CN112111428B - 一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌及在纤维素降解中的应用 - Google Patents

一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌及在纤维素降解中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌及在纤维素降解中的应用，申请人自猪尸体和秸秆堆肥高温时期的样品分离出一株纤维酶酶活性最高的菌株Geobacillus thermodenitrificans，经高温驯化，紫外诱变后，获得了一株高产纤维素酶的热葡糖苷酶地芽孢杆菌，该菌株的保藏编号：CCTCC NO：M2020324，本发明首次报道的具有纤维素酶活的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1。可利用多种碳源，对多种纤维素都具有降解作用，且发酵生产的发酵液中纤维素酶酶浓度高。

Description

一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌及在纤维素降解 中的应用
技术领域
本发明属于微生物领域，具体涉及一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌及在纤维素降解中的应用。
背景技术
纤维素作为生物圈中最丰富、最不被利用的资源，可以利用微生物借助多酶系统将其水解(Hahn-
Figure GDA0003676071240000011
al 2006)。纤维素酶为具有协同作用的复合酶，主要包括内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4endo-1 4-β-D-glucanase)，外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91,exo-1 4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(EC.3.2.1.21,β-glucosidase)。三种酶协调参与了天然纤维素的降解(李娜2006)，内切葡聚糖酶主要在纤维素分子内的非结晶区起作用，水解β-1,4糖苷键，使长链纤维素分子链变成小分子纤维素，为外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶创造更多的酶切位点。外切葡聚糖酶主要在纤维素的线状分子末端起作用，水解β-1,4糖苷键，切下一个纤维二糖分子。β-葡萄糖苷酶来水解纤维二糖，得到葡萄糖分子(陈作国2016)。
纤维素降解菌主要以霉菌为研究对象，如木霉菌，曲霉，根霉菌和青霉菌等，具有降解效率高、酶活性高的特点，但霉菌不易制成菌剂，菌剂也不易保存，大多数菌株易于退化或应用效果也不稳定(Paudel et al 2015)。细菌纤维素酶则表现出较好的使用性能和巨大的经济价值(沈雪亮等2001)。因此，筛选高效纤维素降解细菌成为了提高堆肥效率、解决废弃物带来的污染以及开发纤维素降解菌剂的有效途径。
细菌降解纤维素有其独特的优势：①细菌培养周期短，生长速度快，可以依靠廉价的氮源和碳源作为能源生产纤维素酶(Watanabe et al 2010)。②细菌纤维素酶表达量相对较高，相对容易获得(Chandelet al 2012)。③细菌纤维素酶的热稳定性好，原核表达控制系统相对简单方便(Demirjianet al 2001)。
毛婷等人利用刚果红平板染色法对菌株进行初筛，纤维素酶活性(以滤纸酶活表示)为评价指标进行复筛，从腐木中分离筛选出2株高产纤维素酶菌株K1、K2，分别鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，酶活为98.4U/mL(毛婷等2020)。赵珊等人利用刚果红染色法、形态学检测、全自动细菌鉴定仪鉴定，从大熊猫粪便样品中分离1株具有纤维素降解能力的菌株蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)(赵珊等2015)。卢月霞等人采用森林落叶土、腐烂的秸秆和农家堆肥等作为材分离获得一株拥有高效纤维素酶活力的细菌蜡样芽孢杆菌(Bacillus toyonensis)(卢月霞等2011)。王志超等人以堆肥作为研究材料，在好氧堆肥发酵过程中6株高温纤维素降解菌，分别为TCB1-TCB6(王志超等2006)。朴哲等人从牛粪秸秆堆肥样本中获得1株纤维素降解能力比较强的菌株，鉴定为类芽孢杆菌(Paenibacilluspabuli)(朴哲等2003)。
细菌的分类学已通过系统进化组学鉴定，Geobacillus被分为两个属(Nazina etal 2001)：Geobacillus和Parageobacillus(Aliyu et al 2016)。Geobacillus属是于2001年从芽孢杆菌中重新分类得来的，嗜热菌的代表，由革兰氏阳性、杆状，形成芽孢的细菌组成，它们在嗜热条件下茁壮成长，并能够进行有氧和无氧呼吸。地芽孢杆菌属由两种属组成，即Geobacill us和Parageobacillus，后一种属主要包括Parageobacillluscaldoxylosilyticus，Parageobacillu sthermoglucosidasius，Parageobacillusantartcicus，Parageobacillustoebii和Parageobacillus g enomospecies(刘国红等2008)。
