CN101654664B - 一种高产胞外多糖菌株及其多糖的发酵生产方法和应用 - Google Patents

Abstract

一种高产胞外多糖菌株及其多糖的发酵生产方法和应用，涉及一种多糖。提供一种高产胞外多糖菌株及其多糖的发酵生产方法和应用。菌株为彭氏变形菌PZ-1(Proteus penneri)。将培养基接种彭氏变形菌PZ-1后发酵得发酵培养液，冷却后离心去菌体，取上清液，上清液用工业酒精沉淀，静置，得沉淀液；将沉淀液离心，取沉淀物，得粗多糖；将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。经系列实验验证，说明所获得的菌株具有变形杆菌属的特性，能高产胞外多糖，具有明显的免疫增强和提高动物抗病能力的作用，发酵生产的胞外多糖可用于制备兽药注射液、兽药粉剂、饲料添加剂、免疫佐剂及保健食品功能性原料。

Description

一种高产胞外多糖菌株及其多糖的发酵生产方法和应用

技术领域

本发明涉及一种多糖，尤其是涉及一种菌株及其胞外多糖的发酵生产方法和应用。

背景技术

关于彭氏杆菌多糖发酵的研究，从国内外发表的文章来看，国内只有分离彭氏变形杆菌的文章，而未见相关方面的研究；国外有大量的文章研究彭氏变形杆菌多糖成分和其抗原性，从不同的血清型如Proteus penneril，2，3，8，10，14，15，16，18，19，20，22，25，26，31，32，35，41，42，45，52，60，62，63，71，75，103等([1]F.W.Hichman，A.G.Steigerwalt，J.J.Farmer III，And Don J.Brenner.Identification of Proteus penneri sp.nov.，Formerly Known As Proteus vulgaris Indole Negative orAs Proteus vulgaris Biogroup 1，J Of Clinical Microbiology，1982，15(6)：1097-1102)，由Kondakova AN和Zych K，Sidorczyk Z，Shashkov AS Drzewiecka D，Arbatsky NP等([2]Kondakova AN，Toukach FV，Senchenkova SN，Arbatsky NP，Shashkov AS，Knirel YA，Bartodziejska B，Zych K，Rozalski A，Sidorczyk Z.New structures of the O-specificpolysaccharides of Proteus.3.Polysaccharides containing non-carbohydrate organic acids.Biochemistry(Mosc).2003，68(4)：446-457)科学家们进行了精细的研究，从上世纪90年代到2005年之间，相关的多糖结构和功能之间的关系研究比较深入。但是，至今未见国内外有这种菌株发酵提取多糖的报道。

20世纪60年代以来，多糖被认为是一种广谱的非特异性的促进剂，在人类免疫中，可增强宿主细胞的细胞免疫和体液免疫功能，如激活巨噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞等，激活补体及诱导产生干扰素等，其作用将是激活人体的非特异性防御机能，在抗病毒抗肿瘤、治疗心血管病、放射病防护等方面有很好的疗效([3]周世文，徐传福，多糖的免疫药理作用.中国生化药物杂志，1994，15(2)：143-147)。

另外，多糖(Polysaccharide)是由单糖之间脱水形成糖苷键，并以糖苷键线性或分枝连接而成的链状聚合物。一般将由2～10个单糖通过非α-1，4-糖苷键连接形成的直链或支链的一类糖称为寡糖或低聚糖，由10个以上的单糖分子组成的糖称为多糖。20世纪50年代，由于发现多糖的显著免疫活性，各国学者逐渐从细菌、真菌、海藻、高等植物等生物体中获得的多糖中发现其具有独特的生物活性，其中以多糖的促进和恢复机体免疫功能作用尤为突出。多糖作为一种免疫促进和调节剂，具有抗菌、抗病毒、抗寄生虫、抗肿瘤、抗辐射和抗衰老等功用。活性多糖以来源广泛、价格低廉、效果确切、纯天然，而受到人们的普遍重视和研究，其应用范围日益扩大([4]王健，龚兴国，多糖的抗肿瘤及免疫调节研究进展.中国生化药物杂志，2001，22(1)：52-54)。

