CN104450655A - 一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法及其产品 - Google Patents

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CN104450655A CN201410751836.5A CN201410751836A CN104450655A CN 104450655 A CN104450655 A CN 104450655A CN 201410751836 A CN201410751836 A CN 201410751836A CN 104450655 A CN104450655 A CN 104450655A
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Abstract

本发明公开了一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法及其产品，其中所述制备方法包括以下步骤：(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中以常规条件震荡发酵培养，将所得发酵液离心取上清液；(2)将所得上清液与乙醇混合，离心收集沉淀物；(3)将所得沉淀物用水或PBS溶解，离心取上清，冻干即得。该制备方法在提高凝乳酶比活力以及凝乳酶回收率的前提下，大幅简化了凝乳酶的制备工艺步骤，有效降低了凝乳酶的生产成本。利用本发明所述制备方法所得凝乳酶具有较高的比活力，完全可以满足工业化生产凝乳酶的需求。

Description

一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法及其产品
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法及其产品。
背景技术
凝乳酶是干酪生产中的关键性酶。它对干酪的质构形成及特有风味的形成有非常重要的作用。国际市场上凝乳酶中动物来源的约占70％，微生物的占30％，随着干酪工业的不断发展，动物来源的凝乳酶已远不能满足生产需要，各国研究者不断地寻找新的来源。目前发现微生物可产生一定活力的凝乳酶主要是放线菌、细菌和霉菌等，包括放线菌中链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属、根霉、总状毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、粟疫菌、寄生内座壳菌、易脆毛霉以及其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株等。
将筛选出的高产凝乳酶菌株通过优化培养条件后，确定较佳的凝乳酶提取的方法和条件，成为当今国内外凝乳酶研究的一个重要的方向。有学者利用硫酸铵分部盐析法从米黑毛霉半固体培养物的浸提液中提取了凝乳酶，后经SephadexG-25、DEAE-Sephadex，CM-纤维柱层析，酶活回收率为19.5％，比活力3080U/mg，提高8.5倍。也有学者使用1％氯化钠溶液提取微小毛霉发酵液中的凝乳酶，酶活为5570U/mL。有学者使用乙醇按不同比例分步提取微小毛霉发酵液中的凝乳酶，后经CM-纤维柱、DEAE-Sephadex、Sepharose2B柱层析，凝乳酶比活提高至3429U/mg，蛋白回收率17.9％。有学者将提取微小毛霉发酵液中的凝乳酶，经AKTAprocess蛋白质层析仪，用S300和G100的填料进行酶蛋白的分离纯化，凝乳酶活为52786U/mL，酶活提高约10倍。有学者以总状毛霉R132的发酵液为研究对象，对其超滤后进行乙醇分步提取，最终获得凝乳酶活力为76U/mg。综上，目前国内对微生物源凝乳酶的提取主要通过硫酸铵分步法盐析、氯化钠盐析法以及乙醇分步提取法等，且提取的凝乳酶多集中于对毛霉相关研究，最终提取的粗酶比活力在76-3429U/mg范围内，提取纯化过程需要通过层析柱处理，过程较为复杂且增大了凝乳酶的损失率。
目前我国对凝乳酶的研究较浅，国内生产干酪的凝乳酶主要依靠国外进口。只有少数科研单位对产凝乳酶的菌种进行了较系统的研究。因此，筛选出高产凝乳酶的菌种，并优化确定其发酵液凝乳酶提取工艺，对于发展我国干酪用凝乳酶有至关重要的作用。
中国专利申请(CN 103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种，Paenibacillusdamxungensissp.nov.，并将其中的模式菌株BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333，该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。中国专利申请(CN 103865842A)公开了类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株培养物的上清液具有凝乳酶活性，但尚未得到提纯的凝乳酶。
发明内容
因此，本发明要解决的技术问题是提供一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法及其产品。该制备方法在提高凝乳酶比活力以及凝乳酶回收率的前提下，大幅简化了凝乳酶的制备工艺步骤，有效降低了凝乳酶的生产成本。利用本发明所述制备方法所得凝乳酶杂质少，酶的比活力高，可以满足工业化生产凝乳酶的需求。
本发明人发现，由于类芽孢杆菌与现有产凝乳酶的微生物菌种发酵培养基和发酵产物不同，很难借鉴现有微生物菌产凝乳酶的提纯方法。除一些残留的发酵培养基和菌体需分离外，类芽孢杆菌在发酵培养过程中还会产生非凝乳酶的其他发酵物质如大量的胞外多糖类物质，造成所发酵得培养物非常粘稠，难以将其中的凝乳酶纯化分离出来；而且如背景技术中所述的现有微生物菌产凝乳酶的提纯、制备工艺复杂，和/或所得凝乳酶回收率非常低，酶的比活力不高，难以满足大规模工业化生产的需要。为了降低类芽孢杆菌所得产物中糖类物质的含量，提高凝乳酶的回收率以及所得凝乳酶的比活力，发明人发现不能根据常规思路，即仅从发酵液的提纯方法进行筛选改良，还需将发酵条件和后续发酵液的提纯工艺结合一并考虑。具体来说本发明对类芽孢杆菌发酵培养以及凝乳酶纯化过程中的一系列技术参数进行了分析和筛选：包括优化类芽孢杆菌的发酵条件；同时对于所得发酵液中凝乳酶的分离纯化选用了环保、简单易操作的乙醇醇沉法和离心法制备，进一步对于乙醇与所得上清液的体积比范围，乙醇沉淀的温度和静置的时间，以及所得产物的离心速度和时间等技术参数进行了精心筛选和优化，终于取得了凝乳酶回收率高而且比活力高的技术效果。
因此，为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之一是：一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，以常规条件震荡发酵培养48小时，将所得发酵液离心取上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为3:1～5:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～6℃，静置的时间为1～5小时，离心收集沉淀物；
