KR20110119961A - 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 균주 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 종래 당화효소 보다 우수한 당화수율을 나타내는 셀룰라아제 생산이 가능한 신균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523 (Nectria cinnabarina KMJ523), 이의 배양방법 및 이 균주를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것이다.

Description

셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법{Cellulase producing Nectria cinnabarina and its use for saccharification}

본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 및 이를 이용한 셀룰로오스의 당화방법에 관한 것이다.

셀룰로오스(cellulose)는 지구상에 존재하는 가장 풍부한 유기물질 이며, 재생 가능한 자원이다. 그러나 대부분의 셀룰로오스 자원은 농산 및 임산 폐기물이 범람하고 있는 현재 주요한 환경오염원으로 간주되고 있다. 그러므로 이에 대한 효율적인 당화공정의 개발은 식량문제, 연료문제 그리고 환경문제의 해결에 큰 도움이 될 수 있을 것이다. 전 세계의 농산 및 임산 폐자원은 매년 30억 톤 이상이며, 아시아에서만 8억 톤 이상이 생산된다. 이는 주로 셀룰로오스와 헤미셀룰로오스로 이루어져있어 이들의 당화에 의한 포도당을 포함한 단당류의 생산은 바이오에너지 자원의 중요한 원료 생산 기술이 된다. 현재 농산 및 임산 폐자원으로부터 단당류를 회수하기 위해서는 대부분의 경우 황산을 첨가하여 고온에서 가압 및 분해 방법을 사용하고 있다. 이 경우 산 및 고온에 견딜 수 있는 고가의 생산장비가 필요하며, 분해산물도 각종 부반응으로 인해 다양하므로 분리 공정이 어렵고, 폐기물 처리 등의 비용으로 인해 생산단가가 높으며 환경 비친화적이라는 문제점을 안고 있다. 따라서, 오랫동안 셀룰로오스를 고효율로 당화시키기 위한 많은 연구가 있어 왔으며 그 중 특히 당화효소의 개발에 초점을 맞춰 많은 연구가 이루어져 왔다. 그 결과 현재 이들 당화효소의 용도가 다양하게 개발되어 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 등 여러 분야에서 상업화 되었으며 또한 새로운 응용연구도 활발하게 진행되고 있다.

한편, 식물체의 세포벽은 셀룰로오스(불용성 β-1,4-글루칸 섬유), 헤미셀룰로오스 (hemicellulose, 비셀룰로오스계 다당류), 리그닌(lignin, 복잡한 폴리페놀 구조의 다당류)과 같은 중합체로 구성되어 있다. 구성성분 중 셀룰로오스가 가장 많이 존재하고 그 다음으로 자일란(xylan)이 주성분인 헤미셀룰로오스가 많이 존재하며, 이들 두 성분이 전체 식물 바이오매스의 50% 이상을 차지한다. 셀룰로오스는 포도당 단위가 β-1,4 결합으로 연결된 동종 중합체로서 이를 단당류로 분해하기 위해서는 엔도-β-1,4-글루칸아제 (endo-β-1,4-glucanase) [EC 3. 2. 1. 4], 엑소-β-1,4-글루칸아제(exo-β-1,4-glucanase) [EC 3. 2. 1. 91], 베타-글루코시다아제 (β-glucosidase) (EC 3. 2. 1. 21) 등 세 종류의 효소가 필요하다. 엔도-글루칸아제는 안쪽에서 β-1,4 포도당 결합을 무작위적으로 절단하고 엑소-글루칸아제가 비환원당 말단에서 포도당 이당체인 셀로바이오스 (cellobiose)로 절단해 나간다. 셀로바이오스는 베타-글루코시다아제에 의해서 포도당으로 최종 분해된다.