在一般情况下，多糖对机体特异性免疫与非特异性免疫，细胞免疫与体液免疫皆有影响。免疫多糖作为生物效应调节剂(BRM)，主要影响机体的网状内皮系统(RES)、巨噬细胞(MO)、淋巴细胞、白细胞、NK细胞、补体系统以及RNA、DNA、蛋白质的合成，体内cAMP与cGMP的含量，结果是抗体的生成、淋巴因子及干扰素的诱生增强。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产胞外多糖菌株。

本发明的另一目的在于提供一种胞外多糖的发酵生产方法及其应用。

所述胞外多糖菌株为彭氏变形菌PZ-1(Proteus penneri)，所述彭氏变形菌PZ-1(Proteuspenneri)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.3224，保藏日期：2009年8月12日。

所述胞外多糖菌株为一种彭氏变形杆菌，其部分16Sr RNA的部分核苷酸序列如下：

CAACTTTGGACATGTATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTGATGCCGTTGCTCTCGTCGCTGCGCCGCCCCAGCAGTTGCATCCCTAAGCAGATGCCCAGCACCGGTTGGGTACAGGCTTTGATGAGATCAAACAGCTCGCGCTCACGTACCTGATCCATCGCCGCTTGCGCAGTGCCAACGCCGGGTAAAAACAGTTTATCGGCCAGCAACACGACGTCCGGGTCACGGCTGACTTTGGGTTCATAACCGTGACGCGCAATGGCAGACTTCACCGAGTTCAGGTTGGCGCAGCCGGTATCAAGGATCACCACGTTCATTACAGCACTCCTTTCGACGAGAGCAACGGCATCAAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACATAACCCTGATAAATGCTTCATAATATTGAAAAGGAGAGTATGAGTATTCACATTTCCGTGTCGCCTATCCCTTTTTGCGCATTTGCTCTGTTTTGCTCACCAGAACGCTGTGAAGTAAGATGCTGAGATCAGTGGGTGCACGAGGGTTACTCGACTGAATCTCACAGCGTAGATCTGAAAGTTCGCCCGAGACGTTCAATGATGAAACTTTAGGTTGCTTGGGGCGGATATCCGATGACGGCAGCACCTGTGCCGTACCATTCTCCAAGACCTGGGTGTGAATA；

所述胞外多糖菌株的革兰氏染色阴性，大小为(0.4～0.6)μm×(1～3)μm，有明显多形性，为丝状，有完整细胞壁，无荚膜，幼龄培养物中有周身鞭毛；在固体培养基上呈扩散性生长，形成以菌接种部位为中心的厚薄交替，同心圆型的层层波状菌苔；生化试验细菌氧化酶阳性，触酶试验阳性；经典的微生物生化检验说明其具有变形杆菌属的特性。

所述彭氏变形菌分离于厦门白城自然土壤，可采用以下方法分离：

将所取土壤样品分别划线接种于肠道菌选择培养基(S，S琼脂或D·C琼脂)及鉴别培养基(伊红美兰琼脂或麦康凯琼脂)平板各一个，在37℃的条件下培养18～24h后，观察菌落特征。选取在鉴别培养基上无色透明、蔓延生长，在选择培养平板上形成单个菌落，菌落边缘呈扩散状，周围淡蓝色中心稍厚，打开平皿时有臭味，有粘性的可疑菌落。将可疑菌落接种于苯丙氨酸琼脂斜面(爱德华氏改良培养基)，37℃培养6～8h后观察结果，此时苯丙氨酸琼脂斜面变为棕黑色，为苯丙氨酸脱羧酶阳性，经革兰氏染色镜检，为革兰氏阴性杆菌，可初步判定为变形杆菌。进一步送有关部门鉴定，可采用VITEK-32全自动细菌检测仪进行鉴定，确认为彭氏变形杆菌。

所述胞外多糖的发酵生产方法包括以下步骤：

1)配制培养基：按质量百分比，培养基的配方如下：蛋白胨为0.5％～2％，KH₂PO₄为0.2％～0.8％，MgSO₄为0.01％～0.05％，MnSO₄为0.01％～0.05％，FeSO₄.·7H₂O为0.001％～0.01％，配好后用NaOH溶液调pH至7.0～7.6，得培养基；