(3)将步骤(2)所得沉淀物用水或PBS溶解，离心取上清，冻干即得。
其中步骤(1)为将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，以常规条件震荡发酵培养48小时，将所得发酵液离心取上清液。其中所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)较佳地为本领域常规的产胞外多糖的类芽孢杆菌，更佳地为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCCNo.8333菌株。其中所述常规条件请参见公开号为CN 103865842A的中国专利申请，所述常规条件较佳地为：发酵培养的温度是30℃，震荡的速度为300rpm。
本发明人发现，虽然类芽孢杆菌培养物中胞外多糖含量较高造成所得培养物较为粘稠，然而通过适当延长类芽孢杆菌的发酵培养时间，将现有常规发酵时间18～30小时延长至48小时左右，能使培养基中的胞外多糖物质被类芽孢杆菌代谢，使培养物中胞外多糖类物质含量显著降低，同时结合后续发酵液的提纯工艺，能够进一步降低所得凝乳酶中的杂质，提高类芽孢杆菌凝乳酶的回收率和该凝乳酶的比活力。
其中步骤(1)所述培养类芽孢杆菌的培养基较佳地为麸皮培养基，所述麸皮培养基的配方请参见公开号为CN 103865842A的中国专利申请，所述麸皮的配方较佳地为：2％～5％，余量为水。所述小麦麸皮培养基的主要成分较佳地为：蛋白质13.9～18.6％，脂肪3.3～8.2％，总碳水化合物61.9～74.62％，水分4.8～18.02％，灰分3.38～6.50％，所述百分比为质量百分比；换言之，所述成分在上述范围的小麦麸皮培养基均可用于本发明。
其中步骤(1)所述发酵培养较佳地是在发酵容器中进行的，所述发酵容器为本领域常规的发酵容器，较佳地为发酵罐，三角瓶，试管，更佳地为容积为250ml的三角瓶，所述三角瓶中培养基的装液量为本领域常规装液量，更佳地为30ml。所述发酵容器以及培养基的装液量请参考公开号为CN103865842A的中国专利申请。
其中步骤(1)所述离心的温度较佳地为2～4℃，离心的速度较佳地为15000g，离心的时间较佳地为15min。
其中步骤(2)为将所得上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为3:1～5:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～6℃，静置的时间为1～5小时，离心收集沉淀物，离心的时间为5～25分钟，离心的温度为2～4℃。
其中所述乙醇为本领域常规使用的乙醇，所述乙醇的质量百分比浓度较佳地为95％，所述乙醇与上清液混合的体积比较佳地为4:1；其中所述静置的时间较佳地为2h；其中所述离心的速度较佳地为15000g，离心的时间较佳地为15min。
其中步骤(3)为将上述所得沉淀物用水或PBS溶解，离心取上清，冻干即得。其中所述溶解为利用本领域常规溶剂进行溶解，所述溶剂优选地为PBS溶液，所述PBS溶液的浓度优选地为0.02mol/L；其中所述离心的速度更佳地为15000g，所述离心的时间更佳地为5min，所述离心的温度更佳地地为4℃。本次离心的目的是初步获得凝乳酶含量较高的粗提物，加入PBS溶解后进行离心，以去除残留的凝乳酶中不溶解的杂质，包括残留的菌体、培养基以及其他代谢不溶物。其中所述的冻干为本领域常规的冻干技术，所述冻干技术只要能将所得离心产物冷冻干燥即可。
为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案之二是：如上所述的制备方法制得的类芽孢杆菌凝乳酶。
本发明所得类芽孢杆菌凝乳酶具有较高的比活力，完全可以满足工业化生产凝乳酶的需求。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：本发明所述类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法在显著提高凝乳酶比活力以及凝乳酶回收率的前提下，大幅简化了凝乳酶的制备工艺步骤，而且凝乳酶制备方法中使用的乙醇易得易除，操作方法简单有效，有效降低了凝乳酶的生产成本，因此该制备方法较适于工业化应用生产。
与类芽孢杆菌的发酵上清液相比，乙醇提取所得凝乳酶的比活力达到了2866.46SU/mg以上，比提取之前的凝乳酶的比活力至少提高了2.69倍。而目前国内市场上商业凝乳酶比活力仅仅为120～150SU/mg范围内，因此利用本发明所述制备方法所得类芽孢杆菌凝乳酶具有较高的比活力，完全可以满足工业化生产凝乳酶的需求。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。实施例中所使用的试剂若未加说明，均为分析纯试剂，购买自国药集团。
实施例1类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
本发明所述菌株类芽孢杆菌BD3526已于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。该菌株的分类命名是类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333，具体内容请参见中国专利申请(CN 103740618A)。
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比4:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置2h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。取冻干后粗酶用0.02mol/L PBS溶解，并测定其酶的比活力(SU/mg)、蛋白含量(mg/mg)以及酶活回收率(％)。
凝乳酶活力(milk clotting activity,MCA)测定方法包括以下步骤：取稀释上清发酵液及溶解后的冻干粗酶样品500μL，将脱脂奶粉(脱脂奶粉购买自fonterra公司)以10％(w/v)的比例配置成pH 6.0含有10mmol/L CaCl2的溶液，在35℃水浴中孵育10min后，将500μL的凝乳酶加入至35℃的10mL脱脂乳溶液中，每15s将样品取出并倾斜45℃观察样品组织状态，以形成不连续颗粒的时间计作凝乳时间。1个凝乳酶单位(Soxhlet unite，SU)定义为35℃，使1mL脱脂乳在40min发生凝乳所需的酶量。
MCA ( SU / mL ) = 2400 × V S T × V E × D
T——凝乳时间，秒
VS——底物体积，mL
VE——酶液体积，mL
D——稀释倍率
按照下述方法测定样品蛋白含量：
碱性铜溶液配制包括甲液：取Na2CO32g溶于100mL0.1mol/L氢氧化钠溶液中；乙液：取CuSO4 .5H2O晶体0.5g，溶于1％酒石酸钾100mL中。临用时按甲：乙＝50：1混合使用；福林酚BR(沪试，购买自国药集团)，使用时，与超纯水1：1稀释；