Geobacillus和Parageobacillus菌种对底物的降解是不同的，即使在同一物种内可能也存在不同(Lebre et al 2018)。例如，GeobacillusLC300可以有效利用木糖，葡萄糖，甘露糖和半乳糖促进细胞生长(Cordova et al 2015)，而Geobacilluszalihae可以有效利用脂肪(Rah man et al 2007)。P.caldoxylosilyticusDSM 12041T和P.thermoglucosidasius即使分泌相同的木聚糖降解酶，但P.caldoxylosilyticus DSM12041T利用木聚糖的能力远远低于P.therm oglucosidasius(Lebre et al 2018)，而G.stearothermophilus ATCC 12980T和P.toebii DSM14590T尽管缺乏木聚糖酶(XynA1)和脱乙酰基酶直向同源物的基因，但对木聚糖却表现出较好的木聚糖降解活性(Salama etal 2012)。
P.thermoglucosidasius在降解纤维素方面的能力到目前还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供了一株人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌，该菌株具备纤维素酶产酶能力，已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CC TCC NO：M2020324，分类命名：热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillusthermoglucosidas ius BGSC95A1，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1在纤维素降解中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
申请人自猪尸体和秸秆堆肥高温时期的样品分离出一株纤维酶酶活性最高的菌株Geob acillus thermodenitrificans，经高温驯化，紫外诱变后，获得了一株高产纤维素酶的菌株，该菌株已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCCNO：M2020324，分类命名：热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillus thermoglucosidasiusBGSC95A1，地址：中国武汉武汉大学。
菌落呈现乳白色，形状近似圆形，菌落形态圆形，边缘光滑状，表面黏稠状，菌落不透明，可产生孢子，为革兰氏阳性杆状细菌。
本发明的保护内容还包括：热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillusthermoglucosidasius BGSC95A1在降解纤维素中的应用，或是用于发酵生产纤维素酶；
所述的发酵生产过程中的培养基的碳源为：羧甲基纤维素钠，微晶纤维素、可溶性淀粉、葡萄糖或秸秆。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明获得了一株具有高纤维素酶活的热葡糖苷酶地芽孢杆菌，是首次报道的具有纤维素酶活的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1。
本发明提供的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1对多种纤维素都具有降解作用，可利用多种碳源，且发酵生产的发酵液中酶浓度高。
附图说明
图1为本发明的Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1在不同碳源下发酵生产纤维素酶的相对酶活力示意图。
图2为本发明的Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1在不同氮源下发酵生产纤维素酶的相对酶活力示意图。
图3为本发明的Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1发酵生产的纤维素酶在不同pH孵育后的相对酶活力示意图。
图4为本发明的Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1发酵生产的纤维素酶在不同温度孵育1h后的相对酶活力示意图。
图5为本发明的Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1发酵生产的纤维素酶的高效液相色谱图。
图6为本发明的Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1发酵生产的纤维素酶的纤维素酶酶谱。
图7为实施例2的葡萄糖标准曲线。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
高温纤维素降解菌的分离、纯化及鉴定
猪尸体和秸秆堆肥样品在牛肉膏蛋白胨培养基分离纯化，羧甲基纤维素钠基础培养基富集培养，挑选菌株于纤维素刚果红培养基上点样，60℃培养72h，经过初筛，从羧甲基纤维素钠培养基平板上共获得27种单菌株，再经复筛，对各菌株的纤维素酶活进行测定，最终选出一株最高酶活的菌株，经测序鉴定为Geobacillus thermodenitrificansCMC-4，经高温驯化，紫外诱变后，获得了一株高产纤维素酶的菌株，该菌株已于2020年7月16日送至中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号：CCTCC NO：M2020324，分类命名：热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1，地址：中国武汉武汉大学。
Parageobacillus thermoglucosidasius生理生化特性除了淀粉水解能力以及甲基红结果不一致之外，其他所测项目结果均与Geobacillus thermodenitrificans一致。
在本发明中热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillus thermoglucosidasiusBGSC95A1或被简称为CMC-4-1。
实施例2：
热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1纤维素酶酶活力测定：
