CN114752540B - 一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang及其应用 - Google Patents

一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang及其应用，属于微生物发酵领域。本发明所述耐乙醇贝莱斯芽孢杆菌Huang为发明人自主分离，已于2021年11月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC NO.23761。本发明公布的贝莱斯芽孢杆菌筛选自高度发酵酒，其营养体能够在0%‑8%乙醇下生长，在无水乙醇下存活2 h不形成芽孢，具有较高的乙醇耐受能力。本发明所述的耐乙醇贝莱斯芽孢杆菌，液态发酵中能够产生丰富的酸类、氨基酸物质，有效提高发酵酒的风味及品质，在酿酒领域具有一定的应用价值。

Description

一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang及其应用
技术领域
本发明涉及一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang及其应用，属于微生物发酵领域。
背景技术
芽孢杆菌是发酵酒制作过程中具有较高丰度的功能微生物，对发酵酒的风味品质具有重要贡献，其种类和数量影响发酵进程和酒的风味特征。芽孢杆菌还具有多种降解酶的分泌能力，能够分解淀粉、蛋白质等大分子物质，生成有机酸、氨基酸等小分子物质，提高原料的利用率。此外，芽孢杆菌还能形成双乙酰、含氮化合物等芳香物质，同时为其他风味化合物的形成提供前驱底物，对发酵酒风味的赋予和调控起到重要作用，是多种香型酒特征风味形成的关键微生物。芽孢杆菌的存活形式分为营养体和芽孢，营养体能正常生长繁殖及代谢，但耐受性差，储藏期短，易死亡；而芽孢代谢不活跃，结构高度有序，对多种胁迫环境具有较强的抵抗能力，同时仍保持潜在的萌发力。目前关于芽孢杆菌的文献报道最高能耐受12 %乙醇浓度（如解淀粉芽孢杆菌），而现有专利中报道（公开号为CN112251379B的中国发明专利）贝莱斯芽孢杆菌能够耐受5%乙醇浓度。
在酿酒过程中，逐渐积累的乙醇会抑制芽孢杆菌的生长和代谢，高浓度的乙醇会导致芽孢杆菌形成几乎无代谢活性的芽孢休眠体，进而影响其发挥功效。因此，筛选能够耐受高浓度乙醇的芽孢杆菌营养体对提高发酵酒产品品质尤为重要。
发明内容
本发明从发酵酒样中筛选出芽孢杆菌，经16S rRNA及特异性管家基因gyrB对比分析，鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。该菌株能够分泌蛋白酶及纤维素酶，其代谢产物分析表明，该菌株生长代谢过程中产生大量的氨基酸及其衍生物，有机酸以及核苷酸及衍生物，对发酵酒风味的赋予和营养物质的调控中起到重要作用。对该菌株进行乙醇耐受实验，发现其营养体能在0%~8%乙醇条件下生长，且能在无水乙醇中存活。这表明菌株在发酵酒的酿造过程中具有一定的耐受乙醇能力，进而能够发挥其有益作用。
本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang，所述贝莱斯芽孢杆菌Huang保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.23761，保藏日期为2021年11月08日。
所述贝莱斯芽孢杆菌Huang取自酒厂发酵酒样，对菌株进行生理生化试验，16SrRNA分子生物学鉴定并辅以特异性引物gyrB进行辅助鉴定，并以特异性引物kdgK进行验证，以鉴定菌株的种属及分类，其16S rRNA序列具有如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。所述耐乙醇贝莱斯芽孢杆菌的gyrB序列具有如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。经鉴定，证明本发明的菌株为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），将其命名为贝莱斯芽孢杆菌Huang。
所述贝莱斯芽孢杆菌Huang菌株形态学特征是：菌株菌体在显微镜下呈杆状，单个或成对排列，菌落呈乳白不透明圆状。
所述贝莱斯芽孢杆菌Huang生物学特征为：能利用葡萄糖、甘露醇和明胶，在v-p试验、接触酶试验和氧化酶试验中阳性。
在本发明的一种实施方式中，所述贝莱斯芽孢杆菌Huang，其营养体乙醇耐受度为：能够在0 %~8 %乙醇条件下生长，在无水乙醇下能存活至少2 h不形成芽孢。
本发明提供了一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有上述贝莱斯芽孢杆菌，或含有其发酵液，或含有其冻干粉，或含有其裂解物。
在本发明的一种实施方式中，所述微生物菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌Huang的含量不少于：1×105 CFU/mL。
本发明还提供了一种产品，所述产品中含有所述贝莱斯芽孢杆菌Huang或上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述贝莱斯芽孢杆菌Huang的含量不少于：1×105 CFU/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述产品为化学品。
