CN117844654B - 一株产纤维素酶的绳状篮状菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一株产纤维素酶的绳状篮状菌，保藏编号为CGMCC NO.41032。本发明还提出所述的产纤维素酶的绳状篮状菌在发酵木本源蛋白饲料中的应用。该绳状篮状菌分离自饲料中，抗逆性强，可在pH4.0～9.0生长，对饲料桑、柠条等木本源植物具有较好的纤维素降解效果，可以与酿酒酵母协调发酵用于木本源蛋白饲料的生产。

Description

一株产纤维素酶的绳状篮状菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种高产纤维素酶的篮状菌及其应用。

背景技术

我国畜牧业总产值超3万亿元，占农林牧渔总产值的26.7%，是就业人口超2亿、占农牧民现金收入60%以上的大产业。畜牧业的大幅增长同时需要为动物提供更多蛋白质营养来源。使用饲料桑、杂交构树、辣木等具有区域特色的木本源植物蛋白原料来获取饲用蛋白，可以促进豆粕减量替代，提升产业竞争力。我国可用作饲料的木本源植物高达1000多种，具有蛋白质含量高（18%-26%）、生物量大、功能成分丰富等优势，开发利用新型蛋白饲料资源，形成豆粕减量替代新方案，是实现畜牧业高质量发展的重要途径。

木本源植物如饲料桑、柠条、刺槐、柞树等分布在全国各地，均具有较高的粗蛋白等营养物质，是很好的蛋白质补充料。但饲料桑等木本源植物在饲料化应用过程中，含有较高的木质纤维素，饲料消化率不高。针对这一问题，大多采用添加纤维素酶的方法（侧耳菌产生木质纤维素酶及其降解植物生物质的研究，谢君，任路，张义正，兰州大学学报(自然科学版) 2002,38(2)），但需要的成本相对较高。纤维素分解菌是一种可产生纤维素酶的微生物，其中绳状菌具有产纤维素酶的能力。因此，在发酵过程中如有产纤维素酶能力强的绳状篮状菌存在与作用，可将纤维成分降解为单糖，从而为酵母菌生长提供营养，提升饲料菌体蛋白的含量，同时也可减少木本饲料中的纤维含量，既改善发酵品质，又提高消化利用率，将会成为极为有效的生物饲料添加剂。

发明内容

针对现有技术存在的不足之处，本发明提出一株高产纤维素酶的绳状篮状菌，对木本源植物具有更好的纤维素降解效果。

本发明的第二个目的是提出所述绳状篮状菌的应用。

实现本发明上述目的的技术方案为：

一株产纤维素酶的绳状篮状菌，保藏编号为CGMCC No.41032。

所述产纤维素酶的绳状篮状菌的名称为绳状篮状菌 (Talaromyces funiculosus)，保藏于位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.41032，保藏日期为2024年01月11日。本绳状篮状菌分离自饲料中，标记为CAU-M-4.6；本绳状篮状菌抗逆性强，可在pH4.0～9.0生长，对饲料桑、柠条等木本源植物具有较好的纤维素降解效果，可以与酿酒酵母协调发酵用于木本源蛋白饲料的生产。

本发明通过羧甲基纤维素钠刚果红初筛，测定纤维素酶活力复筛筛选出一株来源于饲料的高产纤维素酶绳状篮状菌CGMCC41032。提取绳状篮状菌DNA，然后运用PCR扩增引物ITS1和ITS2，扩增出ITS基因，在NCBI上对比相关序列，确定其相似菌种。最后，将筛选出的菌株与酿酒酵母混合后分别添加到柠条或饲料桑中，发酵3天后，并与未接菌的对照组进行对比，确认可显著提高木本源植物的真蛋白含量，并降低纤维素含量。