取0.02mol/LPBS稀释上清发酵液及溶解后的冻干粗酶样品500μL，加入5mL碱性铜甲乙混合溶液，混合均匀于25℃下放置10min，加入500μL福林酚溶液，混合均匀25℃下放置30min后，于660nm处测定吸光值，并计算蛋白含量P(mg/mL)。
发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率计算公式如下：
发酵液总凝乳酶活(SU)＝V×MCA
V——上清发酵液总体积，mL
MCA——上清发酵液酶活，SU/mL
发酵液总蛋白含量(mg)＝V×P
V——上清发酵液总体积，mL
P——蛋白含量，mg/mL
TMCA——发酵液总凝乳酶活，SU
DMCA——冻干样品酶活，SU/mg
m——冻干样品质量，mg
表1类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法1测定结果
测得实验数据计算结果如表1所示，可以看出提取的粗酶回收率为48.68％，且乙醇提取的粗酶比活力为4667.33SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高3.62倍。
实施例2类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526 CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为5％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比4:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置5h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表2所示。
表2类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法2测定结果
测得实验数据计算结果如表2所示，可以看出提取的粗酶回收率为49.45％，且乙醇提取的粗酶比活力为4366.83SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高3.67倍。
实施例3类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为3％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比4:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置1h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表3所示。
表3类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法3测定结果
测得实验数据计算结果如表3所示，可以看出提取的粗酶回收率为49.83％，且乙醇提取的粗酶比活力为4552.52SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高3.73倍。
实施例4类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比3:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置1h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表4所示。
表4类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法4测定结果
测得实验数据计算结果如表4所示，可以看出提取的粗酶回收率为31.01％，且乙醇提取的粗酶比活力为2866.46SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高2.69倍。
实施例5类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比3:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置5h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表5所示。
表5类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法5测定结果
测得实验数据计算结果如表5所示，可以看出提取的粗酶回收率为36.26％，且乙醇提取的粗酶比活力为3447.23SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高3.3倍。
实施例6类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法6
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为5％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比5:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置1h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表6所示。
表6类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法6测定结果
测得实验数据计算结果如表6所示，可以看出提取的粗酶回收率为29.54％，且乙醇提取的粗酶比活力为3983.55SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高3.94倍。
实施例7类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为2％，余量为水装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比5:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置2h。
在4℃，15000g离心15min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表7所示。
表7类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法7测定结果
测得实验数据计算结果如表7所示，可以看出提取的粗酶回收率为53.26％，且乙醇提取的粗酶比活力为3983.55SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高4.15倍。