2)将培养基接种彭氏变形菌PZ-1后发酵48～72h，得发酵培养液；

3)将发酵培养液冷却后离心去彭氏变形菌PZ-1菌体，取上清液；

4)将离心去菌体后的上清液用工业酒精沉淀，静置，得沉淀液；

5)将沉淀液离心，取沉淀物，得粗多糖；

6)将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。

在步骤2)中，所述发酵培养的温度最好为25～40℃，搅拌速度为150～450r/min；

在步骤3)中，所述离心的离心力最好为3500～6000rpm，离心的时间最好为10～30min。

在步骤4)中，所述工业酒精的质量百分比浓度最好为70％～95％，按质量比，上清液∶工业酒精最好为1∶(2～5)，所述静置的时间最好为2～5天。

在步骤5)中，所述离心的离心力最好为7000～25000rpm，离心的时间最好为10～30min。

在步骤6)中，所述纯化可采用膜过滤方法对粗多糖进行纯化，可应用苯酚-硫酸法测定多糖含量。

由于胞外多糖菌株本身的上述特性及辅于诱变处理，不仅高产胞外多糖，多糖的生产成本低；而且经口急性毒性试验证明，采用所述胞外多糖菌株生产的胞外多糖无毒无害，该胞外多糖具有良好的增强养殖动物机体免疫力的作用，因此所述方法发酵生产的胞外多糖可用于制备兽药注射液、兽药粉剂、饲料添加剂、免疫佐剂及保健食品功能性原料。

本发明采用生物技术筛选获得高产胞外多糖的目的菌株，通过系列生物化学技术获得菌株发酵产物胞外多糖；采用现代提取技术对发酵液提取纯化获得高纯度多糖。菌株发酵生产胞外多糖含量的测定；菌株发酵产物胞外多糖经口急性毒性试验；菌株发酵产物胞外多糖的抑瘤试验；菌株发酵产物胞外多糖制成兽药注射剂进行乳猪注射试验；菌株发酵产物胞外多糖制成饲料添加剂进行鸡饮水试验；菌株发酵产物胞外多糖制成免疫增强佐剂进行母猪的免疫增强试验等。经系列实验验证，说明所获得的菌株具有变形杆菌属的特性，能高产胞外多糖，具有明显的免疫增强和提高动物抗病能力的作用，可开发为兽药注射液、兽药粉剂、饲料添加剂、免疫佐剂及保健食品功能性原料。

附图说明

图1为本发明所述胞外多糖菌株(即彭氏变形菌PZ-1(Proteuspenneri))的菌落特征。

图2为本发明所述胞外多糖菌株(即彭氏变形菌PZ-1(Proteus penneri))的菌体形态结构(结晶紫染色，400X)。

具体实施方式

实施例1：一种高产胞外多糖菌株的鉴定

经典的微生物生化检验说明，所获得的高产胞外多糖菌株具有变形杆菌属的特性，为一种彭氏变形杆菌，革兰氏染色阴性，大小为(0.4～0.6)μm×(1～3)μm，有明显多形性，为丝状，有完整细胞壁，无荚膜，幼龄培养物中有周身鞭毛；在固体培养基上呈扩散性生长，形成以菌接种部位为中心的厚薄交替，同心圆型的层层波状菌苔。参见图1和2。

生化特征：

本菌株不发酵乳糖，能产生尿素酶，分解尿素而释放氨。吲哚阴性，氧化酶阴性。触酶试验阳性。能分解胶原蛋白。能发酵葡萄糖产气，不发酵乳糖，不发酵柠檬酸和丙二酸。甲基红染色阳性，水解硫化氢，不能使亚硝酸盐产气。有脂肪酶活性，水解酪素和脲，不水解淀粉。具有苯丙氨酸脱氨酶活性，可利用乙酸和酒石酸。粘菌素-多粘菌素和氯霉素敏感，万古霉素不敏感，能分解甘油和麦芽糖，能利用蔗糖和海藻糖，D-木糖。不能分解七叶苷和水杨苷。

实施例2：一种胞外多糖菌株发酵生产胞外多糖的生产工艺

1)培养基

以配制1L培养基原液作为种子液，接种量为1∶50，种子罐50L为例。

配方：蛋白胨10g，KH₂PO₄5g，无机盐25ml(MgSO₄0.5g/L，MnSO₄0.18g/L，FeSO₄7H₂O0.1g/L)。

配好后用NaOH溶液调pH至7.2～7.4，然后分装。

2)灭菌

将分装好的培养基原液放入高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌。灭菌温度为121℃，时间为20min。

