CN101481716B - 一种提取细菌胞外聚合层中多糖的方法 - Google Patents
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Abstract
一种提取细菌胞外聚合层中多糖的方法，属于生物冶金技术领域，该方法按以下步骤进行：(1)将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，调节pH值，加热振荡培养1～24h，菌液电位为400～700mV时，获得培养菌液；(2)将培养菌液离心5～30min，收集沉淀，加入EDTA溶液，离心5～30min；获得的上清液用微孔滤膜过滤，获得细菌胞外聚合层中多糖粗提液。本发明的方法排除了培养基、缓冲液和菌体的干扰；具有使用试剂简单、操作简便、流程简易等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物冶金技术领域，特别涉及一种提取细菌胞外聚合层中多糖的方法。
背景技术
目前，细菌胞外聚合层提取方法有物理提取法和化学提取法两类。物理提取法主要是利用各种外力来增强细菌胞外聚合层中各成分在溶液中的溶解度，常用的有超声波法、离心法、热处理提取法等。但是由于细菌胞外聚合层与细胞壁结合得很紧密，因而物理提取法的提取含量很低。化学提取法主要是利用试剂使细菌胞外聚合层的大分子成为水溶性成分而被提取出来，常用的有NaOH提取法、戊二醛提取法、阳离子交换树脂法、H2SO4提取法等。但其中NaOH提取法和戊二醛提取法虽可以提高产率，却会造成较多细胞死亡，使胞内物质外流导致提取物有杂质；阳离子交换树脂法费用较高；而H2SO4提取法提取含量较低。此外，上述方法对氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌的胞外聚合层的提取效果也不明显。
发明内容
针对以上技术问题，本发明提供一种提取细胞外聚合层中多糖的方法。
本发明包括以下步骤：
1、细菌培养：在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的5～20％，采用硫酸调节pH值为1.0～3.0，在控温30～60℃和转速100～240rpm的条件下，培养1～24h，至菌液电位为400～700mV时，获得培养菌液。
2、提取方法：将培养菌液置于离心管中，在转数为1500～12500rpm的条件下离心5～30min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为1～20％的EDTA(乙二胺四乙酸二钠)溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶0.2～5，摇匀后在转数为1500～12500rpm的条件下离心5～30min；获得的上清液用孔径为0.01～10.00μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
提取的多糖的含量测定：采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定。取多糖粗提液0.25～2.00mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀后1～2min显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，说明提取物是多糖类物质，并可根据测得的吸光值计算多糖含量。
本发明中的细菌为氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌其中的一种或者几种的混合菌，当为混合菌时混合比例为任意比例。
本发明中采用的培养基为Leathen、9K、Wakesman、ONM或Clomer培养基中任意一种均可。
本发明中步骤(1)获得的培养菌液为细菌生长进入对数期后的培养菌液。
本发明的提取方法选用物理与化学相结合的提取方式，由离心分离、提取剂浸提和微孔滤膜过滤协同作用，排除了培养基、缓冲液和菌体的干扰；提取出的多糖可用于细菌胞外聚合层糖类成分的鉴定、细菌浸矿过程中代谢物的测定和细菌浸矿机理的研究等。本发明提取方法具有使用试剂简单、操作简便、流程简易等特点。
附图说明
图1是本发明的细菌胞外聚合层中多糖的提取流程图。
具体实施方式
本发明实施例中采用的细菌为氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌的混合菌，可购于国家菌种保藏中心。
本发明实施例中采用Leathen、9K、Wakesman、ONM或Clomer培养基中的一种。
本发明实施例中采用的恒温振荡培养箱为HZQ-QX型。
本发明实施例中采用的微孔滤膜为市购水溶性微孔滤膜。
本发明实施例中采用的苯酚、浓硫酸和EDTA为分析纯试剂，分别与去离子水配制成溶液。
本发明实施例中采用的离心机为台式高速TG16-WS型。
本发明实施例中测量pH值和电位的设备为PHS-2F型。
本发明实施例中采用的紫外可见分光光度计为TU-1901型。
本发明实施例中调节pH值的硫酸为硫酸与同体积水混合制备成的硫酸溶液。
实施例1
在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的10％，采用体积比为1∶1的硫酸溶液调节pH值为1.0～3.0，在控温44℃和转速190rpm的条件下，培养18h，至菌液电位为600mV时，获得培养菌液。
将培养菌液置于离心管中，在转数为12500rpm的条件下常温离心10min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为3％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶0.2，摇匀后在转数为12500rpm的条件下常温离心15min；获得的上清液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定多糖：取多糖粗提液1.0mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀1～2min后显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，根据测得的吸光值计算出细菌菌液中胞外聚合层中多糖含量为0.194mg/mL。
实施例2
在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的10％，采用体积比为1∶1的硫酸溶液调节pH值为1.0～3.0，在控温44℃和转速190rpm的条件下，培养18h；然后加入浓度为3N的三价砷离子溶液，加入量按三价砷离子溶液体积占菌液体积的0.125％，继续培养24h，至菌液电位为680mV时，获得培养菌液。
