重+鲜重)＝25～35％

得干率检测：绝对干重÷收获鲜重＝10％

实施例2.胚状体无菌干粉生产(见附图1)

为了使铁皮石斛多糖含量达到16％以上，胚状体成品收获周期为10天。收获的胚状体成品，经超净水冲洗掉外表的培养基后，放置到达标的GMP认证的房中，在室温25～27℃，薄层晾干至鲜重含水的5％左右，放入到55℃烘箱中，烘至绝对干重(超过65℃以上，会造成铁皮石斛胚状体中许多生理活性成份的变性和转失)。超级粉碎后，定量包装，经医用钴室灭活菌，即成胚状体无菌干粉。

实施例3.铁皮石斛胚芽生物活性测定

按阴虚动物模型法测定铁皮石斛的功效(徐叔云主编：药理实验方法学，人民卫生出版社，1982年出版，第562页).取体重为20-25克雌性正常小鼠140只，饲养适应一周后，均分为7组，各组分开饲养，并在鼠体上进行染色标记，以区分各组别。

给服9天中药后，进行45℃高温处理30分钟后，各组存活小鼠数量。

组别	动物总数(造模结束后)	存活数	存活率(％)
				模型对照组	19	0	0
野生干品3.5g组	14	2	14.29
				野生干品7.0g组	14	5	35.71
石斛芽干品3.5g组	14	4	28.57
				石斛芽干品7.0g组	14	7	50.00

将以上5组实验动物分别进行药物灌胃。药物为：甲状腺(3mg/d/只)、利血(0.02mg/d/只)、生理盐水适量。每天一次，连续5天。待造型完成三天后，实验组加灌石斛提取液(灌胃)，剂量为3.5和7.0克/kg/d，对照组给以等量水，连续9天。待最后一次给药30分钟后，将5个组的小白鼠同时置于几个45℃的烘箱中，进行耐高温实验。待37分钟后，打开烘箱，记录各组的死亡率。按卡方检验法进行统计学处理.

与对照组相比，铁皮石斛组培鲜品和干品均可保护阴虚动物在高温下死亡，其效果与野生铁皮石斛干品相当.

实施例4.铁皮石斛胚芽的多糖测定

一、实验方法

1、试剂配制

(1)乙醇溶液(80％)，20ml水中加入无水乙醇80ml。

(2)苯酚溶液：称取精制苯酚5.0克，加入水中溶解并稀释至100ml，混匀，备用(溶液置4℃冰箱可保存一个月)。

(3)浓硫酸备用。

(4)葡萄糖标准储备液：精密称取在105℃干燥至恒重的葡萄糖标准品1.0080g，加水溶解并定容至100ml，混匀，置4℃冰箱保存。此溶液每ml含10.080mg葡萄糖。

(5)葡萄糖标准使用溶液：吸取葡萄糖标准储备液2.00ml，置于100ml容量瓶中，加水至刻度，混匀，置于4℃冰箱中保存。

2、实验方法

(1)葡萄糖标准曲线制备

精密吸取葡萄糖标准使用液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，(相当于葡萄糖0，0.04032，0.08064，0.12096，0.16128，0.2016mg)分别置于25ml比色管中准确补充水至2.0ml，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀，小心加入浓硫酸10ml，于旋转混匀器上小心混匀，置沸水浴中煮沸15min，冷却后用分光光度计在490nm波长处以试剂空白溶液为参比，1cm比色皿测定吸光度值。

以葡萄糖质量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘标准曲线。由标准曲线回归曲线方程图得相关系数。