在本发明的一种实施方式中，所述化学品包括但不限于窖泥强化剂、饲料添加剂、大曲强化剂。
本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌Huang，或上述微生物菌剂在强化窖泥或酿酒中的应用。
本发明还提供了一种功能性强化菌剂的制备方法，所述方法为向酿酒的原料中添加上述贝莱斯芽孢杆菌Huang，上述微生物菌剂，发酵制备得到。
在本发明的一种实施方式中，所述主要原料为：糯米等酿酒原料。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述贝莱斯芽孢杆菌Huang的含量不少于：1×105 CFU/mL。
本发明还提供了一种生产白酒的方法，所述方法为，在白酒发酵过程中添加上述贝莱斯芽孢杆菌，或上述微生物菌剂。
在本发明的一种实施方式中，所述产品中，所述贝莱斯芽孢杆菌Huang的含量不少于：1×105 CFU/mL。
有益效果
（1）本发明得到一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang，该菌能够在0 %~8 %乙醇条件下生长，且在乙醇环境下整个生长过程中以营养体形式存活，仅少数为芽孢形式；在无水乙醇下能存活2 h不形成芽孢，是一株具有良好耐乙醇特性的贝莱斯芽孢杆菌。
（2）通过该贝莱斯芽孢杆菌Huang代谢产物分析结果表明，该菌能产多种氨基酸、有机酸、脂肪酸、核苷酸及生物碱等，其中氨基酸及多肽种类及含量最大，为最主要的代谢产物。其种类及含量在所有代谢物中占比最大，种类数量达182种，含量占所有代谢物的25.45 %。
（3）该贝莱斯芽孢杆菌Huang还能产多种酶，具有降解碳水化合物、有机氮的能力。本发明为有效提高发酵酒的原料利用率，提高产品风味品质提供了新的菌种资源，具有很高的应用价值。
生物材料保藏：
一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2021年11月08日，保藏编号为CGMCC No.23761，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌 Bacillus velezensis，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株涂布菌落形态图及革兰氏染色镜检图。
图2：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株系统发育树；a图为16SrRNA系统发育树，b图为gyrB系统发育树。
图3：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株不同乙醇浓度下生长曲线。
图4：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株在无水乙醇中培养2 h后的菌落数。
图5：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株在不同乙醇浓度下生长的营养体存活及芽孢生成情况。
图6A：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株代谢产物的含量。
图6B：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株代谢产物的种类数量。
图7：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株产纤维素酶活力测定结果。
具体实施方式
为能清楚说明本发明方案的技术特点，以下结合具体实施例，对本发明进行阐述。以下实施例仅仅用于举例说明，并不对本发明构成任何限制。下述实施例中所涉及的产纤维素酶发酵培养基公开于李佳腾“纤维素降解优势菌株的筛选与杏鲍菇菌糠混菌发酵条件的优化[D].西北农林科技大学,2019.”中，下述实施例中所涉及的产蛋白酶发酵培养基为LB液体培养基。
下述实施例所涉及的培养基如下：
LB固体培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母膏粉5.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、葡萄糖1.0g/L、琼脂粉16.0 g/L。
LB液体培养基：蛋白胨10.0 g/L、酵母膏粉5.0 g/L、氯化钠5.0 g/L、葡萄糖1.0g/L。
产纤维素酶发酵培养基：CMC-Na 10.0 g，蛋白胨5.0 g，(NH4)2SO4 2.0 g，KH2PO42.0 g，酵母粉1.0 g，MgSO4 0.5 g，CaCl2 0.1 g，NaCl 0.5 g，FeSO4.7H2O 0.05 g，MnSO4 0.02 g。
下述实施例中所涉及的检测方法如下：
代谢产物的检测：
移取100 μL处理后的发酵液至EP管中，加入400 μL提取液（甲醇：乙腈=1：1（v/v），含同位素标记内标混合物），涡旋混匀30 s；超声10 min（冰水浴）；-40 ℃静置1 h；将样品4℃，12000 r/min离心15 min；取上清于进样瓶中上机检测；使用超高效液相色谱仪对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为水相，含25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L氨水，B相为乙腈。样品盘温度：4 ℃，进样体积：2 μL。