3)接种

将灭完菌的培养基原液冷却后，在无菌操作台上接菌种，注意操作过程中防止染菌。

4)摇床培养

接菌完毕后，置于摇床培养。

5)发酵培养

5.1发酵设备参数的设定：发酵培养的温度为28℃，搅拌速度为300r/min。

5.2加培养液：按步骤1)培养基的配方配制培养基原液，灭菌后加入种子罐。

5.3种子罐接种：当发酵液温度降至接种温度28℃即可进行接种，将步骤4)摇床培养的种子培养基接入种子罐。

5.4培养：依据发酵现场观察气泡产生情况调节通气量，培养温度为28℃，搅拌速度为300r/min。

5.5移种培养：按步骤1)培养基的配方配制培养基原液，加入发酵罐。当发酵罐的发酵液灭菌结束，并降至发酵温度28℃后，种子罐中发酵成熟的种子液即移至发酵罐内发酵培养。培养温度为28℃，搅拌速度为300r/min，发酵培养48h。

6)离心

将发酵完毕的培养液冷却后于4200rpm离心，时间为20min。去菌体，取上清液。

7)醇沉

将离心后的上清用工业酒精沉淀，按质量比，工业酒精∶上清液为3∶1，静置过夜。

8)离心

将菌液进行离心分离，于10000rpm离心15min，取沉淀，即得粗多糖。并回收沉淀后的工业酒精。

9)检测及纯化

应用苯酚-硫酸法测定多糖含量；计算胞外多糖的回收得率及产量。

实施例3：一种胞外多糖菌株所产胞外多糖含量的测定方法

1)试剂

水为蒸馏水。浓硫酸(GR)、95％乙醇和无水葡萄糖均为市售分析纯。

苯酚试剂：取苯酚(CP)200g，加铝片0.2g和碳酸氢钠0.1g，蒸馏，收集180℃左右的馏分。将新蒸苯酚配成浓度50g/L的溶液，放入棕色瓶中，置于冰箱中保存备用。

2)仪器

722分光光度仪，BECKMAN低温冷冻离心机，真空冷冻干燥器，恒温箱，旋转蒸发器。

3)操作方法

3.1葡萄糖标准曲线的测定：精确称取105℃干燥至恒重的标准葡萄糖20mg，分别溶于100ml重蒸水中。标准液分别稀释成浓度为30μg/ml，60μg/ml，90μg/ml，120μg/ml，150μg/ml，180μg/ml的溶液，取该溶液各0.2ml(含糖6～36μg)置于10ml试管中，加入50g/L苯酚溶液0.4ml混合后，迅速加入2ml浓硫酸，混合均匀后，室温放置30min，在波长490nm测定吸光度，空白对照以蒸馏水代替糖溶液。

3.2胞外多糖的纯化

称取适量粗制胞外多糖样品粉末，放于磨口三角瓶中，按料水比1∶20在温度100℃的热水浴中回流浸提2h，冷却后离心，合并上清液。上清液用酶法去除淀粉，按18U/g加液化酶到上清液中，在pH值为6，65℃水浴条件下处理，用I₂/KI溶液检验，直到碘液不变色为止。接着用Sevag法除去蛋白质，在水浴中挥去有机相，H₂O₂除色，然后加3倍体积95％乙醇溶液，离心、冷冻干燥即得纯化的胞外多糖。

3.3样品液的制备

称取适量纯化的胞外多糖样品粉末，用蒸馏水溶解、500ml容量瓶定容，即得样品液。

糖含量控制在6～30μg之间(本方法中的糖含量均指所加的0.2ml标准液或样品液中含糖的微克数)。

3.4换算因子的测定。称取干燥至恒重的纯化胞外多糖粉末5mg，置于50ml容量瓶中，加水溶解至刻度，摇匀作为储备液。精确移取该贮备液1.0ml，按步骤3.1的测定方法测定吸光度，计算出多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子。

F＝W/C×D

式中，W为多糖质量(mg)，C为多糖中葡萄糖的浓度(mg/ml)，D为多糖的稀释因素。计算结果保留三位有效数字。

3.5稳定性试验。取样品供试液，按步骤3.1的测定方法，将同一份反应液间隔一定时间，记录吸光值，测定稳定性。

3.6精密度试验。取样品供试液，按步骤3.1的测定方法，重复测定5次，记录吸光值。

3.7回收率的测定。采用加样回收法。吸取多糖样品溶液0.5ml，分别加入标准葡萄糖溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5ml，按照步骤3.1的测定方法分别测其吸光度，并根据葡萄糖的检出量，按以下公式计算其回收率：