종래에 이들 효소의 생산은 주로 곰팡이(fungi)를 이용하였으며, 특히 산업적인 측면에서 효소 생산은 아스퍼질러스(Aspergillus)와 트리코더마(Trichoderma)를 이용하였다. 셀룰라아제 생산 균주로는 트리코더마 리제이 R-30 (Trichoderma reesei ATCC 56764)이 대표적인 균주로 집중 연구되어 왔으나, 효소의 농도 및 활성이 산업화를 충족시킬만큼 충분하지 못하다는 문제점이 있다.

본 발명은 상기의 문제점을 해결하고 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 신규한 셀룰라아제를 생산하는 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 신규한 셀룰라아제를 생산하는 균주로부터 셀룰라아제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신 균주를 포함하는 셀룰로오스 당화용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 신균주의 배양방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주를 이용한 셀룰로오스의 당화방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 (Nectria cinnabarina) 균주를 제공한다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 넥트리아 시나바리나 균주는 넥트리아 시나바리나 (Nectria cinnabarina) KMJ523(KACC 93069P)인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 균주로부터 유래한 셀룰라아제를 제공한다.

또한 본 발명은 본 발명의 넥트리아 시나바리나 균주를 배양하는 단계;및 상기 배양물로부터 셀룰라아제를 분리하는 단계를 포함하는 셀룰라아제의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 셀룰라아제 생산방법에 있어서, 상기 셀룰라아제의 생산 배지는 아비셀 20~30g/L, 트립톤 7~9g/L, 황산마그네슘 2~4g/L, 일인산칼륨 4~7g/L, 이인산칼륨 4~7g/L 및 이노시톨 2-3g/L로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 조건인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니하며, 배양 조건은 교반속도는 400~600 rpm, 통기량은 1.0~1.5 vvm 또는 배양온도는 27~32℃에서 배양시키는 것이 바람직하나 마찬가지로 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 본 발명의 상기 넥트리아 시나바리나 균주 또는 그 균주의 배양액 또는 그 균주로부터 유래한 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로스 공급원으로부터 셀룰로스를 당화하는 방법을 제공한다.

본 발명의 당화방법에 있어서, 상기 셀룰로스 공급원은 본 발명의 효소에 의해 가수분해될 수 있는 대상이면 무엇이든 가능하나, 구체적인 예로는 식물의 줄기, 잎, 짚, 속대, 겨, 손상된 곡류, 과일, 야채류 등과 가공 후의 껍질, 종자, 잎, 송이, 껍질, 착즙박 등이 포함된다. 보다 구체적으로 예를 들면, 한정되지는 않으나 볏짚, 옥수수 외피(corn hull), 옥수수 속대(corn cop),사탕수수 착즙박(sugarcane bagasse), 쌀겨(rice husk) 및 미강(rice bran) 등이 있다.

상기 대상물을 본 발명의 효소로 가수분해함으로써 다양한 당류로 전환시킬 수 있다. 따라서 환경오염을 방지하면서 이들 농업 잔존물을 재활용할 수 있는 장점이 있다.

또한 본 발명의 당화방법에 있어서, 상기 당화는 셀룰라아제 농도 20 ~ 50 U/(셀룰로스)g, 셀룰로스 농도 4-16 중량%, 반응 pH 4~5, 또는 반응온도 35~40℃ 하에서 수행하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.

또한 본 발명은 상기 본 발명의 넥트리아 시나바리나 균주 또는 그 균주의 배양액 또는 본 발명의 셀룰라아제를 포함하는 셀룰로스 당화용 조성물을 제공한다.

본 발명의 명세서에 사용된 "셀룰로오스를 분해하는 효소" 또는"셀룰라아제"란 셀룰로오스의 탄수화물 골격의 다양한 위치 중 하나 이상에서 절단을 촉매하는 능력을 가지는 미생물, 또는 식물 유래 단백질 또는 단백질의 폴레펩타이드 도메인 또는 폴리펩타이드를 의미한다. 특정 조건 하에서 셀룰로오스 분해효소는 또한 더 작은 단위로부터 포도당과 같은 단당류 또는 셀로비오스와 같은 올리고당의 합성을 촉매할 수 있다.