纤维素酶活力测定
利用DNS法测定羧甲基纤维素（CMCase）酶活和滤纸（FPase）酶活，结合葡萄糖标准曲线和公式计算酶活。
酶活单位（U）定义为：1 mL酶液在1 min内水解相应底物产生1 μg还原糖所需酶量为一个酶活单位（U）。
蛋白酶活力测定
取1 mL粗酶液于40 ℃下预热2 min，加入酪蛋白溶液（40 ℃下预热5 min）1 mL后，摇匀并置于40 ℃下水浴10 min，加入2 mL三氯乙酸以中止反应，用中速滤纸过滤上述反应液。待过滤完成后，取1 mL滤液于试管中，并往里依次加入0.4 mol/L Na2CO3和1 mL稀释了3倍后的福林酚试剂，40 ℃水浴20 min，待其冷却后，于OD 680 nm处测其吸光度值。其中空白对照管为先加入三氯乙酸2 mL后加入1 mL酪蛋白溶液，其余步骤与样品管一致。
此时蛋白酶活性定义为pH 7.0、37 ℃下1 mL粗酶液1 min内水解酪蛋白生成1 μg酪氨酸的量为1个酶活力单位。
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株的获得
1、菌株分离纯化
使用移液枪各吸取0.1 mL发酵酒样样品，注入LB固体平板中，均匀涂布。将经过涂布处理的平板置于生化培养箱中37 ℃恒温培养24 h~48 h，每个样品设置4个平行。待培养基上有明显菌落长成后，用接种环在无菌条件下挑取单菌落于芽孢杆菌筛选平板上进行“三区划线”纯化2~3次，直至培养基上菌落形态一致。
2、菌株保藏
挑取已纯化的单菌落于LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min下培养24 h，以1：1的体积比，将菌液与灭菌的50 %甘油混合，密封后轻轻颠倒混匀，分别置于-20 ℃及-80 ℃冰箱中冻存。
3、革兰氏染色
革兰氏染色与显微形态观察：在洁净无菌的载玻片中央滴加一滴生理盐水，使用无菌接种环挑取纯化的单菌落，混匀并干燥；在酒精灯火焰上方以钟摆速度来回移动载玻片3-5次，固定涂片；滴加结晶紫染液染色1 min，水洗至无色；滴加碘液染色1 min，水洗至无色；滴加脱色酒精脱色30 s，再水洗；滴加沙黄复染液复染1 min，水洗至无色，干燥后镜检。
所筛选的菌株菌落菌体形态及革兰氏染色镜检结果如图1所示，菌落呈乳白不透明圆状。菌株菌体在显微镜下呈杆状，单个或成对排列。
以上结果与伯杰氏细菌鉴定手册中对芽孢杆菌的描写一致，然而由于仅通过细菌形态学观察无法准确对菌株进行鉴定，仍需要结合菌株生理生化、分子生物学鉴定等其它手段对其进行进一步的鉴定。
实施例2：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株的鉴定
对实施例1得到的菌株进行生理生化试验、16S rRNA分子生物学鉴定并辅以特异性引物gyrB进行辅助鉴定，并以特异性引物kdgK进行验证，以鉴定菌株的种属及分类（如图2所示）。
1、菌株的生理生化实验
结合《伯杰氏细菌鉴定手册》对所筛选出来的菌株进行生理生化试验。主要试验为菌株对葡萄糖、甘露糖、明胶的利用能力、v-p试验、接触酶试验和氧化酶试验。
所筛选的菌株的生理生化鉴定结果如表1所示。
表1：菌株革兰氏染色与生理生化试验结果
菌株 革兰氏染色 葡萄糖 甘露糖 明胶 v-p试验 接触酶试验 氧化酶试验
Bacillus velezensisHuang + + + + + + +
菌株为革兰氏阳性菌株，能利用葡萄糖、甘露醇和明胶，在v-p试验、接触酶试验和氧化酶试验中阳性。
2、菌株的DNA的提取
使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取细菌DNA。
3、PCR扩增反应
以鉴定菌株的DNA为模板，按以下反应体系及扩增条件进行PCR扩增反应：
16S rRNA PCR反应体系（50 μL）：2 μL Template，27F及1492R引物各1 μL（10 μM），5 μL 10X PCR Buffer，3 μL Mg2+（25 mM），1 μL dNTPs（10 mM），1 μL Easy Taq DNAPolymeras（5U/μL），36 μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保温5 s。吸取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若目标产物片段长度在1500 bp左右则表明扩增成功。PCR扩增引物如表2所示。
表2：PCR扩增引物
Figure 677319DEST_PATH_IMAGE001
分离菌株16S rRNA鉴定分析结果：将待鉴定菌株的16S rRNA基因序列利用NCBI中BLAST程序及Ezbiocloud网站进行序列同源性比对，结果显示同源性达99.64 %。
4、特异性引物gyrB辅助鉴定、kdgK验证