回收率＝(实验测值-样品所含被测成分量)/加入纯品量×100％

3.8多糖含量的测定。吸取样品液1.0ml，用重蒸水定容至100ml，取定容液1.0ml，按步骤3.1的测定方法操作，重复测定5次，测吸光度，以标准曲线和下式计算样品中多糖的百分含量：

多糖含量(％)＝(C×D×F)/W×100％

式中，C为供试液葡萄糖浓度(mg/ml)，D为供试液的稀释因素，F为换算因素，W为供试品的质量(mg)。计算结果保留三位有效数字。

实施例4：一种高产胞外多糖菌株所产胞外多糖经口急性毒性试验

经委托福建省疾病预防控制中心检测，闽疾控中心卫检食(06)0037号检测报告载明：受托的胞外多糖经口急性毒性试验结果为LD50＞20g/kg体重，属无毒。

实施例5：一种胞外多糖菌株所产胞外多糖的抑瘤试验

1)材料和方法

(1)彭氏变形菌PZ-1菌种和其发酵产生的胞外多糖

细菌为百拓实验室保藏的彭氏变形菌PZ-1，多糖为按所述胞外多糖的发酵生产方法生产提取纯化的胞外多糖。

(2)动物实验分组

动物实验分组包括细菌胞外多糖1个实验组和1个对照组，每组10只小鼠.实验组每只注射多糖50mg/kg.d(共1mL/d)连续7天，对照组每只注射生理盐水1mL共7天。

(3)动物体内抗瘤实验

实验采用的小鼠S-180实体瘤细胞和昆明种小鼠由厦门大学抗癌中心提供。S-180细胞复苏后，接种小鼠腹腔；4～5天待腹水癌长出后，一部分保种，其余部分接种小鼠肩胛骨部位；14天实体瘤形成，研碎瘤体组织，过滤，调整细胞浓度到1×10⁶/mL；接种对照组小鼠和已注射多糖的实验组小鼠，14天后杀死小鼠称瘤重。

(4)抑瘤率计算公式为：

2)结果

表1给出胞外多糖对小鼠S-180腹水瘤的抑制作用。从表1可见，细菌胞外多糖其抑瘤率高至54.5％.

表1多糖体内抗瘤试验

x±s(g)：均数±标准差；t：采用SPSS数据统计软件，做组间两均数比较的t检验；

P：置信限或可信限即比较两组的差异是否显著。

实施例6：一种胞外多糖菌株所产胞外多糖的乳猪注射试验

1)试验目的：

验证彭氏变形菌PZ-1和对照菌株PZ-3所产的胞外多糖制成的注射剂在乳猪中的注射使用效果和注射量。

2)材料与方法

(1)试验动物选择：分别选择品种一致，年龄相近，性别比例一致，体况与质量相当的出生14天后的“杜洛克长白大约克”三元杂交乳猪108头，分成3组，每组36头，编号称重。

(2)试验时间：共28天。

(3)试验饲料品种：试验使用猪场原使用的乳猪教槽料，试验1、2、3组使用同种饲料。

(4)饲养管理：每天饲喂三餐，期间进行同种疫苗接种，发现病情根据症状进行处理。

(5)数据来源：称重始重，末重，登记病情及处理方法。数据登记见表1试验统计数据总汇表。

(6)数据分析：计算每组初重、末重、增重和平均日增重。

(7)试验1、2组每组称重后当天分别注射1ml(每ml含纯多糖10mg)彭氏变形菌PZ-1和对照菌株PZ-3所产的胞外多糖制成的注射剂，每隔1周再注射1次，连续3次，空白对照组不注射。

3)试验地点：厦门市某养殖有限公司。

4)试验结果：

(1)试验统计：试验统计数据总汇见表2。

表2

数据统计项目	试验1组(菌株PZ-1组)	试验2组(菌株PZ-3组)	试验3组(空白对照组)
				试验期初头数(头)	36	36	36
试验期末头数(头)	36	36	36
				试验天数(d)	28	28	28
总初重(kg)	131.4	131.4	131.0
				总末重(kg)	325.8	308.2	302.8
平均日增重(g/头)	192.8	175.4	170.3
				试验组比对照组多增重(g/头)	580	130