본 발명의 균주의 배양방법은, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

또, 배양온도는 상기 언급한 적온의 범위에서 배양함으로써 셀룰라아제를 균체에 축적시키고, 회수한다.

탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분 등의 당류; 에탄올, 프로판올, 부탄올 등의 저급알콜류; 글리세롤 등의 다가알콜류; 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산 등의 유기산; 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산 등의 지방산 등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스,맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액 등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨,인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨 등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신 등의 항생물질을 첨가해도 된다.

본 발명의 셀룰로오스를 분해하는 효소 단백질은 분리하거나 정제될 수 있다. 그러한 분리 또는 정제는 본 발명의 균주를 배양하여 얻게 되는 배양물 중으로부터 균체 또는 상청액을 원심분리 회수하여, 균체를 파쇄하거나 또는 전체 세포, 세포찌꺼기, 외래 단백질 또는 최종 조성물에서 원하지 않는 단백질을 제거하기 위하여 당업계에 인지된 분리기술 예를 들어 이온 교환크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 분리, 투석, 프로테이즈 처리, 황산 암모늄 침천, 크기 배제 크로마토그래피, 여과, 겔 전기영동 또는 구배상의 분리 또는 이들의 적당한 조합에 의하여 성취될 수 있다.

얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS-폴리아크릴아미드겔 전기영동, 웨스턴블로팅 등에 의해 행할 수 있다.

본 발명의 효소는 본 발명의 목적하는 활성을 향상시키기 위하여 예를 들어 활성화제, 항저해제, 바람직한 이온, pH를 조절하는 화합물 또는 다른 효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 효소는 일반적인 제형기를 사용하여 적당한 크기의 분말, 펠렛 또는 과립 등의 다양한 형태로 제형화 될 수 있다.

상기에서 제형화된 본 발명의 효소는 그대로 사용되거나 또는 실온에서 풍건하거나 동결 건조 등으로 건조시켜 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 설명한다.

본 발명의 발명자들은 균주를 선별하던 중 고활성 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 KMJ523(Nectria cinnabarina KMJ523)[KACC 93065P]를 분리 동정함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명에서 분리한 넥트리아 시나바리나 KMJ523[KACC93065P]는 고활성 셀룰라아제를 생산하므로, 셀룰로오스 당화에 이용될 수 있고, 본 발명의 균주로부터 생산된 셀룰라아제는 종래 당화효소보다 우수한 당화수율을 나타내므로 바이오에너지의 생산, 섬유산업, 제지산업, 세제산업, 사료산업 및 식품 산업에 있어 저 칼로리 식품의 제조와 음식물 쓰레기의 발효 등 다양한 용도에 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과이다.
도 2(a)는 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주 및 트리코더마 리제이 R-30의 엔도-β-1,4-글루칸아제 활성을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2(b)는 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주 및 트리코더마 리제이 R-30의 엑소-β-1,4-글루칸아제 활성을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 2(c)는 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주 및 트리코더마 리제이 R-30의 베타-글루코시다아제 활성을 배양시간에 따라 비교하여 나타낸 그래프이다.
도 3은 버섯균 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주에 의해 생산된 당화효소를 이용한 최적 조건에서 반응시간 별 볏짚의 당화율을 나타낸 그래프이다.

이하, 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위하여 기재한 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 셀룰라아제 생산균의 선별

셀룰라아제를 생산하는 균주를 분리하기 위하여 각종 버섯 균의 배양액 10ul를 생리식염수 10 ml에 현탁하고, 현탁액의 10ul (1x10⁴ cfu ml^-1) 취하여 2% 카르복시메칠 셀룰로스가 첨가된 복합한천배지 (potato dextrose agar)에 도말한 후, 27℃에서 3일간 배양 하였다. 고체 한천배지 에서 콜로니가 형성된 후 0.1%의 콩고레드 시약으로 염색하고, 1 M 염화나트륨으로 탈색하여 그 콜로니 주위에 섬유소 분해환이 생성된 균들을 선별하는 방법으로 다양한 버섯 포자로부터 셀룰라아제를 생산하는 버섯균을 다수 탐색하였다.