所筛选菌株的16S rRNA序列（如SEQ ID NO：1所示）与Bacillus velezensis（贝莱斯芽孢杆菌）的相似性高，然而由于贝莱斯芽孢杆菌与其近缘种如枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、死谷芽孢杆菌等的序列相似性皆高达99 %，根据菌株16S rRNA的序列比对结果并不足以验证所筛选出来的菌为贝莱斯芽孢杆菌。因此，在本发明中主要采用的是16S rRNA分子生物学鉴定并辅以特异性引物gyrB辅助鉴定、特异性引物kdgK进行验证以鉴定菌株的种属及分类。
gyrB PCR反应体系（50 μL）：2 μL Template，gyrBF及gyrBR引物各1 μL（10 μM），5μL 10X PCR Buffer，3 μL Mg2+（25 mM），1 μL dNTPs（10 mM），1 μL Easy Taq DNAPolymeras（5 U/μL），36 μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保温5 s。吸取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若目标产物片段长度在1200 bp左右则表明扩增成功。
kdgK PCR反应体系（50 μL）：2 μL Template，27F及1492R引物各1 μL（10 μM），5 μL 10X PCR Buffer，3 μL Mg2+（25 mM），1 μL dNTPs（10 mM），1 μL Easy Taq DNAPolymeras（5 U/μL），36 μL ddH2O。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，46 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min，16 ℃保温5 s。吸取5 μL PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若目标产物片段长度在167 bp左右则表明扩增成功。PCR扩增引物如表2所示。
分离菌株gyrB鉴定分析结果：将待鉴定菌株的gyrB基因（如SEQ ID NO：2所示）序列利用NCBI中BLAST程序及Ezbiocloud网站进行序列同源性比对，结果显示菌株同源性皆与Bacillus velezensis（贝莱斯芽孢杆菌）在99 %以上，结合菌株16S rRNA的序列结果，可将所分离筛选出来的菌株暂定为贝莱斯芽孢杆菌。
待鉴定菌株的kdgK跑胶验证结果：引物kdgK是2014年由Dunlap等基于贝莱斯芽孢杆菌核心基因组成分D-葡萄糖醛酸钠代谢基因（其他近缘物种不含有）设计的一个特异性引物，引物kdgK长度为167 bp。在特异性引物kdgK的应用上，可用于贝莱斯芽孢杆菌的鉴定。结果显示，扩增产物在167 bp处出现明亮条带。
综上可知，本发明中所筛选出来的菌株为贝莱斯芽孢杆菌，将其命名为贝莱斯芽孢杆菌Huang。
5、序列同源性比较与系统发育树的构建
将扩增成功PCR产物进行切胶回收及上机测序。将测得的序列上传至NCBI网站中用BLAST程序进行16S rRNA、gyrB序列同源性比较，判定待鉴定菌株种属。下载相关模式菌株的16S rRNA、gyrB基因序列。使用Mega5.0软件，采用邻接法（Neighbor joining，N-J）构建菌株系统发育树。
对所分离筛选的菌株进行16S rRNA系统发育树构建。由图2中的a可知，所筛选出来的菌株与模式菌株Bacillus velezensisFZB42、Bacillus velezensisCR-502(T)、Bacillus velezensis NRRL B-41580、Bacillussiamensis KCTC 13613处于同一分枝。
gyrB是目前细菌鉴定检测中常用的管家基因之一，由于gryB基因是蛋白编码基因，具有密码子兼并性，使得gyrB基因序列比对分析在细菌近缘种鉴定方面更具优势。有研究表明结合gyrB辅助鉴定能够更好地将芽孢杆菌鉴定到种。从NCBI网站中下载与贝莱斯芽孢杆菌gyrB的基因序列信息相似性接近的模式菌株构建菌株系统发育树。图2中的b为菌株进行gyrB系统发育树构建。由图2中的b可知，所筛选出来的菌株与模式菌株Bacillus velezensisBCRC 17467的亲缘关系相较于其他菌株来说更近，聚集为独立分支，且与解淀粉芽孢杆菌处于同一操作组中“operational group B. amyloliquefaciens”（公开于KimM, Oh H, Park S, et al. Towards a taxonomic coherence between averagenucleotide identity and 16S rRNA gene sequence similarity for speciesdemarcation of prokaryotes[J]. International Journal of Systematic andEvolutionary Microbiology, 2014, 64(5): 1825），结合上文16S rRNA系统发育树构建结果可得，本发明所筛选出来的菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
从酒样中分离纯化的菌株菌落呈乳白不透明圆状；在显微镜下，所筛选的菌株菌体呈杆状，单个或成对排列。经革兰氏染色、生理生化试验、16S rRNA、gyrB序列信息比对、菌株系统发育树构建等手段鉴定，再辅以kdgK跑胶验证后，共鉴定出该菌株为贝莱斯芽孢杆菌。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）对乙醇耐受性的检测