(2)试验动物情况

试验期内，试验组和对照组都未出现疾病及死亡。从外观上观察，试验1组乳猪比试验2组和空白对照组乳猪显得更活泼和健康。

5)试验结果分析：

试验结果分析可知：

(1)在28天的试验期内，试验1组(PZ-1细菌胞外多糖组)乳猪比试验2组(PZ-3细菌胞外多糖组)乳猪每头平均多增重450g，比空白对照组每头平均多增重580g，差异显著(P＜0.05)；试验2组乳猪每头平均比空白对照组每头平均多增重130g，差异不显著(P＞0.05)。

(2)试验结果证明彭氏变形菌PZ-1发酵所产的胞外多糖制成的注射剂比对照菌株PZ-3发酵所产的胞外多糖制成的注射剂具有较为明显的免疫增强作用，提高了乳猪的生产性能指标。

实施例7：一种胞外多糖菌株所产胞外多糖的鸡饮水试验

1)试验目的：

验证彭氏变形菌PZ-1发酵所产的胞外多糖免疫增强剂在肉鸡中的饮水使用效果。

2)材料与方法

(1)试验动物选择：分别选择品种一致、年龄相近、性别比例一致、体况相当的同批次质量30g的北京白鸡AA肉仔鸡20500只分成2组，一组为8500只为试验组，一组12000只为对照组(根据鸡栏场地大小分配)。

(2)试验时间：共47天。

(3)试验饲料品种：试验使用鸡场原使用的森宝肉鸡专用系列全价饲料，试验组和对照组使用同种饲料。

(4)饲养管理：按鸡场原习惯的正常饲养管理方式，期间进行同种疫苗接种，发现病情根据症状进行处理。

(5)数据来源：称重末重。

(6)数据分析：计算每组总平均初重、总平均末重(kg)、总平均只增重(kg)。

(7)试验组肉鸡在试验开始当天在饮水塔中按比例每1L饮水添加1ml彭氏变形菌PZ-1发酵所产的胞外多糖(每ml含纯多糖10mg)免疫增强剂，连续添加15天，空白对照组不添加任何其他产品，按原正常饮水。

2)试验地点：龙岩市某有限公司肉鸡定点养殖场。

3)试验结果：

(1)试验统计：试验统计数据总汇见表3。

表3

数据统计项目	试验组(细菌胞外多糖组)	对照组
			试验期初数(只)	8500	12000
试验期末数(只)	8247	11398
			试验天数(d)	47	47
总平均初重(kg)	0.03	0.03
			总平均末重(kg)	2.23	2.13
总平均只增重(kg)	2.20	2.10
			试验组比对照组多增重(g/只)	100

注：刚出生的幼仔鸡随机分组视为一致。

(2)试验动物情况

试验期内，试验组和对照组都未出现重大疾病及死亡，试验组死亡了253只，死亡率为2.98％，对照组死亡了602只，死亡率为5.02％，试喂期间，福建龙岩的天气处在多风雨期，外观观察试验组的活泼程度较好，健康状况较佳。

4)试验结果分析：

试验结果分析可知：

(1)在47天的试验期内，试验组(胞外多糖组)肉鸡比空白对照组每只平均多增重100g，差异显著。按市价肉鸡6.9元/kg测算，扣除胞外多糖免疫增强剂的成本(多糖耗用0.6ml/只，成本0.15元/只)，本次试验肉鸡养殖户可增加收入4500元(不计对照组死亡的情况下)，经济效益明显。

(2)试验结果证明彭氏变形菌PZ-1发酵所产的胞外多糖具有较为明显的免疫增强作用，提高了肉鸡的抗应激等生产性能指标。

实施例8：一种胞外多糖菌株所产胞外多糖的母猪免疫增强试验。

在福州长乐市某农畜综合开发有限公司猪场，在母猪猪瘟疫苗免疫时试验组另增加进行注射胞外多糖，30天后对试验组和其他母猪的血清检测比较，发现注射胞外多糖试验猪达到较高的抗体水平，其猪瘟抗体log₂10，其他未注射胞外多糖的为log₂3。