以2％接种量将菌株Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1及其原始菌株Geo bacillus thermodenitrificansCMC-4分别接种于液体发酵培养基中，于60℃、150r/min培养72h，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液。
所述的液体发酵培养基的配方：牛肉膏10g，蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、蒸馏水补足至1000mL，自然pH。121℃灭菌20min。
提取得到粗酶液，测其羧甲基纤维素酶酶活，酶活(即酶浓度)的检测方法如下：
羧甲基纤维素酶活：取待测粗酶液0.5mL，加入1.5mL 1％CMC-Na溶液，40℃水浴保温30min，加入1.5mLDNS，沸水浴5min，冷却后定容至25mL，在540nm处测吸光度AS。
空白样：先加1.5mL DNS试剂，后加0.5mL待测酶液，与1.5mL 1％CMC-Na溶液，沸水浴煮沸5min，冷却后用水定容至25mL，在540nm处测吸光度Ack。
在标准葡萄糖曲线上根据吸光度的值查出相应的葡萄糖含量(P)，每小时底物产生1μmoL葡萄糖所需酶量为一个酶活力单位(U)。公式如下：
酶活力(U/mL)＝(P*K*1000)/0.5×30
式中：K为稀释倍数。
葡萄糖标准曲线的绘制：
取8支洁净的20mL具塞试管进行编号，加入葡萄糖溶液和蒸馏水，配制成浓度不一的葡萄糖溶液。
不同浓度的葡萄糖溶液
Figure GDA0003676071240000051
将溶液振荡摇匀，向8支具塞试管中加入1.5mL 3,5-二硝基水杨酸试剂(DNS)摇匀后放入沸水浴中，5min后取出待冷却后定容至20mL，摇匀。分光光度计波长调至540nm，用0号试管中的溶液调零，测出其余试管中溶液的吸光度。以葡萄糖含量为横坐标，相应的吸光度为纵坐标，绘制标准葡萄糖曲线。
根据葡萄糖标准曲线以及纤维素酶酶活性计算公式(图7)，得出热葡糖苷酶地芽孢杆菌Parageobacillus thermoglucosidasius BGSC95A1粗酶液中纤维素酶酶活力(即酶浓度)为94.00U/mL，按照上述方法，原始菌株CMC-4酶活力(即酶浓度)为80.80U/mL。
实施例3：
不同碳源对热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1的产酶影响：
1)分别以1％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)，1％微晶纤维素(micro-cellulose)、1％可溶性淀粉(starch)、1％葡萄糖(glucose)、1％秸秆(straw)为碳源，调节pH值为7.2。将活化好的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1菌液(即CMC-4-1)以2％的接种量接种至装有50mL的液体发酵培养基的250mL三角瓶中。55℃、200r/min摇床培养72h后，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液；每组3个重复，以不加任何碳源、蛋白胨作为氮源为CK组；测定纤维素酶活力(实施例2的方法)，检测的各组的酶活力，结果如下表所示。
2)根据各组的酶活力，确定最适反应碳源，计算其相对酶活：
相对酶活力＝每组酶活力平均值/最适碳源下的酶活力平均值×100％。
具体的培养基配方如下：
CMC-Na组配方：羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g，调节pH为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
micro-cellulose组培养基配方：微晶纤维素10g、蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g，调节pH为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
straw组培养基配方：秸秆10g、蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g，调节pH为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
starch组培养基配方：可溶性淀粉10g、蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g，调节pH为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
glucose组培养基配方：葡萄糖10g、蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g，调节pH为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
CK组(对照组)培养基配方：蛋白胨10g、酵母膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g，调节pH为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
结果如图1和下表所示：每组3个重复，结果显示CMC-4-1对碳源利用广泛，CMC-N a为最适反应碳源，当碳源为羧甲基纤维素钠和微晶纤维素时，CMC-4-1产酶相对活性高。
Figure GDA0003676071240000061
实施例4：
不同氮源对热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1的产酶影响：