1、不同乙醇浓度下生长情况
（1）种子液的制备
将保藏于-80 ℃的贝莱斯芽孢杆菌Huang进行温度梯度解冻，吸取0.4 mL保菌管内的菌液于20 mL的LB液体培养基中，置于37 ℃、160 r/min摇床培养12 h得到种子液。
（2）对不同乙醇浓度的耐受性
将步骤（1）制备得到的种子液按照3 %（v/v）的接种量，分别接种至含有不同乙醇浓度LB液体培养基中，置于37 ℃、160 r/min恒温摇床中培养，间隔2 h~4 h测定其OD600nm值，并以培养时间为横坐标、OD600nm值为纵坐标绘制生长曲线。不同乙醇浓度下菌株生长情况如表3~4及图3所示。结果显示，菌株能在0 %~8 %乙醇浓度下继续生长。
表3：菌株在0 %和6 %乙醇浓度下的生长情况
时间（h） 0 %乙醇浓度 （OD600nm） 6 %乙醇浓度（OD600nm）
0 0.054±0.001l 0.046±0.001m
2 1.132±0.016k 0.075±0.002m
4 1.662±0.008j 0.114±0.005lm
6 2.232±0.08i 0.176±0.003l
8 2.440±0.026h 0.336±0.007k
10 2.650±0.043g 0.678±0.011j
12 2.961±0.106f 1.534±0.005i
14 3.157±0.009e 2.280±0.023h
16 3.522±0.144d 2.664±0.006g
18 3.713±0.064c 2.968±0.032f
20 3.813±0.077c 3.368±0.061e
22 4.386±0.078b 3.773±0.007d
24 4.666±0.014a 3.901±0.036c
26 4.791±0.014a 4.461±0.117a
28 4.743±0.059a 4.267±0.059b
30 4.700±0.019a 4.530±0.061a
表4：菌株在8 %和10 %乙醇浓度下的生长情况
时间（h） 8 %乙醇浓度 （OD600nm） 10 %乙醇浓度 （OD600nm）
58 0.030±0.001h 0.045±0.003
60 0.034±0.001h 0.034±0.001
62 0.174±0.001g 0.039±0.005
64 0.388±0.011f 0.036±0.002
68 2.604±0.014e 0.032±0.001
72 3.396±0.018d 0.042±0.001
74 4.018±0.003c 0.031±0.001
76 4.454±0.019b 0.034±0.002
80 4.923±0.021a 0.037±0.001
84 4.965±0.048a 0.035±0.005
（3）对无水乙醇的耐受性
将步骤（1）制备得到的种子液按照3 %（v/v）的接种量，置于无水乙醇中，于37 ℃、160 r/min恒温摇床中培养，2 h后进行LB平板涂布。结果如图4所示。
结果显示，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang在无水乙醇中培养2 h仍能存活。
2、不同乙醇浓度下营养体存活情况及芽孢生成情况
（1）菌株的活化
将保藏于-80 ℃的贝莱斯芽孢杆菌Huang进行温度梯度解冻，吸取0.4 mL保菌管内的菌液于20 mL的LB液体培养基中，置于37 ℃、160 r/min摇床培养12 h得到一代种子液；
吸取3 mL一代种子液置于100 mL灭菌的LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min摇床，培养至OD值为0.6~0.8得到二代种子液，即得到贝莱斯芽孢杆菌Huang菌液，可用于后续实验。
（2）耐受性的检测
1）0%乙醇浓度耐受性检测：
将步骤（1）活化两代后得到的种子液，以3 %（v/v）的接种量，接种至含有0 %乙醇（不含乙醇）浓度的LB培养基中，置于160 r/min、37 ℃摇床培养，并分别于对数期：培养4h、8 h、12 h，稳定期：培养26 h、30 h、34 h取样；
分别将上述样品涂布于LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱培养8 h~12 h后计数，得到菌株在不同乙醇浓度下各阶段存活情况，结果如图5所示。
2）6%乙醇浓度耐受性检测：
将步骤（1）活化两代后得到的种子液，以3 %（v/v）的接种量，接种至含有6%的乙醇浓度的LB培养基中，置于160 r/min、37 ℃摇床培养，并分别于延滞期：培养4 h，对数期：培养8 h、12 h，稳定期：培养26 h、30 h、34 h取样；
分别将上述样品涂布于LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱培养8 h~12 h后计数，得到菌株在不同乙醇浓度下各阶段存活情况，结果如图5所示。
3）8%乙醇浓度耐受性检测：
将步骤（1）活化两代后得到的种子液，以3 %（v/v）的接种量，接种至含有8%的乙醇浓度的LB培养基中，置于160 r/min、37 ℃摇床培养，并分别于延滞期：培养24 h、36 h、48h，对数期：培养64 h、68 h，稳定期：培养82 h取样；