本发明所述的产纤维素酶的绳状篮状菌在发酵木本源蛋白饲料中的应用。

所述的应用，包括操作：

(1)将待发酵的木本源植物粉碎过0.1~5mm筛网；

(2)将粉碎后的待发酵饲料按照木本源植物20~30份，碳源10~20份，氮源1~3份，营养盐液2~6份，加水混合，得到发酵原料；

(3) 向发酵饲料原料中加入所述的绳状篮状菌，进行发酵。

其中，步骤(1)中的木本源植物为柠条、饲料桑、杂交构树、辣木、刺槐、松木、杉木、芦苇、竹笋中的一种或多种。

优选地，步骤(2)中，所述碳源选自玉米面、麸皮、糖蜜、淀粉、马铃薯中的一种或多种，所述氮源选自尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐中的一种或多种。

更优选地，步骤(3)中，每kg木本源植物（接菌之前木本源植物的质量）加入菌数为（0.1~10）×10⁸cfu的菌液。

本发明的一种优选技术方案为，步骤(3)中，所述菌液为所述绳状篮状菌及酿酒酵母按菌数1：0.8~1.2配比混合得到。

其中，发酵的条件为有氧发酵，温度为25～30℃，发酵时间48～120h。

本发明的又一优选技术方案为，包括操作：

(1)将待发酵的木本源植物粉碎过1~2mm筛网；

(2)将粉碎后的待发酵饲料按照木本源植物20~30份，玉米面10~12份，麸皮或糖蜜4~8份，尿素0.5~1份，硫酸铵1~2份，营养盐液4份，水50~56份混合均匀，得到发酵原料；

(3) 向发酵原料中加入按菌数1：0.8~1.2配比混合的绳状篮状菌和酿酒酵母，25～30℃条件下进行有氧发酵。

步骤(1)中，所述木本源植物粉碎之前可先晒干。

发酵中使用酿酒酵母可采用现有的酿酒酵母，例如购自中国普通微生物菌种保藏管理中心的CGMCC 2.5325酿酒酵母。

本发明的有益效果在于：

(1)本发明提供了一株高产纤维素酶的绳状篮状菌，菌株能够有效降解木本源植物中的纤维素含量，克服了因纤维素含量高造成的木本源生物发酵饲料品质差的问题。本发明提出的绳状篮状菌的生物学特性为丝状真菌，抗逆性强，在pH4～9.0的范围均可生长。该绳状篮状菌分离自饲料中，对饲料桑、柠条等木本源植物具有较好的纤维素降解效果，可以与酿酒酵母协调发酵用于木本源蛋白饲料的生产。

(2)本发明优选利用绳状篮状菌结合酿酒酵母能够提高木本源饲料发酵品质，成本低，安全，可靠，易于利用。

(3)本发明使用的绳状篮状菌结合酿酒酵母发酵木本源植物可以提高其真蛋白含量，增加乙酸己酯等挥发性香味成分，降低饲料中的抗营养因子。

附图说明

图1为绳状篮状菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）上的形态图。

图2为绳状篮状菌刚果红染色形态图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

如无特殊说明，说明书中采用的手段均为本领域已有的技术手段。

如无特别说明，说明书中的“份”均为质量份。

实施例1 产纤维素酶丝状真菌的分离鉴定及酶活力的测定

将采集自土壤、饲料及枯枝落叶等样品，分别称取10g，加入90mL无菌水，揉捏混匀后于4 ℃冰箱中浸提3 h，吸取1mL到9mL无菌水中，依次稀释至10^-2～10^-5浓度，分别取20 μL涂至PDA固体培养基上，28 ℃有氧培养3~5d，用接种针挑取菌落不一的单菌落，再分别将单菌落在PDA固体培养基上反复划线分离，通过3代以上的步骤分离纯化菌株，将纯化的菌株接种在羧甲基纤维素钠固体培养基上，每块培养基点三次重复，28 ℃培养3d～5d。菌落长出后，使用0.1％wt的刚果红进行染色，再用1mol/L的NaCl进行脱色，菌落周围形成透明圈证明此菌分泌纤维素酶，测量透明圈直径(D)和菌落直径(d)，根据透明圈直径和菌落直径的比值(D/d)初步判断该菌株产纤维素酶能力的大小，将比值较大的菌落标记，进行复筛。