1)选取蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、酪素、尿素、硝酸铵作为氮源，调节pH值为7.2。将活化好的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1菌液(即CMC-4-1)以2％的接种量接种至装有50mL培养基的250mL三角瓶中。55℃、200r/min摇床培养72h后，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液；每组2个重复，以羧甲基纤维素钠为碳源、不加任何氮源为CK组，测定CMC-4-1产的纤维素酶活力(实施例2的方法)，检测的各组的酶活力，结果如下表所示。
2)根据各组的酶活力，确定最适反应氮源，计算其相对酶活：
相对酶活力＝酶活力平均值/最适氮源下的酶活力平均值×100％。
具体的培养基配方如下：
tryptone组培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
yeast powder组培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、酵母粉10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
beef extract组培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、牛肉膏10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
casein组培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、酪蛋白10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
carbamide组培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、尿素10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
NH4NO3组培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、硝酸铵10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
CK组(对照组)培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、，调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
结果如图2和下表所示：每组2个重复，当氮源为牛肉膏和硝酸铵时，CMC-4-1产酶相对活性高。
Figure GDA0003676071240000071
实施例5：
不同ph对热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1产生的酶的影响：
1)将活化好的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1菌液(即CMC-4-1)以2％的接种量接种至装有50mL培养基的250mL三角瓶中。55℃、200r/min摇床培养72h后，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液；利用磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液，将酶液置于pH值分别为6、7、8的环境中1h，每组3个重复，测定酶活力大小(实施例2的方法)，结果如下表所示。
2)根据各组的酶活力，确定最适pH，计算相对酶活力；
相对酶活力＝酶活力平均值/最适pH下的酶活力平均值×100％
步骤1)中所用到的培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、硝酸铵10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、调节pH值为7.2，蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
结果如图3和下表所示：CMC-4-1表达的相对纤维素酶活力在pH6.0-7.0呈上升趋势，在7.0时达到最高峰，然后相对酶活力逐渐下降。
Figure GDA0003676071240000081
实施例6：
不同温度对热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1产生的酶活性的影响：
1)将活化好的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1菌液(即CMC-4-1)以2％的接种量接种至装有50mL培养基的250mL三角瓶中。55℃、200r/min摇床培养72h后，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液。将酶液置于45℃、55℃、65℃、75℃1h后，测定酶活力(实施例2的方法)，每组3个重复，结果如下表所示。
2)根据各组的酶活力，确定最适反应温度，计算相对酶活力；
相对酶活力＝酶活力平均值/最适温度下的酶活力平均值×100％
步骤1)中所用到的培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、硝酸铵10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、蒸馏水补足至1000mL，调节pH值为7.2，121℃灭菌20min。
结果如图4和下表所示：CMC-4-1表达的纤维素酶酶活力在45-65℃呈逐渐上升趋势，65℃达到最高峰，后呈下降趋势。
Figure GDA0003676071240000082
Figure GDA0003676071240000091
实施例7：
菌株发酵产物分析：