分别将上述样品涂布于LB固体培养基，置于37℃恒温培养箱培养8 h~12 h后计数，得到菌株在不同乙醇浓度下各阶段存活情况，结果如图5所示。
（3）具体实施方式同步骤（2），区别在于：
分别于延滞期、对数期、稳定期取样后，将样品置于80 ℃水浴15 min（参考文献：1. Thurlow C M, Williams M A, Carrias A, et al. Bacillus velezensis AP193exerts probiotic effects in channel catfish (Ictalurus punctatus) and reducesaquaculture pond eutrophication[J]. Aquaculture, 2019, 503: 347-356； 2. 林陈强, 谢廼鸿, 邱宏端, 等. 地衣芽孢杆菌CHB6高芽孢形成率发酵条件的研究[J]. 热带作物学报, 2011, 32(09): 1746-1749.）；
得到芽孢悬液后涂布、培养、计数，得到菌株在不同乙醇浓度下各阶段芽孢生长情况。
结果显示，在正常培养条件（0%）下，菌株存活量随时间的增加而增加，至稳定期前期达最大值，而后略有下降，其芽孢在对数生长期开始形成，随着营养物质的消耗，生成量逐渐增多，在稳定期达到最大芽孢数；
在6%乙醇胁迫下，菌株存活量随时间增加而增加，总体菌株存活量与正常培养条件下相比略有下降，其芽孢生成量远低于正常培养；
在8%乙醇胁迫下，延滞期菌株存活量逐渐下降，到对数期后又重新上升，整个生长过程中其芽孢数均处于较低水平。由结果可得，不同乙醇浓度胁迫下，菌株主要是以营养体形式存活，芽孢形式仅占少数，且胁迫条件下的芽孢生成量远低于正常环境下的生成量。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）代谢产物检测
（1）菌株的活化
将保藏于-80 ℃的贝莱斯芽孢杆菌Huang进行温度梯度解冻，吸取0.4 mL保菌管内的菌液于20 mL的LB液体培养基中，置于37 ℃、160 r/min摇床培养12 h得到一代种子液；
吸取3 mL一代种子液置于100 mL灭菌的LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min摇床，培养至OD值为0.6~0.8得到二代种子液。
（2）吸取3 mL步骤（1）得到的二代种子液置于100 mL灭菌LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min摇床培养，于第三代稳定期（即培养42 h时）进行取样：
将培养液摇匀，快速从培养瓶中取出一定量的培养液，4 ℃条件下离心（1000 g，10 min），去除菌体，保留发酵液；移取500 μL至新的离心管中，迅速放入液氮中淬灭30 s；淬灭后放入-80 ℃中保存，而后对其进行代谢物的提取与检测。
对得到的代谢物种类及含量进行整理，结果如图6A~B所示，该菌能产多种氨基酸、有机酸、脂肪酸、核苷酸及生物碱等，其中氨基酸及多肽是主要的代谢产物，其种类及含量在所有代谢物中占比最大，种类数量达182种，含量占所有代谢物的25.45 %。
实施例5：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）降解碳水化合物及有机氮的酶活测定
具体步骤如下：
将贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）Huang菌株活化两代：
将保藏于-80 ℃的贝莱斯芽孢杆菌Huang进行温度梯度解冻，吸取0.4 mL保菌管内的菌液于20 mL的LB液体培养基中，置于37 ℃、160 r/min摇床培养12 h得到一代种子液；
吸取3 mL一代种子液置于100 mL灭菌的LB液体培养基中，37 ℃、160 r/min摇床，培养至OD值为0.6~0.8得到二代种子液。
以2 %（v/v）接种量将二代种子液接种至产酶发酵培养基，37 ℃、160 r/min分别发酵培养12 h、24 h、36 h、48 h、60 h后，将菌液于8000 r/min、4 ℃条件下离心发酵液15min，取上清液即为粗酶液。
1、检测上述粗酶液中的纤维素酶的酶活
结果如图7所示，羧甲基纤维素（CMCase）酶活在各个时间段均大于150 U/mL，其中36 h的酶活最高，该时间的羧甲基纤维素酶活达185 U/mL，滤纸酶（FPase）酶活达近60 U/mL。
2、蛋白酶活力测定
结果如表5所示。
表5：菌株蛋白酶活力
时间 酶活（U/mL）
24 h 28.487 ± 0.793
48 h 23.457 ± 0.515
72 h 17.165 ± 1.308
96 h 17.145 ± 0.700
实施例6：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）作为强化菌剂在糯米酒酿造中的应用
称取一定量的市售糯米于烧杯中，用水清洗净后浸泡22 h；将浸泡的糯米于电磁炉上进行蒸饭，先1200 W蒸至冒汽，切换至800 W蒸45 min，至糯米熟而不烂；将蒸饭后的糯米转移至500 mL锥形瓶中，按米水比（w/v）1：3加入去离子水；按照原料的10 %、5 %和1 %分别添加麦曲粉、活化后黄酒酵母和贝莱斯芽孢杆菌Huang；用八层灭菌纱布将其封口，置于30 ℃培养箱中前发酵3天，16 ℃后酵10天得到发酵糯米酒。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 佛山科学技术学院
