CN110129211B - 一株耐高温的烟曲霉菌株23#及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株耐高温的烟曲霉菌株Aspergillus fumigatus 23#，保藏编号：CGMCC No.17190。该菌株的生长温度为28～50℃。一种纤维素粗酶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，将烟曲霉23#接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子；所述增殖培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h；且摇床培养的转速为180～200r/min；步骤2，将步骤2获得的所述种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得纤维素粗酶液；所述发酵培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h。本发明的烟曲霉23#生长能力强，具有很强的产孢能力，且耐50℃高温。

Description

一株耐高温的烟曲霉菌株23#及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种耐高温的烟曲霉菌株23#及其应用。
背景技术
我国作为农业大国，每年作物秸秆量巨大，主要是纤维素(多糖类大分子物质)、半纤维素，少量遗漏的籽实中还有蛋白质，然而纤维素的结构复杂，很难被降解。一般的降解方式主要有机械降解、水解、热降解、氧化降解、光化学降解及酶(生物)降解等。但前几种方法有成本高、降解条件繁琐及易造成环境污染等缺点，而生物降解方法主要是应用纤维素酶来催化降解纤维素，因其高度的专一性和低成本成为了目前主要关注的一种手段。
因此，通过生物降解方法促使秸秆降解还田能够生物资源再利用，又解决胡乱丢弃或田间焚烧造成环境污染的巨大浪费。秸秆腐熟剂不仅能够减少秸秆无控焚烧带来的恶劣雾霾天气，还能使秸秆等有机废弃物快速腐熟，使秸秆中所含的有机质及磷、钾等元素成为植物生长所需的营养，并产生大量有益微生物，刺激作物生产，提高土壤有机质，增强植物抗逆性，减少化肥使用量，改善作物品质，实现农业的可持续发展。
目前，生物降解方法包括直接采用纤维素酶进行降解，或采用产或采用产纤维素酶的细菌或真菌进行发酵降解等。直接采用纤维素酶对纤维素进行降解需要对纤维素酶进行分离提纯，工艺繁琐，成本较高，因此采用具有产纤维素酶功能的细菌和真菌对纤维素进行发酵降解是较为经济有效的途径。产纤维素酶的细菌或真菌通常从自然界中分离纯化而来或经人工诱变获得。其中包括中国专利《一种黑曲霉菌株及其应用》CN 103305428 B，通过2×1016cm-2剂量离子束诱变和395Gy剂量60钴诱变，经初筛培养基初筛、产酶培养基复筛、遗传稳定实验后，得到了一种高产木聚糖酶的黑曲霉菌株。授权专利《一株烟曲霉菌株Bfum-5及其用途》CN 105002098 B，从土壤中分离纯化，经特定培养基筛出一株具有很强降解纤维素能力的烟曲霉菌株。由于该烟曲霉菌株在35℃下生长良好，50℃下必须保证其水分和菌活力的情况下，其降解能力才能有所保存，因此可以说明该菌株不耐高温。
由此可见，本领域有待进一步地发掘出更多的新菌株应用于纤维素降解，从而促进秸秆腐熟进程。
发明内容
本发明的目的是提供了一种烟曲霉菌株，该菌株具备生长速度快，产孢能力强，耐高温的能力，可用于分解纤维素。
本发明另一个目的是提供了一种该烟曲霉菌株在促进秸秆腐熟中的应用，在缩短秸秆腐熟时间，提高腐熟效果上有显著作用。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种烟曲霉菌株23#，其筛选过程如下：
1)利用初筛培养基从河北沧州黄瓜根际土壤中分离的曲霉，经形态学和分子生物学鉴定，确认为烟曲霉。
2)经初筛培养基初筛、产酶培养基复筛、遗传稳定实验后，得到了一种高产纤维素酶的烟曲霉菌株，并命名为烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#。该菌株已进行保藏，保藏单位名称：中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2019年3月20日，保藏编号：CGMCC NO.17190。
该烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#具有很好的生长特性，在37℃培养基中培养，孢子数大于20×108 CFU/g，可以耐50℃高温，符合微生物腐熟秸秆的温度条件。
上述技术方案中所述初筛培养基组成为以下重量份数：葡萄糖10～20份，马铃薯200～300份，琼脂15～20份，蒸馏水1000～1200份，pH值自然，所述斜面培养基配置好后于120～130℃,灭菌15～30min。
上述技术方案中所述产酶培养基为以下重量份数：麸皮34～36份，硫酸铵1.8～2.0份，MgSO4·7H2O0.4～0.5份，蛋白胨1.2～1.5份，FeSO4·7H2O0.008～0.01份，葡萄糖20份，pH5.45～5.55,蒸馏水1000～1200份，配制好后于120～130℃，灭菌15～30min。
