CN1104504C - 一种海洋细菌胞外多糖的生产工艺 - Google Patents
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Abstract
涉及一种利用微生物发酵制备的多糖，生产工艺步骤为分离获得土壤杆菌1202菌株；制作种子培养液；发酵；提取，即得多糖产品。由于筛选了先进的配方与工艺，因此所获得的1202多糖具有良好的增强机体的免疫功能，可作为单一有效活性组分用于制备增强免疫剂药物等。产量高、成本低，含多糖在92%以上。
Description
本发明涉及一种利用微生物发酵制备的多糖。
某些微生物多糖具有较强的免疫调节作用，如真菌中的香菇多糖、茯苓多糖、灵芝多糖、裂褶菌多糖，细菌中脂多糖、黄原胶多糖等。CN1003454号专利公开一种裂褶菌的培养工艺及其利用，它将从腐木上经组织分离的裂褶菌南大843菌株经纯化后，用黄豆粉和葡萄糖等培养基质进行发酵培养，得到含菌丝体及其多糖较高的裂褶菌发酵液，并从发酵液中提取抗肿瘤、促升白、抗菌素增效作用、抗炎的裂褶菌多糖等。CN1003305号专利公开一种生产黄单胞多糖的培养基，它在由Xanthomonas campestris NK-01菌株直接利用淀粉原料发酵时，不同的氮源和无机盐类对多糖的产量影响很大，用豆饼粉和鱼粉作为复合氮源，用CaCO3为无机盐配制的淀粉培养基进行发酵，多糖产量达22.4～26g/L。CN1034086号专利公开一种杂多糖S-657，它是由野油菜黄单胞菌的一个新菌株ATCC53159经发酵而制备的，主要由碳水化合物、约12％蛋白质和7％酰基(以0-乙酰基计算)组成。碳水化合物含有19％葡萄糖醛酸以及中性糖鼠李糖和葡萄糖，两者的摩尔比约为2∶1。
本发明旨在提供一种海洋细菌胞外多糖的生产工艺。
该菌株是从海洋植物浒苔分离获得的土壤杆菌1202菌株(Agrobacterium sp.1202)CCTCC No.M200019。土壤杆菌1202菌株(Agrobacterium sp.1202)已于2000年5月18日保藏在中国典型培养物保藏中心，其简称为CCTCC，保藏编号为CCTCC No.M 200019。土壤杆菌的形态、生理生化等鉴定特征如下(参见J.G霍尔特主编，刘复今等编译，简明第八版伯杰细菌鉴定手册，山东大学出版社，1988年，94～95)。
细胞杆状，0.8×1.5～3.0μm，通过1～4根周生鞭毛运动。如果只有一根鞭毛，则侧生较极生更为常见，没有芽孢，革兰氏阴性，普遍具有纤毛。在含有碳水化合物的培养基上生长通常伴随大量的胞外多糖粘液。菌落无色素，通常平滑，随着培养时间的延长，倾向于产生条纹，但许多菌株产生粗糙菌落。
化能有机营养：呼吸代谢，以分子氧作为最终电子受体。根癌土壤杆菌与放射形土壤杆菌都产生3-酮基乳酸。在几周内慢慢液化明胶或完全不液化。不水解酪蛋白。利用多种简单碳水化合物、有机酸和氨基酸作为碳源，但不利用纤维素、淀粉、琼脂或几丁质。释放有机酸和(或)CO2到培养基中，从而表明了碳水化合物的利用，所释放的酸和CO2，通常在含有少量有机氮化合物的合成培养基表面产生酸反应，但在含有蛋白胨或富含氨基酸的其它物质的培养基中，由于释放碱性物质反应可能被遮盖。在亚硫酸铋琼脂培养基上，一般产生硫化氢。在肉膏或酵母膏蛋白胨琼脂上迅速生长，在24～36小时内，除悬钩于土壤杆菌(A.rubi)外，一般形成浑浊并具有膜。某些种以铵盐、硝酸盐和某些氨基酸作为氨源，其它种需要添加生长因子的氨基酸。正常情况下，氧化酶阳性。
好氧，但在植物组织内，氧压降低的情况下也能生长。最适温度25～30℃，pH范围4.3～12.0，最适pH范围6.0～9.0。
除放射形土壤杆菌外，这个属的菌株当寄生于植物细胞间时，均能在不同植物上刺激茎部增生，在那里，细菌以胞外寄生状态存在。细菌通过原有的病斑或伤口进入寄主组织，菌株缺乏直接侵入寄生植物组织的能力。寄主范围的亲缘关系并没有严格的限制。根据常规生化试验鉴定菌株，组织穿刺接种是很必要的。