<120> 一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌Huang及其应用
<130> BAA220430A
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1451
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggcgggtg ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180
cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240
caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300
gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360
gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420
acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480
ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540
taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600
ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660
gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720
tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780
cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840
ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960
cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020
ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260
ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380
ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa 1440
gtgaccaaag g 1451
<210> 2
<211> 1189
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tccatgcagc ggatatgagt ataccggcgg tcattcactt gcagtagggg cgtccgtcgt 60
aaacgccttg tcgaccactc ttgacgttac ggttcatcgt gacgggaaaa tccactatca 120
ggcgtacgag cgcggtgtac ctgtggctga tcttgaagtg atcggcgaaa ctgataagac 180
cggaacgatt acgcacttcg ttccggatcc ggaaattttc aaagaaacaa ccgtatatga 240
ctatgatctg ctttcaaacc gtgtccggga attggccttc ctgacaaaag gcgtaaacat 300
cacgattgaa gacaaacgtg aaggacaaga acggaaaaac gagtaccact acgaaggcgg 360
aatcaaaagc tatgttgagt acttaaaccg ttccaaagaa gtcgttcatg aagagccgat 420
ttatatcgaa ggcgagaaag acggcataac ggttgaagtt gcattgcaat acaacgacag 480
ctatacaagc aatatttatt ctttcacaaa taatatcaac acatacgaag gcggcacgca 540
cgaggccgga tttaaaaccg gtctgacccg tgtcataaac gactatgcaa gaagaaaagg 600
gattttcaaa gaaaatgatc cgaatttaag cggggatgat gtgagagaag ggctgactgc 660
cattatttca attaagcacc ctgatccgca attcgaaggg cagacgaaaa ccaagctcgg 720
caactccgaa gcgagaacga tcactgatac gctgttttct tctgcgctgg aaacattcct 780
tcttgaaaat ccggactcag cccgcaaaat cgttgaaaaa ggtttaatgg ccgcaagagc 840