在PDA培养基上，28℃培养3天后，中心菌落簇状，其它地方丛毛状；产孢中等密到密集，分生孢子团淡灰绿；菌丝有横隔，这些特征一致于绳状篮状菌(Talaromyces funiculosus) （参见图1和图2）。

将初筛比值较大的菌株接种于察氏液体培养基中，28℃培养3d，然后取菌液0.5mL，分别以CMC-Na和滤纸条为底物，采用DNS法测定还原糖的含量计算纤维素酶活力。筛选出生产纤维素酶活力最高的菌株。

表1 菌株透明圈与菌落直径比和酶活

名称	菌落直径（mm）	透明圈直径（mm）	比例（菌落/透明圈）	酶活力（U/mmol）
					CAU-M-4.6	50	25	2	30.01
CAU-M-4.1	45	25	1.8	10.63
					CAU-M-4.2	14	9	1.5	2.86
CAU-M-4.3	15	4	3.37	1.31

从表1数据看出，菌株CAU-M-4.6产纤维素酶能力最高，因此选用此菌株进行进一步生理生化测定。

本实施例中，产纤维素酶丝状真菌的分离及用于酶活力测定菌液培养基配制的方法如下：

1）产纤维素酶丝状真菌的筛选使用羧甲基纤维素钠马铃薯葡萄糖琼脂培养基：CMC-Na 15 g/L，NH₄NO₃ 1 g/L，KH₂PO₄ 1 g/L，MgSO4•7H₂O 0.5 g /L，蛋白胨 1 g/L，琼脂10g/L，pH 7，121℃，灭菌20 min。使用含羧甲基纤维素钠的培养基，如果筛的菌能够降解纤维素则会产生透明圈。

2）察氏液体培养基(Czapek–Dox Medium)：蔗糖30.0g/L，硝酸钠3.0g/L，磷酸氢二钾1.0g/L，硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.5g/L，氯化钾0.5g/L，硫酸亚铁0.01g/L，蒸馏水定容至1000mL， pH调至7.0～7.2。

分离纯化的菌株在5mL的马铃薯葡萄糖肉汤培养基中28℃于180rpm的转速振荡培养2 d，菌液移入1.5mL的离心管中，10000rpm离心3min～5min收集菌，用TE(10mmol/LTris–HCl、0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)清洗两次，提取菌株全长基因，然后运用PCR扩增引物ITS1和ITS2，扩增出ITSrDNA基因，送至博迈德基因(中国)测序，在NCBI基因库上对比相关序列，序列如序列表所示，确定CAU-M-4.6为绳状篮状菌。

实施例2：添加到柠条中的发酵效果

本实施例试验了CAU-M-4.6绳状篮状菌添加到柠条中的发酵效果。发酵原料里除需要木本源植物，还需要碳源、氮源和营养盐液。基于木本源植物20~30份，碳源10~20份，氮源1~3份，营养盐液2~6份的基础配方，通过响应面优化，确定了质量份成分为：木本源植物20~30份，玉米面10~12份，麸皮或糖蜜4~8份，尿素0.5~1份，硫酸铵1~2份，营养盐液4份，水50~56份混合均匀，得到发酵原料。

本实施例中，以柠条为材料进行了有氧发酵试验。将材料晒干、粉碎过1mm筛，按照粉碎后的柠条20份，玉米面 12份，麸皮8份，尿素0.5份，硫酸铵2份，营养盐液4份，蒸馏水53.5份混合均匀，得到发酵原料；发酵的条件为25～30℃，有氧发酵；