样品测定

a.样品提取

铁皮石斛胚芽在60℃烘箱中烘干，粉碎，称取约0.1g备用。石斛粉经95％乙醇提取后，按20倍体积水加温90℃，1小时。趁热过滤，收取滤液，减压浓缩，加4倍体积无水乙醇混匀，4000rpm，15min离心，沉淀用80％乙醇洗2遍，最终沉淀物溶于50ml水即为石斛粗多糖溶液。

b.多糖测定

精密取多糖溶液2.0ml置于25ml比色管中，加入苯酚溶液2.0ml，在旋转混匀器上混匀后，小心加入浓硫酸10.0ml后混匀，置于水浴中煮沸10min，冷却至室温用分光光度计在490nm波长处，以试剂空白为参比，1cm比色皿测定葡萄糖标准溶液和样品(按倍比稀释至合适浓度)吸光度值，做葡萄糖标准曲线图，计算样品中粗多糖含量。

c.计算方法

根据样品的OD值从标准曲线中查出相应的葡萄糖含量，乘以稀释倍数，换算成总多糖含量，再除以烘干样品的干重，即为每克干重样品中含粗多糖的含量，单位为mg/g。

二、铁皮石斛多糖测定结果

实验对不同培养天数的铁皮石斛胚芽和细胞团及其培养上清中的多糖含量进行了定量测定.结果表明：所测材料中的多糖含量稳定，其中13至20天的胚芽多糖含量为136-161mg/g干重；占总量的10-16％。

实施例5.铁皮石斛胚芽与野生铁皮石斛DNA图谱的比较

通过一种源于植物线粒体序列而区分不同植物的方法，步骤为：从野生铁皮石斛鲜品和干品及铁皮石斛胚芽鲜品和干品植物组织中提取植物基因组DNA和线粒体DNA，从GENEBANK查找摸式植物线粒体序列，运用序列分析软件进行序列比较，找出相对保守的序列，对这些保守序列进行网上查询，遵循引物设计原则，运用引物设计软件设计出59对引物；以提取的植物基因组DNA和线粒体DNA为模板，对比度所设计的引物进行聚合酶链式反应；运用聚丙烯酰胺凝胶电泳对聚合酶链式反应的结果检测并分析。

结果显示：使用模板3次和59对引物以复合PCR技术扩增线粒体基因5’及3’非编码区序列，野生铁皮石斛鲜品和干品及铁皮石斛胚芽鲜品和干品样本多态性完全相同。

Claims (7)

1. 一种经体外悬浮培养获得的铁皮石斛胚芽，其培养过程是：

铁皮石斛带休眠芽茎段，经常规灭菌后，在超净台上切取带节的切段，插入到1/2MS.矿物盐类成份2.5％蔗糖和0.5％麦芽糖为炭源、5％香蕉汁、4.5克/升琼脂粉、PH5.8、NAA、BA适量的固体培养基上。29℃±1，自然室内光照条件，经45～50天后，在休眠芽上生长出浅绿色的起始胚状体。等到起始胚状体“球”长到黄豆粒大小时，小心地、及时地将胚状体球剥离外植体，放在相同的上述培养基上扩增。达到足够数量后，转入到上述培养基去掉琼脂粉的液体培养基中，进行悬浮培养，每个150毫升三角瓶装液75毫升，每瓶按5％(W/W)接种率接种；每7天继代一次；经3-4次继代后；进入筛选程序，从培养物中不断挑选出那些生长紧密、呈圆球状、浅绿色、增殖速度快的胚状体“球”，淘汰那些长成丛芽状或芽簇状的培养物。通过3～4个月的连续筛选，最终达到每10天收获一次，其“固液比”达到25～35％，多糖含量达到16％以上；“比生物生长速率”达到8.4～9.2毫克/克·天；并能保持周年稳定的成熟系。

2. 权力要求1中所述铁皮石斛胚芽的培养体系，其“固液比”为25～35％，“比生物生长速率”达到8.4～9.2毫克/克·天。

3. 权力要求1中所述铁皮石斛胚芽，其多糖含量达为16％以上。

4. 权力要求1中所述铁皮石斛胚芽，其DNA图谱与野生铁皮石斛相同。

5. 用权力要求1中所述铁皮石斛胚芽制备的干品，用于中草药的配伍。

6. 用权力要求1中所述铁皮石斛胚芽制备的干粉，用于食品添加剂。

7. 用权力要求1中所述铁皮石斛胚芽制备的干粉，用于饮料的制备。

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