DNA的G+C含量范围在59.6～62.8克分子之间，(熔解温度)。
模式种：根癌土壤杆菌[Agrobacterium tumefaciens(Smith and Townsend)Conn]。
土壤杆菌1202菌株最适生长的NaCl浓度为2％～4％，产胞外多糖的NaCl浓度为0.1％～0.3％，具有较高的海洋性。
海洋细菌胞外多糖(以下简称1202多糖)生产工艺步骤为：
1)分离散得生产菌株：土壤杆菌1202菌株可从海洋植物浒苔分离获得。
2)制作种子培养液：将菌株斜面接种子牛肉膏蛋白胨液体培养基中，pH：6.8～7.4，在温度24～28℃、搅拌速度180rpm、通风比1∶1培养48～72小时，获种子培养液。
3)发酵生产：种子培养液以5％～10％的接种量接种于多糖发酵培养基中，培养基组成中各成分的重量比为：蔗糖60～120g，酵母膏2.0～4.5g，玉米浆5～25g，CaCO3 1.0～2.5g，KH2PO4 0.5～1.0g，MgSO4 0.5～1.0g，FeSO4 0.08～0.15g，NaCl 1.0～3.0g，pH7.0～7.4，自来水定容至1000mL。在温度24～28℃、搅拌速度240rpm、通风比1∶0.3～0.5发酵5～7天。
4)提取：将发酵液经离心去除菌体，上清液用2～3倍的乙醇沉淀，沉淀物调节成0.2％～0.4％的多糖水溶液，以多糖液∶氯仿∶正丁醇＝30∶10∶1(v/v)沉淀去除蛋白，离心获得上清液，用2～3倍乙醇沉淀，沉淀物经等量的70％乙醇洗涤二遍，在65～70℃烘干，再粉碎后得1202多糖产品。
用上述条件发酵条件生产的1202多糖一般含多糖92％以上，该多糖为水溶性的酸性胞外多糖，由葡萄糖和葡萄糖醛酸组成，两者的含量比例为6∶1。
1202多糖的用途是，它作为单一有效活性组分用于制备增强免疫剂药物等。
由于充分分析了该菌株的海洋性，又筛选了先进的配方与工艺，因此本发明所得的1202多糖，具有良好的增强机体的免疫功能，采用口服方式，在10～100mg/Kg的服用剂量时，能显著地增强机体的淋巴细胞增殖能力、提高抗体生成积数、促进鸡红细胞吞噬能力、提高迟发型超敏反应能力以及NK细胞产量。具有细胞免疫、体液免疫和非特异性的免疫增强活性。1202多糖的LD50(小鼠口服)≥15g/Kg，属无毒级产品，可作为单一有效活性组分用于制备增强免疫作用的药物、保健品或直接作为食品添加剂的原料，可制成冲剂、片剂、胶囊或液体饮品。其次本工艺的产量高，成本低，含多糖在92％以上。
以下给出1202多糖的免疫增强及抗肿瘤活性实验
1)1202多糖的免疫增强活性测定
Bal B/C小鼠雌雄各半分组，每组10只，腹腔注射不同浓度的1202多糖。连续注射多糖8天后，以足跖肿胀法测定小鼠迟发型超敏反应；血凝法测定血清溶血素抗体；称重法测定小鼠免疫器官的重量指数；鸡红细胞吞噬实验测定吞噬能力；乳酸脱氢酶测定法测定NK细胞活性；MTT法测定脾淋巴细胞的转化能力，结果见表1，2。
表1 1202多糖免疫增强活性测定结果
剂量 吞噬 NK活性 脾细胞增殖给药方式
(mg/kg*d) (％) (％) (OD差值)腹腔注射 对照 57.83±6.21 25.89 0.024±0.015
10 75.00±8.20* 21.06 0.019±0.007
30 87.50±5.96** 41.96* 0.046±0.024
60 87.50+4.32** 22.14 0.026+0.018口服 对照 57.83±6.21 33.56 0.024±0.015
10 75.00±8.20* 41.96 0.032±0.010
50 79.67±5.47* 56.64* 0.030±0.010
100 83.00±5.40** 59.44* 0.035±0.014*
*P≤0.05；**≤0.01