处理分别为对照、添加绳状篮状菌、添加酿酒酵母（保藏号CGMCC 2.5325）和添加混合菌液(绳状篮状菌和酿酒酵母按菌数1：1配比混合得到)，对照添加等量无菌水。每kg新鲜材料分别加入菌数约1.0×10⁸cfu的菌液，每个处理3个重复。采用容积为1L的三角瓶进行发酵，发酵3d后测定其真蛋白和纤维素含量。

结果如下：添加绳状篮状菌的真蛋白含量为6.9%，添加酿酒酵母的真蛋白含量为6.5%，均显著高于对照5.9%，。两种菌混合添加，真蛋白含量提高到11.8%，且纤维素含量显著低于对照（对照组纤维素含量39.71%，发酵后纤维素含量32.96%）。因此，添加绳状篮状菌配合酿酒酵母能够显著提高柠条的真蛋白含量，并降低其纤维素含量。

营养成分及青贮发酵指标测定方法：

1)柠条营养成分测定：粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定(定氮仪KN680，ALVA仪器有限公司)，纤维素含量采用范氏纤维洗涤法测定。

实施例3：添加到饲料桑中的发酵效果

以饲料桑为材料进行了好氧发酵试验。将材料粉碎过1mm筛，按照饲料桑30份，玉米面4份，麸皮4份，尿素1份，硫酸铵1份，营养盐液4份，蒸馏水56份混合均匀，处理分别为对照和添加混合菌液（绳状篮状菌和酿酒酵母按菌数1：1配比混合得到），对照添加等量无菌水。每kg新鲜材料分别加入菌数约1.0×10⁸cfu的菌液，每个处理3个重复。采用30×40cm的托盘进行发酵，发酵3d后测定其真蛋白和粗纤维含量。

结果如下：未发酵饲料桑的粗蛋白含量为17.84%，真蛋白含量为13.82%，纤维素含量为11.73%，添加绳状篮状菌和酿酒酵母的饲料桑粗蛋白含量为23.98%，真蛋白含量为16.36%，纤维素含量为9.98%。因此，添加绳状篮状菌配合酿酒酵母能够显著提高饲料桑的蛋白含量，并降低其粗纤维含量。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一株产纤维素酶的绳状篮状菌（Talaromyces funiculosus），其特征在于，保藏编号为CGMCC No.41032，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏日期为2024年01月11日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

2.权利要求1所述的产纤维素酶的绳状篮状菌在发酵木本源蛋白饲料中的应用，其特征在于，所述的应用包括操作：

(1)将待发酵的木本源植物粉碎过0.1~5mm筛网；所述木本源植物为柠条、饲料桑中的一种或多种；

(2)将粉碎后的待发酵饲料按照木本源植物20~30份，碳源10~20份，氮源1~3份，营养盐液2~6份，加水混合，得到发酵原料；

(3) 向发酵饲料原料中加入如权利要求1所述的绳状篮状菌，进行发酵。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述碳源选自玉米面、麸皮、糖蜜、淀粉、马铃薯中的一种或多种，所述氮源选自尿素、硫酸铵、氨水、硝酸盐中的一种或多种。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，每kg木本源植物加入菌数为（0.1~10）×10⁸cfu的菌液。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述菌液为所述绳状篮状菌及酿酒酵母按菌数1：0.8~1.2配比混合得到。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，发酵的条件为发酵的条件为有氧发酵，温度25～30℃，发酵时间48～120h。

7.根据权利要求2~6任一项所述的应用，其特征在于，包括操作：

(1)将待发酵的木本源植物粉碎过1~2mm筛网；

(2)将粉碎后的待发酵饲料按照木本源植物20~30份，玉米面10~12份，麸皮或糖蜜4~8份，尿素0.5~1份，硫酸铵1~2份，营养盐液4份，水50~56份混合均匀，得到发酵原料；

(3) 向发酵原料中加入按菌数1：0.8~1.2配比混合的绳状篮状菌和酿酒酵母，25～30℃条件下进行有氧发酵。