위의 탐색과정을 통해 1차 선별된 균주를 대조군(C)으로 종래 셀룰라아제 생산균주로 이용되는 트리코더마 리제이 R-30를 이용하여, 상기와 같이 카르복시메칠 셀룰로스를 첨가한 고체 한천배지에서 섬유소 분해능을 확인한 후, 섬유소 분해능이 가장 뛰어난 하나의 균주를 선별하였다.

실시예 2: 균주의 동정

실시예 1에서 분리한 균주의 동정을 위하여 한국미생물 보존센터에서 ITS-5.8S rDNA 서열을 분석하였다. 분리된 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

상기 균주의 ITS-5.8S rDNA 서열의 유사종과의 유연관계를 분석한 결과 넥트리아 시나바리나 으로 동정되었다 (도 1).

상기 균주는 넥트리아 시나바리나 (Nectria cinnabarina) KMJ523으로 명명 하였고, 대한민국 수원시 권선구 서둔동 소재 한국 농업 생명공학 연구원에 2008년 2월 25일 기탁번호 KACC 93065P호로 국내 특허 기탁하였다.

실시예 3: 균주의 셀룰라아제 생산을 위한 배지 최적화 실험

(1)탄소원(볏짚)의 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험

7L 발효조에서 볏짚 농도에 따른 본 발명 균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 셀룰라아제 생산 실험을 수행하였다. 셀룰라아제 활성 측정을 위하여, 베타-글루코시다아제, 엑소-β-1,4-글루칸아제는 파라-니트로페닐 (p-nitro- phenyl, pNP)기가 붙은 기질인 파라-니트로페닐 글루코스 (pNPG), 파라-니트로페닐 셀로바이오스(pNPC)를 각각 이용하였고, 엔도-β-1,4-글루칸아제의 활성은 환원당을 이용한 somogyi-nelson법을 이용하여 측정하였다.

종 배양: 보관된 넥트리아 시나바리나의 단일 군락을 전 배양 배지 (Potato starch 4g/L, Dextrose 20g/L) 50mL이 들어있는 500mL 플라스크에 접종하여 진탕배양기에서 200rpm, 27℃로 3일간 배양하였다.

본 배양: 200mL의 종배양액을 생산배지(셀룰로오스20g/L, 트립톤 5g/L, 황산마그네슘1g/L) 4L가 들어있는 7L 발효조에 접종하여 교반속도 200rpm, 배양온도 27℃, 통기량 1.0vvm, pH 5에서 5일간 본 배양을 수행하였다. 초기 셀룰로오스의 농도를 10-40g/L로 달리하여 실험한 결과 표 1과 같았고, 20g/L의 농도에서 최대 셀룰라아제의 활성을 나타내었다.

(2)질소원( 트립톤 )의 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험

7L발효조에서 아비셀 농도를 20g/L로 하여 질소원(트립톤) 농도별 실험을 수행하였다. 질소원 농도를 7-10g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 2과 같았고, 9g/L 트립톤에서 최대활성을 나타내었다.

(3) 황산마그네슘의 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험

7L발효조 에서 아비셀과 트립톤의 농도를 각각 20g/L, 9g/L로 하여 황산마그네슘의 농도별 실험을 수행하였다. 황산마그네슘 농도를 1-5g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 3과 같았고, 3g/L 황산마그네슘 에서 최대활성을 나타내었다.

(4) 일인산칼륨 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험

7L발효조에서 아비셀, 트립톤, 황산마그네슘 농도를 각각 20g/L, 9g/L, 3g/L로 하여 일인산칼륨의 농도별 실험을 수행하였다. 일인산칼륨 농도를 4-7g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 4와 같았고, 6g/L 일인산칼륨에서 최대활성을 나타내었다.