表2 1202多糖免疫增强活性测定结果
剂量 DTH肿胀厚度 抗体积数 脾指数
给药方式
(mg/kg*d) (mm) (％) (mg/10g)
腹腔注射 对照 0.55±0.16 70.17±5.72 62.12±10.48
10 0.77±0.08* 86.33±7.51* 86.20±10.14**
50 0.56+4.32 77.83±8.25 120.57±31.31**
*P≤0.05；**≤0.01
2)1202多糖对S-180实体瘤的抑制活性
Bal B/C小鼠雌雄各半分组，每组10只，以105S-180瘤细胞/mL荷瘤小鼠后，次日腹腔注射不同浓度的1202多糖。连续给药10天后，分别称重测定实验组和对照组的瘤重，以对照组瘤重-实验组瘤重/对照组平均瘤重计算抑瘤率。结果见表3。
表3 1202多糖对S-180实体瘤的抑制作用
给药方式 剂量(mg/kg*d) 平均瘤重(g) 抑瘤率(100％)
腹腔注射 对照 2.55±0.63
50 1.71±0.67 31.54
100 1.68+0.42 34.23
实施例1：
将土壤杆菌1202菌株斜面菌种接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中(pH：6.8～6.9)，温度24～25℃、搅拌速度180rpm、通风比1∶1培养48～50小时，得种子培养液。种子培养液以5％～6％的接种量接种于多糖发酵培养基中(培养基组成：蔗糖60g，酵母膏4.5g，玉米浆25g，CaCO3 1.0g，KH2PO4 1.0g，MgSO4 0.5g，FeSO4 0.15g，NaCl 2.0g，pH7.0，自来水定容至1000mL。)24～25℃、搅拌速度240rpm、通风比1∶0.3～0.5，发酵7天。发酵液经3000rpm离心30min去除菌体，上清液用2.5倍的乙醇沉淀，沉淀物调节成0.3％的多糖水溶液，以多糖液∶氯仿∶正丁醇＝30∶10∶1(v/v)沉淀去除蛋白，离心获得的上清液用3倍乙醇沉淀，沉淀物经70％乙醇洗涤二遍，70℃烘干，粉碎后得含多糖92％以上的多糖产品。
实施例2：
土壤杆菌1202菌株斜面接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中(pH7.2)，温度26℃、搅拌速度180rpm、通风比1∶1培养72小时，得种子培养液。种子培养液以8％的接种量接种于多糖发酵培养基中(培养基组成：蔗糖100g，酵母膏2.0g，玉米浆5g，CaCO3 2.5g，KH2PO40.8g，MgSO4 0.8g，FeSO4 0.5g，NaCl 1.0g，pH7.2，自来水定容至1000mL)28℃、搅拌速度240rpm、通风比1∶0.3～0.4发酵6天。发酵液经2800rpm离心35min去除菌体，上清液用3倍的乙醇沉淀，沉淀物调节成0.2％的多糖水溶液，以多糖液∶氯仿∶正丁醇＝30∶10∶1(v/v)沉淀去除蛋白，离心获得的上清液用2倍乙醇沉淀，沉淀物经等量的70％乙醇洗洗二遍，65℃烘干，粉碎得含多糖92％以上的多糖产品。
实施例3：
土壤杆菌1202菌株斜面接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中(pH7.4)，28℃、搅拌速度180rpm、通风比1∶1培养56小时，得种子培养液。种子培养液以10％的接种量接种于多糖发酵培养基中(培养基组成：蔗糖120g，酵母膏3.5g，玉米浆15g，CaCO31.5g，KH2PO40.5g，MgSO4 1.0g，FeSO4 0.08g，NaCl 3.0g，pH7.4，自来水定容至1000mL)26℃、搅拌速度240rpm、通风比1∶0.4～0.5发酵5天。发酵液经3500rpm离心28min去除菌体，上清液用2倍的乙醇沉淀，沉淀物调节成0.4％的多糖水溶液，以多糖液∶氯仿∶正丁醇＝30∶10∶1(v/v)沉淀去除蛋白，离心获得的上清液用2.5倍乙醇沉淀，沉淀物经70％的乙醇洗涤二遍，68℃烘干，粉碎后得含多糖92％以上的多糖产品。