一种纤维素粗酶液的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，将烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子；所述增殖培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h；且摇床培养的转速为180～200r/min；
步骤2，将步骤2获得的所述种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得纤维素粗酶液；所述发酵培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h。
上述技术方案中，步骤1中，所述增殖培养的所述斜面培养基的组成为以下重量份数：葡萄糖10～20份，马铃薯200～300份，琼脂15～20份，蒸馏水1000～1200份，pH值自然，所述斜面培养基配置好后于120～130℃,灭菌15～30min，划线接入烟曲霉Aspergillusfumigatus 23#进行增殖培养。
上述技术方案中，所述步骤2中，所述产酶培养基成分为以下重量份数：麸皮34～36份，硫酸铵1.8～2.0份，MgSO4·7H2O0.4～0.5份，蛋白胨1.2～1.5份，FeSO4·7H2O0.008～0.01份，葡萄糖20份，蒸馏水1000～1200份，pH5.45～5.55，配置好后于120～130℃,灭菌15～30min。
一种烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#在秸秆腐熟过程中的应用。
一种上述技术方案制备的纤维素粗酶液在秸秆腐熟过程中的应用。
一种烟曲霉菌干粉，采用上述技术方案制备的纤维素粗酶液，经过喷雾干燥获得的干粉菌剂。
本发明的优点和有益效果为：
1)本发明的烟曲霉23#生长能力强，具有很强的产孢能力，且耐50℃高温，与其他现有专利相比，有较强的优势，高温反而可以加快其生长，符合微生物腐熟秸秆的温度条件。
2)本发明的烟曲霉23#具有高产纤维素酶的能力，且培养时间和发酵时间与现有技术相比有很大程度的提高，高温下摇培时间大大缩短。
本发明的烟曲霉23#可以明显加快秸秆腐熟进程，加速秸秆纤维素的分解，提高土壤中养分的含量，以利于植物充分利用吸收，提高植株出芽率。因此该烟曲霉菌株在降低秸秆腐熟剂产品成本，促进腐熟进程中有着重要作用，有着巨大的商业前景和发展潜力。
附图说明
图1为一种烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#在马铃薯葡萄糖琼脂培养基菌落形态示意图。
图2为一种烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#产孢曲线示意图。
图3为一种烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#平板透明圈测定结果；
其中a为对照组，b为烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#，c为其他烟曲霉菌株30#。
图4为一种烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#耐高温测定结果；
其中a为32摄氏度，b为45摄氏度，c为50摄氏度。。
图5为一种烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#在秸秆腐熟效果对比示意图；
其中a为处理前的秸秆，b为第三天秸秆腐熟效果，c为第7～10天时秸秆腐熟效果，d为20天时秸秆腐熟效果，e为30天时秸秆腐熟效果。
对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，可以根据以上附图获得其他的相关附图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明，下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例一
一种烟曲霉菌株23#，其筛选过程如下:
1)土壤采集：本试验对河北沧州地区的发病的黄瓜根际土壤进行了采集，采集土样于4℃保存，为筛选土壤真菌备用。
2)土壤真菌分离纯化：①取5g土壤加入1％的生理盐水中，分别形成为1∶102、1∶103、1∶104、1∶105和1∶106土壤稀释液，充分震荡后，吸取上述不同稀释度的土壤稀释液各100μL分别涂布于含有氨苄青霉素的PDA固体培养基上，然后将PDA固体培养基均置于28℃下培养2～3天。②经过培养后，挑选出典型的真菌菌落在PDA固体培养基上继续进行纯培养。