(5) 이인산칼륨 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험

7L발효조에서 아비셀, 트립톤, 황산마그네슘, 그리고 일인산칼륨의 농도를 각각 20g/L, 9g/L, 3g/L, 6g/L로 하여 이인산칼륨의 농도별 실험을 수행하였다. 이인산칼륨 농도를 4-7g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 5와 같았고, 6g/L 이인산칼륨에서 최대활성을 나타내었다.

(6) 이노시톨 농도에 따른 셀룰라아제 활성 시험

7L발효조 에서 아비셀, 트립톤, 황산마그네슘, 일인산칼륨 그리고 이인산칼륨의 농도를 각각 20g/L, 9g/L, 3g/L, 6g/L, 6g/L 로 하여 이노시톨 농도별 실험을 수행하였다. 이노시톨 농도를 1-5g/L로 달리하여 배양한 결과 활성은 표 6과 같았고, 2g/L 이노시톨에서 최대활성을 나타내었다.

실시예4 : 고활성 효소 생산을 위한 최적 배양조건 실험

7L 발효조에서 아비셀, 트립톤, 황산마그네슘, 일인산칼륨, 이인산칼륨, 이노시톨의 농도를 각각 20g/L, 9g/L, 3g/L, 6g/L, 6g/L, 2g/L로 하여 배양 환경조건의 최적화 실험을 수행하였다. 교반속도 100-600rpm, 통기량 0.5-1.5vvm 및 배양온도를 23-32℃로 달리하여 셀룰라아제 활성을 비교한 결과 표 7과 같이 교반속도 500rpm, 통기량 1.3vvm, 배양온도 30℃에서 최대 셀룰라아제 활성을 나타내었다. 상기 최적조건에서의 배양 시간 별 엔도-β-1,4-글루칸아제, 엑소-β-1,4-글루칸아제 및 베타-글루코시다아제의 시간에 따른 활성 변화를 도 2a, 도 2b 및 도 2c에 각각 나타내었다.

세 효소의 활성 대조균으로 트리코더마 리제이 R-30를 이용하여 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 활성을 비교하였다. 배양조건은 모두 일관되게 적용되었으며, 활성 비교 결과 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주가 생산하는 셀룰라아제 효소들의 활성이 각각 엔도-β-1,4-글루칸아제 0.131 U/mg-단백질, 엑소-β-1,4-글루칸아제 4.20 U/mg-단백질, 베타-글루코시다아제 13.71 U/mg-단백질로서 대조군에 비해 현저히 높은 셀룰라아제 활성을 지니는 것을 확인하였다 (표 8).

실시예 5: 균주의 당화수율 분석

일반적으로 식물체가 함유하고 있는 리그노셀룰로스는 효소의 가수 분해만으로 높은 당화수율을 얻을 수 없다. 따라서 효소가수분해 과정 전에 전처리 과정을 거치게 되는데 본 발명에서는 2 중량% 수산화나트륨의 알칼리 처리방법을 이용하였다. 이러한 전처리 과정은 리그닌과 헤미셀룰로스의 조각화를 제공함으로써 셀룰라아제 효소의 섬유소 가수분해 효율의 증가를 가져오게 된다. 전처리를 위해 10 g의 볏짚을 40 ml의 2 중량% 수산화나트륨 용액이 든 플라스크에 넣고 85 ℃에서 1시간 동안 반응시킨 후 0.45 uM 필터에 여과한다. 이와 같이 전 처리 및 여과된 볏짚을 65 ℃에서 건조시켜 사용하였다. 균주의 최적 당화 조건을 탐색하기 위하여, 효소의 농도, 기질의 농도, 반응온도, 반응 pH 에 대한 실험을 진행하였다.