实施例4：1202多糖制备免疫增强剂药物的实例
1)冲剂：取1202多糖(上述工艺制成的原料)10％、乳糖61.5％、蔗糖25％、柠檬酸1.5％、甜味素2％。各原料预先粉碎，过100目筛网后，在混合器中混合均匀。以粉料∶70％食用酒精＝1∶2.5(W/V)，边搅拌边缓缓加入食用酒精，使混合均匀。在造粒机上过16～20目筛网造粒。取湿粒摊于烘盘上于65℃烘干至含水量＜6％。整粒(取烘干的颗粒过20目筛网，取筛下物过80目筛网，得筛上物)，分装于密闭的食用包装容器中，即为1202多糖冲剂成品。
2)片剂：取1202多糖45.5％、乳糖50.0％、柠檬酸1.5％、甜味素3％。各原料预先粉碎，过100目筛网后，在混合器中混合均匀。以粉料∶70％食用酒精＝1∶2.5(W/V)，边搅拌边缓缓加入食用酒精，使混合均匀。在造粒机上过16～20目筛网造粒。取湿粒摊于烘盘上于65℃烘干至含水量＜4％。整粒(取烘干的颗粒过20目筛网，取筛下物过80目筛网，得筛上物)，加入1％的硬脂酸镁，混合均匀，于压片机上压片，分装于密闭的食用包装容器中，即为1202多糖冲剂成品。
3)胶囊：取1202多糖45.5％、乳糖50.0％、柠檬酸1.5％、甜味素3％。各原料预先粉碎，过100目筛网后，在混合器中混合均匀。以粉料∶70％食用酒精＝1∶2.5(W/V)，边搅拌边缓缓加入食用酒精，使混合均匀。在造粒机上过16～20目筛网造粒。取湿粒摊于烘盘上于65℃烘干至含水量＜4％。整粒(取烘干的颗粒过20目筛网，取筛下物过80目筛网，得筛上物)，填充胶囊，胶囊分装于密闭的食用包装容器中或压膜于铝塑片中，即为1202多糖冲剂成品。
4)液体饮品(饮料或口服液)：以1202多糖∶蔗糖∶柠檬酸∶水＝0.5∶5∶0.15∶94.35(W/W)称取原料。1202多糖预先用少量热水充分溶解后，分别加入蔗糖、柠檬酸、水。充分混合溶解后，定容。分装于密闭的耐高温的食用包装容器中，121℃灭菌20分钟。即为1202多糖液体饮品。
上述各种制品中，还可根据口感需要，加入适量的食用香料(如水果香精等)，制成各种水果风味的冲剂、片剂或液体饮品。
Claims (1)
1、一种海洋细菌胞外多糖的生产工艺，其特征在于所涉及的微生物为土壤杆菌1202菌株(Agrobacterium sp.1202)，保藏单位简称为CCTCC，保藏编号为CCTCCNO.M200019；海洋细菌胞外多糖的生产工艺步骤为1)分离获得生产菌株-土壤杆菌1202菌株；2)制作种子培养液：将菌株斜面接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基中，pH：6.8～7.4，在温度24～28℃、搅拌速度180rpm、通风比1∶1培养48～72小时，获种子培养液；3)发酵生产：种子培养液以5％～10％(V/V)的接种量接种于多糖发酵培养基中，培养基组成中各成分的重量比为：蔗糖60～120g，酵母膏2.0～4.5g，玉米浆5～25g，CaCO31.0～2.5g，KH2PO40.5～1.0g，MgSO40.5～1.0g，FeSO40.08～0.15g，NaCl1.0～3.0g，pH7.0～7.4，自来水定容至1000mL，在温度24～28℃、搅拌速度240rpm、通风比1∶0.3～0.5发酵5～7天；4)提取：将发酵液经离心去除菌体，上清液用2～3倍(V/V)的乙醇沉淀，沉淀物调节成0.2％～0.4％(V/V)的多糖水溶液，以多糖液∶氯仿∶正丁醇＝30∶10∶1(V/V)沉淀去除蛋白，离心获得上清液，用2～3倍(V/V)乙醇沉淀，沉淀物经等量的70％乙醇洗涤2遍，在65～70℃烘干，再粉碎后得多糖产品。
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