综上所述，结合以上各实施例可知，本发明克服了现有养殖动物饲养中长期大量使用抗生素药物作为饲料药物添加剂，养殖动物长期饲用常规含有药物的饲料可能在肉食品中造成抗生素残留，并通过食物链传递影响人类的健康等问题，本发明诱变筛选获得一种高产胞外多糖菌株，经菌株鉴定、菌株发酵生产胞外多糖生产工艺分析、菌株发酵生产胞外多糖含量的测定、菌株发酵产物胞外多糖经口急性毒性试验、菌株发酵产物胞外多糖的抑瘤试验、菌株发酵产物胞外多糖制成兽药注射剂进行乳猪注射试验、菌株发酵产物胞外多糖制成饲料添加剂进行鸡饮水试验和菌株发酵产物胞外多糖制成免疫增强佐剂进行母猪的免疫增强试验等，证明所获得的菌株具有变形杆菌属的特性，能高产胞外多糖，具有明显的免疫增强和提高动物抗病能力的作用，可开发为兽药注射液、兽药粉剂、饲料添加剂、免疫佐剂及保健食品功能性原料。

序列表

彭氏变形杆菌的部分16Sr RNA的部分核苷酸序列如下：

CAACTTTGGACATGTATTACGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGATTTGATGCCGTTGCTCTCGTCGCTGCGCCGCCCCAGCAGTTGCATCCCTAAGCAGATGCCCAGCACCGGTTGGGTACAGGCTTTGATGAGATCAAACAGCTCGCGCTCACGTACCTGATCCATCGCCGCTTGCGCAGTGCCAACGCCGGGTAAAAACAGTTTATCGGCCAGCAACACGACGTCCGGGTCACGGCTGACTTTGGGTTCATAACCGTGACGCGCAATGGCAGACTTCACCGAGTTCAGGTTGGCGCAGCCGGTATCAAGGATCACCACGTTCATTACAGCACTCCTTTCGACGAGAGCAACGGCATCAAATCGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTTGGCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAATGGCGAATGGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACATAACCCTGATAAATGCTTCATAATTTGAAAAGGAGAGTATGAGTATTCACATTTCCGTGTCGCCTATCCCTTTTTGCGCATTTGCTCTGTTTTGCTCACCAGAACGCTGTGAAGTAAGATGCTGAGATCAGTGGGTGCACGAGGGTTACTCGACTGAATCTCACAGCGTAGATCTGAAAGTTCGCCCGAGACGTTCAATGATGAAACTTTAGGTTGCTTGGGGCGGATATCCGATGACGGCAGCACCTGTGCCGTACCATTCTCCAAGACCTGGGTGTGAATA。

Claims (8)

1.一种胞外多糖菌株，为彭氏变形菌PZ-1，所述彭氏变形菌PZ-1已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.3224，保藏日期：2009年8月12日。

2.一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的一种胞外多糖菌株，包括以下步骤：

1)配制培养基：按质量百分比，培养基的配方如下：蛋白胨为0.5％～2％，KH₂PO₄为0.2％～0.8％，MgSO₄为0.01％～0.05％，MnSO₄为0.01％～0.05％，FeSO₄.·7H₂O为0.001％～0.01％，配好后用NaOH溶液调pH至7.0～7.6，得培养基；

2)将培养基接种彭式变形菌PZ-1后发酵48～72h，得发酵培养液；

3)将发酵培养液冷却后离心去彭式变形菌PZ-1菌体，取上清液；

4)将离心去菌体后的上清液用工业酒精沉淀，静置，得沉淀液；

5)将沉淀液离心，取沉淀物，得粗多糖；

6)将粗多糖进行纯化，即得胞外多糖。

3.如权利要求2所述的一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，在步骤2)中，所述发酵培养的温度为25～40℃，搅拌速度为150～450r/min。

4.如权利要求2所述的一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，在步骤3)中，所述离心的离心率为3500～6000rpm，离心的时间为10～30min。

5.如权利要求2所述的一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，在步骤4)中，所述工业酒精的质量百分比浓度为70％～95％，按质量比，上清液∶工业酒精为1∶2～5。

6.如权利要求2所述的一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，在步骤4)中，所述静置的时间为2～5天。

7.如权利要求2所述的一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，在步骤5)中，所述离心的离心率为7000～25000rpm，离心的时间为10～30min。

8.如权利要求2所述的一种胞外多糖的发酵生产方法，其特征在于，在步骤6)中，所述纯化采用膜过滤方法对粗多糖进行纯化。

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