먼저, 전 처리된 볏짚을 농도별로 20 ml의 0.1 M 소디움 아세테이트 완충액 (pH 5.0)에 다양한 농도의 셀룰라아제와 함께 첨가하였다. 셀룰라아제가 첨가된 완충액은 15 ~ 55 ℃에서 150 rpm으로 72시간 동안 반응시킨 후 변성된 효소를 제거하기 위하여 반응액을 100℃ 에서 3분간 끓이고 실온에서 식힌 뒤 4000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 침전시켰다. 효소활성 측정은 환원당 측정법으로 그 상등액을 이용하였다.

당화율 기준은 반응이 끝난 볏짚을 105 ℃에서 24시간 건조한 후 줄어든 1 g의 볏짚 무게를 기준으로 다음 식과 같이 측정되었다.

(1)기질 농도에 따른 당화수율 실험

500 ml 삼각플라스크에서 여러 기질농도에 따른 본 발명 균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 당화실험을 수행하였다. 효소농도 20FPU/g substrate에 대한 볏짚 농도를 2-20 중량%로 각각 달리하여 배양한 결과를 표 9에 나타내었다. 10 ~ 12 중량% 에서 당화수율이 우수했고, 10 중량% 볏짚 농도에서 최적의 당화수율이 나타났다.

(2)온도에 따른 당화수율 실험

500 ml 삼각플라스크에서 반응조건을 효소농도 및 기질농도를 각각 30FPU/g substrate, 10 중량% 볏짚 농도로 하여 여러 온도에 따른 본 발명 균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 당화실험을 수행하였다.

반응 온도를 30, 35, 40, 45 ℃로 각각 달리하여 배양한 결과를 표10에 나타내었다. 35-40 ℃에서 당화수율이 우수하였고, 40 ℃에서 최적의 당화수율이 나타났다.

(3) pH 에 따른 당화실험

500 ml 삼각플라스크에서 반응조건을 효소농도, 기질농도 그리고 반응온도를 각각 30FPU/g substrate, 10 중량% 볏짚 농도 그리고 40도로 하여 여러 pH따른 본 발명 균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 당화실험을 수행하였다. 반응pH를 3.5, 4, 4.5, 5, 5. 5로 각각 달리하여 배양한 결과를 표 11에 나타내었다. pH 4 ~ 5에서 당화수율이 우수하였고, pH 4에서 최적의 당화수율이 나타났다.

(4)효소 농도에 따른 당화수율 실험

500 ml 삼각플라스크에서 반응조건을 효소농도, 기질농도, 반응온도 및 반응 pH를 각각 30FPU/g substrate, 10 중량% 볏짚 농도, 40도 그리고 pH4로 하여 여러 효소 농도에 따른 본 발명 균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 당화실험을 수행하였다. 효소의 농도를 10-50 FPU/g-기질로 달리하여 실험한 결과 표 12와 같았으며, 20-50 FPU/g-기질, 바람직하게는 30~40 FPU/g-기질의 효소를 사용하였을 때 최적의 당화수율을 나타내었다.

실시예 6: 최적 조건에서의 당화실험

반응기에서 최적화 한 조건에서 본 발명 균주 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주의 당화효소를 이용한 당화실험을 수행하였다. 반응액 내의 효소 농도는 30 FPU/g-기질, 기질 농도는 10%, pH4로 조절하였으며 온도는 40℃로 조절하였다. 최적화 된 조건에서 실험한 결과 반응 시간 별 당화수율을 도 3에 나타내었다.

본 발명에서 시행된 반응 시간에 따른 넥트리아 시나바리나 KMJ 523의 셀룰라아제에 의한 볏짚의 당화효율을 조사한 결과 30 FPU/g-기질의 효소농도, 10%의 기질을 사용하여, pH 4, 40℃에서 40시간 반응시켰을 때 80%의 최대 당화율을 나타내었다.

또한 본 발명에서는 셀룰라아제 생산을 위하여 교반속도는 400 ~ 600 rpm, 통기량은 1.0~ 1.5 vvm, 배양온도는 27 ~ 32℃에서 배양시키는 것이 바람직하다.