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ttttaatctg aaaaagcgcg ttatccgcag tcatggaact ggagatcta 1189

Claims (10)

1.一株耐乙醇的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.23761，保藏日期为2021年11月08日。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，或含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的发酵液，或含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的冻干粉。
3.如权利要求2所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂中，所述贝莱斯芽孢杆菌的含量不少于：1×105 CFU/mL。
4.一种产品，其特征在于，所述产品中含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2或3所述的微生物菌剂。
5.如权利要求4所述的产品，其特征在于，所述产品中，所述贝莱斯芽孢杆菌的含量不少于：1×105 CFU/mL。
6.如权利要求4或5所述的产品，其特征在于，所述产品为化学品。
7.如权利要求6所述的产品，其特征在于，所述化学品包括但不限于窖泥强化剂、饲料添加剂、大曲强化剂。
8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2或3所述的微生物菌剂在强化窖泥或酿酒中的应用。
9.一种功能性强化菌剂的制备方法，其特征在于，所述方法为向制曲的原料中添加权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌或权利要求2或3所述的微生物菌剂，发酵制备得到。
10.一种生产白酒的方法，其特征在于，在白酒发酵过程中添加权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌，或权利要求2或3所述的微生物菌剂。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116286557B (zh) * 2023-05-09 2024-01-23 佛山科学技术学院 一株产纤维素酶的耐盐贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112725218A (zh) * 2020-12-02 2021-04-30 四川省新兰月生物科技有限公司 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN113832083A (zh) * 2021-11-17 2021-12-24 千禾味业食品股份有限公司 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用
WO2022042121A1 (zh) * 2020-08-28 2022-03-03 山东省果树研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法与应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111235067B (zh) * 2020-03-16 2021-10-01 河南仰韶酒业有限公司 一种白酒强化大曲及其制备方法和应用
WO2021226094A1 (en) * 2020-05-06 2021-11-11 Ramot At Tel-Aviv University Ltd. Process for conversion of cellulose recycling or waste material to ethanol, nanocellulose and biosorbent material
CN112111428B (zh) * 2020-09-26 2022-08-09 华中农业大学 一种人工诱变得到的热葡糖苷酶地芽孢杆菌及在纤维素降解中的应用
CN112251379B (zh) * 2020-10-22 2022-03-15 宜宾五粮液股份有限公司 一种耐酸产乙偶姻的贝莱斯芽孢杆菌dqa21及应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022042121A1 (zh) * 2020-08-28 2022-03-03 山东省果树研究所 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法与应用
CN112725218A (zh) * 2020-12-02 2021-04-30 四川省新兰月生物科技有限公司 一株贝莱斯芽孢杆菌及其培养方法和应用
CN113832083A (zh) * 2021-11-17 2021-12-24 千禾味业食品股份有限公司 一种贝莱斯芽孢杆菌及其在食醋酿造中的应用

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