将活化好的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1菌液(即CMC-4-1)以2％的接种量接种至装有50mL培养基的250mL三角瓶中。55℃、200r/min摇床培养72h后，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液。将发酵上清液通过0.45μm微孔滤膜过滤，加入3倍体积乙醇进行醇沉，4℃放置过夜。离心，取上清，过滤后用旋转蒸发仪蒸干水分。加入适量乙腈与超纯水(乙腈：水＝7：3)。将样品通过高效液相色谱法检测。高效液相色谱仪：Agilentll00。检测器：蒸发光散射检测器(ELSD)。HP LC分离条件为：色谱柱规格：4.6X 250mm，固定相XB-NH2，粒径5um，柱温45℃，流动相：乙腈：水＝7：3(V/V)，流速：lmL/min，进样量：20uL。采用高效液相色谱分析法，对发酵液中纤维素酶水解羧甲基纤维素所产生的还原糖种类进行分析(吴丹丹等2017)。
培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、硝酸铵10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、蒸馏水补足至1000mL，121℃灭菌20min。
结果如图5所示：CMC-4-1所含糖类的保留时间分别为14.929min和9.643min，与纤维二糖14.871min和葡萄糖9.569min的保留时间较为一致，故认为降解产物为纤维二糖和葡萄糖，且降解产物中葡萄糖含量占多数，纤维二糖含量较少。
实施例8：
纤维素酶酶谱
将活化好的热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1菌液(即CMC-4-1)以2％的接种量接种至装有50mL培养基的250mL三角瓶中。55℃、200r/min摇床培养72h后，将菌株发酵液8000r/min离心30min，去除菌体以及培养基，上清液即为粗酶液。收集上清液利用聚乙二醇进行浓缩，将浓缩样品上样进行PAGE电泳，电泳完毕后将PAGE胶片取出，将P AGE胶放置于含0.2％CMC的琼脂平板上面，考马斯亮蓝染色，于55℃培养箱中放置几小时进行显影(张伟等2012)。
培养基配方：羧甲基纤维素钠10g、硝酸铵10g、氯化钠5g、磷酸二氢钾1g、硫酸镁0.2g、蒸馏水1000mL，121℃灭菌20min。
结果如图6所示：含羧甲基纤维素的琼脂平板上只有一条整齐的水解条带，该菌株仅分泌1种胞外纤维素酶组分，分子质量约为45kDa。
实施例9：
热葡糖苷酶地芽孢杆菌BGSC95A1重金属的耐受度
分别用K2Cr2O7、CoCl2配制一定浓度的母液，通过预实验确定K2Cr2O7的浓度梯度为5mmol/L、10mmol/L、15mmol/L、20mmol/L、25mmol/L，CoCl2的浓度梯度为10mmol/L、20mmol/L、30mmol/L、40mmol/L、50mmol/L，配置完毕后各取10ml存于10ml离心管中备用。将10mL不同浓度的重金属母液经0.22um微孔滤膜除菌后，与提前配置好的90mL的灭菌牛肉膏蛋白胨琼脂糖培养基混合制备成K2Cr2O7、CoCl2重金属培养基。此时新混合的培养基体系中K2Cr2O7的浓度为0.5、1、1.5、2、2.5mmol/L；CoCl2的浓度为1、2、3、4、5mmol/L。将富集好的该菌菌液分别在不同重金属浓度的平板培养基上点三个平行样，放置于55℃恒温培养箱中培养24h，观察平板培养基上的菌株生长情况。
牛肉膏蛋白胨培养基配方：牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，蒸馏水1000mL，琼脂20g，121℃灭菌20min。
结果如下表所示：该菌株能够耐受1.5mmol/L的K2Cr2O7重金属，耐受1.5mmol/LCoCl2重金属。
Figure GDA0003676071240000101
Figure GDA0003676071240000102
注：表中“+”为有菌落生长，“-”为无菌落生长
实施例10：
通过下载NCBI上纤维素降解酶的蛋白序列，构建本地的内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase)，外切葡聚糖酶(exo-1,4-β-D-glucanase)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)数据库，将菌株CMC-4-1的蛋白序列与本地纤维素酶数据库进行BLASTp比对。结果显示，CMC-4-1具有多个endo-1,4-β-D-glucanase和β-glucosidase蛋白编码基因。其中55-02128、55-02129、55-02164为endo-1,4-β-D-glucanase蛋白编码基因，55-02545、55-03827、55-03247为β-glucosidase蛋白编码基因。
该菌株含有在纤维素降解起重要作用的酶基因，包括纤维素酶、半纤维素酶、内切1,4-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、附着在GH13上的糖原等，通过纤维素酶活测定推测P.thermoglucosidasius对纤维素、半纤维素都具有很好的降解效果。
CMC-4-1纤维素降解和乙醇生成途径中的酶
Figure GDA0003676071240000111
Figure GDA0003676071240000121

Claims (4)

1.一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌（Parageobacillus thermoglucosidasius）BGSC95A1，所述菌株的保藏编号为CCTCC NO：M2020324。
2.权利要求1所述的热葡糖苷酶地芽孢杆菌在降解纤维素中的应用。
3.权利要求1所述的热葡糖苷酶地芽孢杆菌在发酵生产纤维素酶中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的发酵生产过程中的培养基的碳源为：羧甲基纤维素钠，微晶纤维素或秸秆。
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