한편 본 발명의 넥트리아 시나바리나 KMJ523균주에서 생산된 셀룰라아제와 노보자임사의 셀룰라아제(상품명 celluclast)를 각각의 최적 조건에서 당화수율을 비교하여 표 13에 나타내었다.

농업생명공학연구원 KACC93065 20080225

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp. <120> Cellulase producing Nectria cinnabarina and its use for saccharification <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 549 <212> DNA <213> Nectria cinnabarina <400> 1 tctctgttgg tgaacagcgg agggatcatt accgagttta caactcccaa acccctgtga 60 acataccttt attgttgctt cggcgggatc gccccggcgc cctcgggncc ggacccaggc 120 gcccgccgga ggacccaaac tcttgtttcc attgtgattc tctgagtgat acaagcaaat 180 aaattaaaac tttcaacacc ggatctcttg gttctggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa 240 tgcgataagt aatgtgaatt gcagaattca gtgaatcatc gaatctttga acgcacattg 300 cgcccgccag tactctggcg ggcatgcctg ttcgagcgtc atttcaaccc tcaagcccct 360 tcgggcttgg tgttggggat cggcctgcgg cgtctgacgc cgtggccggc cccgaaatct 420 agtggcggtc tcgctgtagt cctcctctgc gtagtagcac acctcgcacc ggaacttagc 480 gcggccacgc cgttaaaccc caactttctg aagtttgacc tcggatcagg taggaatacc 540 cgctgaact 549

Claims (10)

1. 셀룰라아제를 생산하는 넥트리아 시나바리나 (Nectria cinnabarina).
2. 제 1항에 있어서, 상기 넥트리아 시나바리나 균주는 넥트리아 시나바리나 (Nectria cinnabarina) KMJ523(KACC 93065P).
3. 제 1항 또는 제2항의 균주로부터 유래한 셀룰라아제.
4. a)제 1항 또는 제2항의 넥트리아 시나바리나 균주를 배양하는 단계; 및
   b) 상기 배양물로부터 셀룰라아제를 분리하는 단계를 포함하는 셀룰라아제의 생산방법.
5. 제 4항에 있어서, 상기 셀룰라아제의 생산 배지는 아비셀 20~30g/L, 트립톤 7~9g/L, 황산마그네슘 2~4g/L, 일인산칼륨 4~7g/L, 이인산칼륨 4~7g/L 및 이노시톨 2-3g/L로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 조건을 포함하는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
6. 제 4항 또는 제 5항에 있어서, 상기 배양 조건은 교반속도는 400~600 rpm, 통기량은 1.0~1.5 vvm 또는 배양온도는 27~32℃에서 배양시키는 것을 특징으로 하는 셀룰라아제의 생산방법.
7. 제 1항 또는 제2항의 넥트리아 시나바리나 균주 또는 그 균주의 배양산물 또는 제 3항의 셀룰라아제를 이용하여 셀룰로스 공급원으로부터 셀룰로스를 당화하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 상기 셀룰로스 공급원은 볏짚, 옥수수 외피(corn hull), 옥수수 속대(corn cop),사탕수수 착즙박(sugarcane bagasse), 쌀겨(rice husk) 및 미강(rice bran)으로 구성된 군으로부터 선택된 것인 셀룰로스를 당화하는 방법.
9. 제 7항 또는 제 8항에 있어서, 상기 당화는 셀룰라아제 농도 20 ~ 50 U/(셀룰로스)g, 셀룰로스 농도 4-16 중량%, 반응 pH 4~5, 또는 반응온도 35~40℃ 하에서 수행하는 것을 특징으로 하는 셀룰로스의 당화방법.
10. 제 1항 또는 제2항의 넥트리아 시나바리나 균주 또는 그 균주의 배양산물 또는 제 3항의 셀룰라아제를 포함하는 셀룰로스 당화용 조성물.

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