3)菌株鉴定：①用CTAB法提取真菌DNA。采用北京索拉宝公司提供的真菌基因组提取试剂盒提取菌株TJ的基因组DNA；②选用真菌ITS基因序列进行PCR扩增③PCR所得产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，送至生工生物工程股份有限公司进行测序。④将拼接序列使用NCBI BLAST进行比对，得到对应的真菌，其与GenBank:KM268635.1的Aspergillusfumigatus烟曲霉菌株识别度为100％，故确定该菌株为烟曲霉菌株，并构建系统发育树。
4)经初筛培养基初筛和产酶培养基复筛，从中各挑选一株酶活最高、生长性能优良的菌株，保存至PDA斜面上。
5)经PDA斜面37℃培养5天，挑取孢子，用无菌水制成107cfu/mL孢子菌悬液。
6)利用初筛培养基初筛，产酶培养基复筛，经过遗传稳定实验，得到一种高产纤维素酶的烟曲霉，命名为烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2019年3月20日，保藏编号：CGMCC No.17190。
该菌落形态见图1。
所述的初筛培养基为葡萄糖20.0g，马铃薯200g，琼脂16g，蒸馏水1000mL，pH值自然，所述斜面培养基配置好后于121℃灭菌20min，划线接入烟曲霉23#进行培养。
所述的产酶培养基的组成以1L培养基计为：麸皮35g，硫酸铵2.0g，MgSO4·7H2O0.4g，蛋白胨1.5g，FeSO4·7H2O0.01g，葡萄糖20g，pH5.55。
实施例二
烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#的培养方法，其步骤如下：
将烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#孢子粉按1％(重量比)接种于产酶培养基上，37℃下培养，48小时候后培养结束。用血球计数板测定孢子数，孢子数大于20×108CFU/g。该菌株从培养12h后孢子数迅速增加，孢子数高达3×108CFU/g，在16h～40h内缓慢增加，40-48h趋于平缓，直至48h达到最大值，孢子数大于20×108CFU/g，48h后孢子数浓度下降。这与一般的烟曲霉菌株相比产孢速度明显加快(1×108CFU/g)。(孢子数曲线见图2)。
实施例三
将烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#与本实验室分离得到其他烟曲霉菌株30#分别接种在鉴别产酶分解纤维素培养基上，培养3天。注意不要污染，保存好以后待用。待菌落长好以后，打开盖子平面摊开摆在桌面上，用移液枪吸取5mL0.1％刚果红溶液至每个平板上，缓慢转动至刚果红溶液均匀覆盖平板表面，静置染色30min，倒掉多余液体；再用移液枪吸取3mL1mol/L NaCl洗脱液至每个平板上，缓慢转动至均匀覆盖平板表面，静置脱色1h，洗脱处理20min，在加入3ml5％醋酸钠溶液固定处理10min后，倒掉多余液体。观察透明圈与菌种的大小对比情况(平板透明圈结果见图3)图3中a图代表对照组，即没有任何菌株生长的培养基平板，处理方法同23#菌株，图b代表23#菌株分解纤维素所产生的透明圈，图c代表30#菌株分解纤维素所产生的透明圈，透明圈的大小代表其分解能力的大小。结果见表1。从表1中可以看出，23#菌株所产生的透明圈直径大于30#菌株所产生的透明圈直径，因此其分解纤维素的能力大于30#烟曲霉菌株的分解能力，因此说明23#菌株具有高产分解纤维素酶的能力。30#为本课题组分离筛选的另一种纤维素分解菌，虽然实验数据列在本文中，但是却不是实现本发明的必须内容或者材料，因此在本文中不做描述。
表1真菌在纤维素酶鉴别培养基中产生的透明圈直径(cm)
处理 透明圈直径平均值(cm)
23# 2.10
30# 1.60
所述的鉴别产酶分解纤维素培养基的组成蛋白胨10份，酵母粉10份，羟甲基纤维素钠10份，NaCl5份，KH2PO4 1份，琼脂18份，蒸馏水1000份，pH为7.0，121℃下灭菌20min。
实施例四
一种烟曲霉菌株Aspergillus fumigatus 23#耐高温实验，其实施步骤如下：
用打孔器从PDA培养基上重新转接烟曲霉菌株Aspergillus fumigatus 23#，放置32℃、45℃和50℃真菌培养箱中培养，每个真菌设置三个重复对照实验，7d内观察并记录生长情况，第7d进行拍摄记录长情况。结果表明，该菌株在32℃、45℃和50℃均可以生长，产生绿色菌丝孢子，并长满平板，最高可以耐50℃高温，且菌株形态不发生任何改变，符合微生物腐熟秸秆的温度条件(结果见图4)。
实施例五
一种烟曲霉菌株Aspergillus fumigatus 23#在促进腐熟进程中的应用，其应用步骤如下：
步骤1，将烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子；所述增殖培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h；且摇床培养的转速为180～200r/min；所述增殖培养的所述斜面培养基的组成为以下重量份数：葡萄糖20g，马铃薯200g，琼脂16g，蒸馏水1000ml，pH值自然，所述斜面培养基配置好后于120～130℃,灭菌15～30min，划线接入烟曲霉Aspergillus fumigatus 23#进行增殖培养。