将培养菌液置于离心管中，在转数为12500rpm的条件下常温离心10min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为3％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶0.5，摇匀后在转数为12500rpm的条件下常温离心15min；获得的上清液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定多糖：取多糖粗提液1.0mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀1～2min后显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，根据测得的吸光值计算出细菌菌液中胞外聚合层中多糖含量为0.182mg/mL。
实施例3
在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的20％，采用体积比为1∶1的硫酸溶液调节pH值为1.0～3.0，在控温44℃和转速190rpm的条件下，培养12h；然后加入浓度为3N的三价砷离子溶液，加入量按三价砷离子溶液体积占菌液体积的0.25％，继续培养24h，至菌液电位为650mV时，获得培养菌液。
将培养菌液置于离心管中，在转数为12500rpm的条件下常温离心5min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为3％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶1，摇匀后在转数为12500rpm的条件下常温离心15min；获得的上清液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定多糖：取多糖粗提液1.0mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀1～2min后显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，根据测得的吸光值计算出细菌菌液中胞外聚合层中多糖含量为0.192mg/mL。
实施例4
在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的5％，采用体积比为1∶1的硫酸溶液调节pH值为1.0～3.0，在控温44℃和转速170rpm的条件下，培养24h；然后加入浓度为3N的三价砷离子溶液，加入量按三价砷离子溶液体积占菌液体积的0.375％，继续培养24h，至菌液电位为630mV时，获得培养菌液。
将培养菌液置于离心管中，在转数为10000rpm的条件下常温离心15min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为3％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶2，摇匀后在转数为10000rpm的条件下常温离心20min；获得的上清液用孔径为0.45μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定多糖：取多糖粗提液1.0mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀1～2min后显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，根据测得的吸光值计算出细菌菌液中胞外聚合层中多糖含量为0.161mg/mL。
实施例5
在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的5％，采用体积比为1∶1的硫酸溶液调节pH值为1.0～3.0，在控温30℃和转速100rpm的条件下，培养24h，至菌液电位为400mV时，获得培养菌液。
将培养菌液置于离心管中，在转数为1500rpm的条件下常温离心30min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为20％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶4，摇匀后在转数为12500rpm的条件下常温离心5min；获得的上清液用孔径为10.00μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定多糖：取多糖粗提液0.25mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀1～2min后显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，根据测得的吸光值计算出细菌菌液中胞外聚合层中多糖含量为0.096mg/mL。
实施例6
在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的20％，采用体积比为1∶1的硫酸溶液调节pH值为1.0～3.0，在控温60℃和转速240rpm的条件下，培养2h，至菌液电位为500mV时，获得培养菌液。
将培养菌液置于离心管中，在转数为12500rpm的条件下常温离心5min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为1％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶5，摇匀后在转数为1500rpm的条件下常温离心30min；获得的上清液用孔径为0.01μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液。
采用苯酚-硫酸法，用紫外可见分光光度计测定多糖：取多糖粗提液2.00mL，先加入浓度为98wt％的浓硫酸5.0mL，再加入5％苯酚溶液1.0mL，混合均匀1～2min后显色稳定，测得在波长488～492nm处有最大吸收峰，根据测得的吸光值计算出细菌菌液中胞外聚合层中多糖含量为0.113mg/mL。
Claims (1)
1.一种提取细菌胞外聚合层中多糖的方法，其特征在于按以下步骤进行：(1)在恒温振荡培养箱中，将细菌接种到培养基中并用摇瓶培养，接种量按菌种液体积占菌种液和培养基总体积的5～20％，调节pH值为1.0～3.0，在控温30～60℃和转速100～240rpm的条件下，培养1～24h，至菌液电位为400～700mV时，获得培养菌液；(2)将培养菌液置于离心管中，在转数为1500～12500rpm的条件下离心5～30min，收集沉淀，在沉淀中加入重量浓度为1～20％的EDTA溶液，加入量按培养菌液与EDTA溶液的体积比为培养菌液∶EDTA＝1∶(0.2～5)，摇匀后在转数为1500～12500rpm的条件下离心5～30min；获得的上清液用孔径为0.01～10.00μm的微孔滤膜过滤，过滤后获得的滤液为细菌胞外聚合层中多糖粗提液；所述的细菌为氧化亚铁硫杆菌、氧化硫硫杆菌和氧化亚铁微螺菌其中的一种或者几种的混合菌，当为混合菌时混合比例为任意比例。
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