实施例8类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为3％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于2℃，15000g，10min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比4:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置2h。
在2℃，15000g离心25min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表8所示。
表8类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法8测定结果
测得实验数据计算结果如表8所示，可以看出提取的粗酶回收率为43.03％，且乙醇提取的粗酶比活力为4017.25SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高3.17倍。
实施例9类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526CGMCC No.8333，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为3％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于2℃，15000g，30min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比4:1(V/V)进行混合，混合均匀后于6℃静置5h。
在2℃，15000g离心5min收集醇沉物质，将沉淀用0.02mol/L PBS溶解后，4℃，15000g条件下离心5min去除不溶物，取上清溶液进行冻干处理，最终获得类芽孢杆菌BD3526麸皮液体发酵产生的粗凝乳酶。按照实施例1中所述的方法分别进行凝乳活力、蛋白含量、发酵液总凝乳酶活、发酵液总蛋白含量及MCA回收率的测定，结果如表9所示。
表9类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法9测定结果
测得实验数据计算结果如表9所示，可以看出提取的粗酶回收率为42.17％，且乙醇提取的粗酶比活力为3502.01SU/mg，相对提取前凝乳酶比活力提高2.70倍。
对比实施例1类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为3％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将上清液分三组测定，分别将95％乙醇与上清发酵液按体积比1:1，4:1与10:1(V/V)进行混合，混合均匀后于4℃静置2h。后续操作参照实施例1，结果如表10所示。
表10类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法10测定结果
测得实验数据计算结果如表10所示，可以看出95％乙醇的加入量对凝乳酶的回收率、比活力影响较大，加入乙醇过多，可能造成凝乳酶变性，且将过多的多糖类代谢产物混入，影响实验结果；加入乙醇过少，则造成提取凝乳酶效率下降，其回收率仅为21.36％，并且凝乳酶的比活力也较低，仅为2531.29SU/mg。
对比实施例2类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法
利用麸皮培养基发酵培养类芽孢杆菌BD3526，麸皮培养基的成分为：小麦麸皮的质量百分含量为3％，余量为水，装样量30mL，温度30℃，摇床的震荡的速度为300rpm，发酵培养时间48h后，收集BD3526发酵液；于4℃，15000g，20min条件下离心后收集上清发酵液，取少量上清发酵液使用PBS稀释5倍，并测定发酵上清液酶活力(SU/mg)及蛋白含量(mg/mL)；将95％乙醇与上清发酵液按体积比4:1(V/V)进行混合，混合均匀后分为三组，分别于4℃静置0h，2h，12h。后续操作参照实施例1，结果如表11所示。
表11类芽孢杆菌发酵液中凝乳酶的提取方法11测定结果
测得实验数据计算结果如表10所示，可以看出当发酵上清液与乙醇混合后的静置时间对于提取凝乳酶有显著的影响，当乙醇与凝乳酶混匀后静置的时间过长(12h)时，可能导致凝乳酶部分失活影响粗提物的比活力；如果将乙醇与发酵液上清混匀后即刻离心收集，则会影响凝乳酶的提取率和比活力。
应理解，在阅读了本发明的上述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种类芽孢杆菌凝乳酶的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)接种于培养类芽孢杆菌的培养基中，以常规条件震荡发酵培养48小时，将所得发酵液离心取上清液；
(2)将步骤(1)所得上清液与乙醇混合，乙醇与上清液混合的体积比为3:1～5:1，将所得混合液静置，静置的温度为2～6℃，静置的时间为1～5小时，离心收集沉淀物；
(3)将步骤(2)所得沉淀物用水或PBS溶解，离心取上清，冻干即得。
2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)为类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)CGMCC No.8333菌株。
3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述常规条件为：发酵培养的温度是30℃，所述震荡的速度为300rpm。
4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述离心的速度为15000g，离心的时间为10～30分钟，离心的温度为2℃～4℃；步骤(3)所述离心的速度为15000g，离心的时间为5分钟，离心的温度为4℃。
5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述培养类芽孢杆菌的培养基为麸皮培养基，所述麸皮培养基的配方为：小麦麸皮2-5％，余量为水，所述百分比为质量百分比。
6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述发酵培养是在发酵容器中进行的，所述发酵容器的体积为250ml，所述发酵容器中培养基的装液量为30ml。
7.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述乙醇的质量百分比浓度为95％，所述乙醇与上清液混合的体积比为4:1。
8.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述静置的时间为2小时。
9.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的速度为15000g，离心的时间为5～25分钟，离心的温度为2～4℃；更佳的离心的时间为15分钟。
10.一种如权利要求1～9任一项所述的制备方法制得的类芽孢杆菌凝乳酶。
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