步骤2，将步骤2获得的所述种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液用8层无菌纱布过滤获得纤维素粗酶液；所述发酵培养的温度为37℃，培养时间为48h，所述产酶培养基成分为以下重量份数：麸皮36g，硫酸铵1.8g，MgSO4·7H2O0.5g，蛋白胨1.2g，FeSO4·7H2O0.008g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，pH5.45，配置好后于120～130℃,灭菌15～30min。
选取粗细与长度接近的完整玉米秸秆，将其截成3-5cm小段。称取50g左右秸秆小段放入40目尼龙袋中，试验所需秸秆样品若干袋进行编号，将编号后样品置85℃下，烘干处理6h，准确称重并记录每袋重量N0。将上述秸秆样品取出放入方形玻璃器皿中，倒入上述所得粗酶液，同时设置清水(CK)对照组。放在恒温恒湿人工气候培养箱内，温度设置为50℃、湿度为70％，密封保存，分别在试验的10d、20d、30d取出处理样品，样品取出后，放置85℃烘箱中烘干6h，准确称重并记录每袋重量NX。分别按任一腐解时间(10、20、30d)计算秸秆失重率，公式如下：WX＝100(N0-NX)/N0，计算结果保留3位小数。秸秆失重率结果具体见表2(其中表2中的a，b代表有显著性差异)。从表2可以看出，经过23#菌株处理的秸秆其失重率远远显著高于喷施水的对照组秸秆的失重率，第10d的时候处理组比对照组失重率高出3.575％，第20d的时候失重率高出11.302％，第30d的时候失重率比高出12.394％，说明经过23#菌株处理的秸秆可以极大的提高秸秆的失重率，从而明显加快秸秆的腐熟进程，效果显著。
另外选取粗细与长度接近的完整玉米秸秆，将其截成3-5cm小段，用上述所得粗酶液喷施秸秆，同时设置清水为对照组，常温条件下放置30天。试验发现，处理前玉米秸秆外观颜色都为青色(如图5a)。试验进行第3d可以看到明显的菌丝生长在秸秆的表面(如图5b)，7～10d秸秆明显变软颜色变深，为黄褐色(如图5c)，而空白对照为浅黄色；20d后秸秆数量变少、部分秸秆被腐熟为褐色液体并产生腐烂气味(如图5d)。30d后，接种菌剂处理的秸秆颜色变为黑色(如图5e)，而空白对照为褐色。在相同时间内，接菌剂和未处理的秸秆颜色存在变化差异，接种菌剂的秸秆颜色变化比对照组明显加快，外观颜色变化为青色→黄褐色→褐色→深褐色→灰黑色，其秸秆残留率59.96％，而对照组外观颜色变化为青色→黄色→浅黄色→黄褐色→褐色，其秸秆残留率87.64％，且与对照组相比，秸秆残留率降低了27.68％。(对秸秆的失重率及腐熟结果见图5)。
表2秸秆的失重率
Figure BDA0002067111300000071
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一株耐高温的烟曲霉菌株(Aspergillus fumigatus)23#，保藏编号：CGMCCNo.17190。
2.一种纤维素粗酶液的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1，将烟曲霉(Aspergillus fumigatus)23#接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子；所述增殖培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h；且摇床培养的转速为180～200r/min；
步骤2，将步骤2获得的所述种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得纤维素粗酶液；所述发酵培养的温度为28～37℃，培养时间为48～96h；
所述步骤1中，所述增殖培养的所述斜面培养基的组成为以下重量份数：葡萄糖10～20份，马铃薯200～300份，琼脂15～20份，蒸馏水1000～1200份，所述斜面培养基配置好后于120～130℃,灭菌15～30min，划线接入烟曲霉(Aspergillus fumigatus)23#进行增殖培养；
所述步骤2中，所述产酶培养基成分为以下重量份数：麸皮34～36份，硫酸铵1.8～2.0份，MgSO4·7H2O 0.4～0.5份，蛋白胨1.2～1.5份，FeSO4·7H2O 0.008～0.01份，葡萄糖20份，蒸馏水1000～1200份，pH 5.45～5.55，配置好后于120～130℃,灭菌15～30min；
所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)23#，保藏编号：CGMCC No.17190。
3.一种烟曲霉(Aspergillus fumigatus)23#在秸秆腐熟过程中的应用；所述烟曲霉(Aspergillus fumigatus)23#，保藏编号：CGMCC No.17190。
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